专利名称：检测呋喃它酮代谢物的化学发光试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测呋喃它酮代谢物(AMOZ)残留量的化学发光试剂盒(CLEIA)，特别是检测畜禽组织(肌肉、肝脏)和水产品AMOZ残留量的CLEIA试剂盒。
技术背景 呋喃它酮属于硝基呋喃类抗菌药，在临床上主要用于鸡白痢、鸡大肠杆菌病、鸡球虫病等各种肠道感染性疾病的治疗及用作猪、禽类和水产促生长的添加剂。但有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症。欧盟早在1990年就颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢物列为A类禁用药，规定其在动物源性食品中的最高残留量为l.Oyg/kg。1995年起欧盟、日本、美国等开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼、虾及禽类进行残留检测。中国农业部2002年2月发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中，明文禁止在所有食品动物的所有用途中使用硝基呋喃类药物。但是，由于其价格便宜，药效好，在很多国家还在继续违规使用。为了保障人民健康及扩大与世界各国动物源性食品贸易往来，必须对动物源性食品中呋喃它酮进行检测。由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物(AMOZ)则能存留较长的一段时间，所以药残监测部门经常以检测其代谢产物-AMOZ为手段达到检测呋喃唑酮残留的目的。目前，呋喃它酮检测方法主要有微生物法、色谱法、免疫分析法等。微生物法是测定抗生素残留的经典方法，具有前处理简单、经济、批量大等优点，但精确度、准确度和特异性不高。色谱法应用较普遍，精确度和灵敏度高，但因其流程繁琐、设备昂贵、检测速度慢等原因，很难实现现场检测和普及推广。酶联免疫检测法具有简单、快速、处理样本量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，被广泛应用于残留检测，但在实践中很容易出现各种各样的问题，如加样时间是否一致，洗板是否彻底，加样量是否一致等，导致易出现假阳性结果等缺点。基于化学发光强度和被测物含量之问的关系建立的分析方法叫化学发光分析法。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6 18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级。本研究旨在建立AMOZ残留化学发光酶联免疫检测试剂盒，为拥有自主知识产权检测产品技术的开发奠定基础。
实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的AMOZ残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中AMOZ残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。[0007]本实用新型的技术方案是一种检测AMOZ残留量的化学发光酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的化学发光板、14瓶试剂，化学发光板是采用96孔试剂板作为固相载体，在微孔中预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原制成的检测板；14瓶试剂分别为7瓶呋喃它酮代谢物标准品溶液、酶标抗体浓缩液、酶标抗体稀释液、化学发光液A液、化学发光液B液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、衍生化试剂。检测AMOZ残留量的化学发光酶联免疫试剂盒还包括一张盖板膜、放置试剂的15个下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液、酶标AMOZ抗体浓缩液、酶标AMOZ抗体稀释液、化学发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液用塑料瓶盛放，衍生化试剂用玻璃瓶盛放，下凹瓶位 由塑料泡沫制成；盒体是硬纸盒。化学发光板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条化学发光反应微孔条组成，每个可拆装化学发光反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原，96孔试剂板为不透明的聚苯乙烯化学发光板，放于真空铝钼袋内；盖板膜大小与化学发光板横切面大小一致；将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的试剂瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为标准品溶液7瓶，ImL/瓶；浓缩酶标抗体I瓶，ImL ;酶标抗体稀释液I瓶，7mL ;化学发光液A液I瓶，8mL ;化学发光液B液I瓶，8mL ;浓缩洗涤液I瓶，40mL ；浓缩复溶液I瓶，50mL ;衍生化试剂I瓶，15mg。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中并用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中含有的AMOZ将和包被AMOZ偶联抗原竞争结合抗AMOZ抗体，加入发光液，测量各孔发光强度值，再与标准曲线比较计算出相应浓度值再乘以其样品前处理的稀释倍数，即可得出样品中AMOZ的残留量。其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度畜禽组织(肌肉、肝脏)和水产品样本的最低检测限为O. Ing/mL，回收率为85± 15%，相对于其他AMOZ检测方法，本试剂盒所需仪器较少，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物组织中呋喃它酮代谢物残留量的检测。
图I为本实用新型化学发光板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型化学发光板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型化学发光板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图化学发光反应微孔条(2)预包被AMOZ偶联抗原(3)固定于化学发光板的外框支撑架(I)上，化学发光反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于化学发光板置水浴或恒温箱内反应时封盖化学发光反应微孔条(2);半透明塑料试剂瓶(5)分别用于封装40mL浓缩洗涤液和50mL复溶工作液；黑色塑料试剂瓶(6)分别用于封装8mL化学发光液A液和8mL化学发光液B液，棕色玻璃试剂瓶(6)分别用于封装15mg衍生化试剂——2-硝基苯甲醛，白色塑料试剂瓶(7)分别用于封装ImL酶标抗体和7mL酶标抗体稀释液，白色塑料试剂瓶(8)分别用于封装ImL/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40mL浓缩洗涤液瓶位(18)，50mL浓缩复溶液(11)，8mL化学发光液A液瓶位(14)，8mL化学发光液液B液瓶位(13)，15mg衍生化试剂瓶位(12)，ImL酶标AMOZ抗体浓缩液瓶位(16)，7mL酶标AMOZ抗体稀释液瓶位(15)，7瓶ImL/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(9)是硬纸盒。
具体实施方式
