专利名称：以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的测定方法
技术领域：
本发明涉及ー种保健食品中总皂苷的測定方法，尤其是涉及ー种以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂采集植物的树脂，并混以自身分泌物而成的胶粘性物质。蜂胶可以补虚弱，化浊脂，止消渴；外用解毒消肿，收敛生肌。蜂胶已经被广泛用作保健食品原料。蜂胶中组分复杂，不溶于水，提纯后的蜂胶呈褐色块状，既不方便服用，也不利于吸收，因此加工成保健食品时往往需要加入辅料保证蜂胶能够以细微粉末的状态分散在产品中。以蜂胶为原料的保健食品中，可同时配有西洋參、人參等含皂苷类化合物的原料，这类保健食品往往将总黄酮与总皂苷确定为产品的功效成分。文献报道的总皂苷测定方法有:香草醛比色法、薄层色谱法、GC法、HPLC法、LC 一 MS法，CE法等；如沈向红，任一平，陈翊.HPLC法与香草醛比色法測定保健品中的人參皂甙.中国卫生检验杂志，2004, 14(6):681-683中就公开了香草醛比色法和HPLC法。保健食品评价与技术规范(2003年版)提供的保健食品中总皂苷的測定方法，是目前保健食品中总皂苷的经典測定方法，用此法測定含有蜂胶原料的保健食品时，由于受蜂胶、崩解剂、填充剂等辅助物料的保护，产品中总皂苷难以被有效提取，总皂苷含量測定结果往往与实际配方量不符，准确度差。现在也有其他的用于测定总皂苷含量的方法，如
公开日为2012年10月31日，公开号为CN102759514A的中国专利中，公开了ー种注射用益气复脉制剂中人參总皂苷的含量的測定方法，该方法包括以下步骤:1)对照品的制备分别精密称取人參总皂苷对照品，加甲醇溶解，制得溶液，2)供试品溶液的制备取注射用益气复脉药物粉末，精密称定，用水溶解，过上树脂柱，以甲醇-水冲洗后，以甲醇洗脱，洗脱液过滤，制得溶液，3)測定方法分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，紫外分光光度法测定样品中人參总皂苷的含量。该方法不能测定以蜂胶为原料的保健食品中的总皂苷。综上所述，目前还没有一种提取方法简单，回收率高，准确性好，简便快速的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种提取方法简单，回收率高，准确性好，简便快速的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法。本发明解决上述问题所采用的技术方案是:该以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:该测定方法包括标准曲线制作エ序、样品处理工序、试液过柱エ序、显色エ序和总皂苷计算エ序；
所述标准曲线制作エ序中，分别吸取Oml、10ml、20ml、40ml、60ml、80ml、IOOml和120ml已知浓度的人參皂苷Re标准液置于八个蒸发皿中，待蒸发皿中的人參皂苷Re标准液干燥后，先加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液,再加水20ml,摇匀后用盐酸调节pH值为
6.5-7.0，从而得八份标准母液，将八份标准母液置于45-55°C的水浴中超声20_40min破乳，冷却到常温，分别采用50ml的容量瓶用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为标准试液，从而得到八份标准试液；采用层析柱对每份标准试液进行过柱操作，先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液,再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL标准试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液，用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，从而得到八个挥发后的蒸发皿；在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸
5.0mL，摇匀后，以Icm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到八个吸光度值；ー个吸光度值和ー个蒸发皿中含有的人參皂苷的质量相对应，采用吸光度值和人參皂苷的质量做曲线，得到标准曲线；
所述样品处理工序中，取以蜂胶为原料的保健食品0.3g置于50ml容量瓶中，加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液来溶解保健食品,待保健食品溶解后,加水20ml，摇匀后用盐酸调节PH值为6.5-7.0，在45-55°C的水浴中超声20_40min破乳，冷却到常温，用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为待测试液；
所述试液过柱エ序中，采用层析柱对待测试液进行过柱操作，先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液,再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL待测试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液,用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，得到待测试液挥干蒸发皿；所述显色エ序中，在待测试液挥干蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸5.0mL，摇匀后，以Icm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到待测试液的吸光度值，该吸光度值和以蜂胶为原料的保健食品相对应；
所述总皂苷计算エ序中，将待测试液的吸光度值代入标准曲线中，得到待测试液中含有的人參皂苷的质量，从而得到以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的含量。本发明采用氢氧化钠水溶液溶解以蜂胶为原料的保健食品，释放被蜂胶、崩解剂和填充剂包埋的总皂苷成分，使之溶于水中，然后用盐酸调节PH值至6.5-7.0，保证总皂苷在水中的稳定性，并使蜂胶重新析出，排除了蜂胶的干扰，从而有效地提取了总皂苷。用本方法測定含有蜂胶、崩解剂、填充剂的样品中的总皂苷，具有提取方法简单，回收率高，准确性好，简便快速的特点，可以用于以蜂胶为原料以总皂苷为功效成分的保健食品的质量控制，也可以用于一般保健食品中的总皂苷的測定。作为优选，本发明在标准曲线制作エ序中和试液过柱エ序中，所用的层析柱的长20cm-25cm,内径0.6cm_0.8cm,顶部接30ml的！)&液漏斗；层析柱内装6cm高的Amberlite-XAD-2大孔树脂,上加高Icm的中性氧化招。作为优选，本发明在样品处理工序中，使用氢氧化钠溶液来溶解保健食品时，采用振摇分散的方式或者超声辅助分散的方式进行溶解。作为优选，本发明在样品处理工序中，向已经溶解的保健食品中加入20ml水并摇匀后，用于调节PH值的盐酸为体积百分比为10%的盐酸。作为优选，本发明所述标准曲线制作エ序中，标准曲线的回归方程为y=ax+b，其中，Y表示吸光度值，X表示人參皂甙的质量，a为正数，b为任意数。作为优选，本发明所述标准曲线制作エ序中，标准曲线的回归方程为y=0.0036x-0.0043,表示吸光度值的y的单位为A,表示人參阜式的质量的x的单位为mg。作为优选，本发明所述回归方程的相关系数R2=0.9937，说明在20mg-240mg范围内呈现良好的线性关系。作为优选，本发明所述样品处理工序中，以蜂胶为原料的保健食品是磨成粉末状的。由此使得本发明能够更快更有效的溶解保健食品。作为优选，本发明所述人參皂苷Re标准液的浓度为2.0mg/mL。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:采用氢氧化钠水溶液溶解以蜂胶为原料的保健食品，释放被蜂胶、崩解剂和填充剂包埋的总皂苷成分，使之溶于水中，然后用盐酸调节PH值至6.5-7.0，保证总皂苷在水中的稳定性，并使蜂胶重新析出，排除了蜂胶的干扰，从而有效地提取了总皂苷。用本方法測定含有蜂胶、崩解剂、填充剂的样品中的总皂苷，具有提取方法简单，回收率高，准确性好，简便快速的特点，可以用于以蜂胶为原料以总皂苷为功效成分的保健食品的质量控制，也可以用于一般保健食品中的总皂苷的測定。本发明在提取试剂的选择上做出了创新，皂苷结构中的酚羟基与香草醛结构中的醛基进行羟醛缩合反应生成红色的缩合物，将甙元的酚羟基氧化为羧基，与醛缩合反应，糖类、黄酮类化合物因含有酚羟基而干扰測定。本发明曾采用甲醇提取总皂苷，因为蜂胶易溶于甲醇，所以用甲醇作为提取剂，可完全提取总皂苷，但是样品在用甲醇提取总皂苷的同时，也提取了蜂胶，为了排