具体实施例一样本的前处理I、配液配液I :衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加IOmL甲醇溶解混匀。配液2 :0. lmol/L磷酸氢二钾溶液称取22. 8g三水合磷酸氢二钾加入IL去离子水溶解混匀。配液3 lmol/L盐酸溶液量取8. 3mL浓盐酸加入去离子水定容至100mL。配液4 lmol/L氢氧化钠溶液称取4. Og氢氧化钠加IOOmL去离子水溶解混匀。配液5 :复溶工作液用去离子水将2 X浓缩复溶液按I :1体积比进行稀释(I份
2X浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液6:洗涤液工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按I :19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2、样本处理步骤(I)用均质器均质样本，称取I. 0±0. 05g均质后的样本，加入4mL去离子水、0. 5mLlmol/L盐酸溶液和100 μ L衍生化试剂，用涡旋仪涡动2min ；(2)在37°C过夜孵育16h，分别加入5mL 0. lmol/L磷酸氢二钾溶液、0. 4mL ImoI/L氢氧化钠溶液和5mL乙酸乙酯，用涡旋仪涡动30s，3000 rpm以上，室温(20 25°C )离心5min ；(3)取2. 5mL乙酸乙酯相至IOmL干燥玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干；加入ImL正己烷，用涡旋仪涡动lmin，再加入ImL复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀；(4)3000 rpm以上，室温(20 25°C )离心5min ;除去上层有机相，取下层水相50μ 用于分析。组织样本稀释倍数为2具体实施例二 使用试剂盒的操作步骤I、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(2(T25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、酶标抗体工作液配置用酶标抗体稀释液将酶标抗体浓缩液按9:1稀释(9份酶标抗体稀释液+1酶标抗体浓缩液)。6、加标准 品/样本/酶标抗体工作液加标准品/样本50 μ L到对应的微孔中，直接加入酶标抗体工作液50 μ L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。7、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ L/孔，充分洗涤7次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。8、发光液配制根据发光液的使用量，将A液和B液按I: I混合，摇匀后使用，(注现配现用)每孔加入新配制的发光底物ΙΟΟμ ，震荡约30秒左右，室温放置3分钟。9、测定加入底物3分钟后，用光子计数仪测量。具体实施例三结果判定(I)发光百分比的计算，标准品或样本的发光百分比等于标准品或样本的发光强度值的平均值(双孔)除以O浓度标准品的发光强度度值，再乘以100%，即
发光百分比(％)=^^χ00%
RLUoRLU—标准溶液或样本溶液的平均发光强度值RLU0-O浓度标准溶液的平均发光强度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品发光百分比为纵坐标，以标准品浓度(ng/mL)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的发光百分比代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AMOZ实际浓度。具体实施例四注意事项I、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(2(T25°C)会导致所有标准的光子计数值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇匀。4、不要使用过了有效期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于21 °C，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的化学发光剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致光子计数计数值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种检测呋喃它酮代谢物的化学发光试剂盒，其特征在于包括盒体和盒内的一块96孔的化学发光板、14瓶试剂，化学发光板是采用96孔试剂板作为固相载体，在微孔中预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶呋喃它酮代谢物标准品溶液、酶标抗体浓缩液、酶标抗体稀释液、化学发光液A液、化学发光液B液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、衍生化试剂。
2.根据权利要求I所述的检测呋喃它酮代谢物的化学发光试剂盒，其特征在于还包括一张盖板膜、放置试剂的15个下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告；96孔试剂板为不透明的聚苯乙烯化学发光板，放于真空铝钼袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液、酶标AMOZ抗体浓缩液、酶标AMOZ抗体稀释液、化学发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液用塑料瓶盛放，衍生化试剂用玻璃瓶盛放，下凹瓶位由塑料泡沫制成；盒体是硬纸盒。
3.根据权利要求I所述的检测呋喃它酮代谢物的化学发光试剂盒，其特征在于化学发光板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条化学发光反应微孔条组成，每个可拆装化学发光反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原；盖板膜大小与化学发光板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，ImL/瓶；浓缩酶标抗体I瓶，ImL ;酶标抗体稀释液I瓶，7mL ;化学发光液A液I瓶，8mL ;化学发光液B液I瓶，8mL ;浓缩洗涤液I瓶，40mL ;浓缩复溶液I瓶，50mL ;衍生化试剂I瓶，15mg。
专利摘要本实用新型涉及一种检测呋喃它酮代谢物的化学发光试剂盒。该试剂盒包括96孔化学发光板、呋喃它酮代谢物(AMOZ)标准品溶液、酶标抗体浓缩液、酶标抗体稀释液、化学发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、衍生化试剂、自封袋、盖板膜、说明书和质检报告。采用间接竞争CELIA方法，在发光板微孔中预包被AMOZ偶联抗原，样本中含有的AMOZ将和包被AMOZ偶联抗原竞争结合抗AMOZ抗体，加入发光液，测量各孔发光强度值，再与标准曲线比较计算出相应浓度值再乘以其样品前处理的稀释倍数，即可得出样品中AMOZ的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、灵敏度高等特点，可在动物组织中AMOZ的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N21/76GK202794039SQ201220500290
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者何方洋, 万宇平, 陶光灿, 罗晓琴, 聂雯莹, 韩京朋, 冯月君, 罗贵昆 申请人:北京勤邦生物技术有限公司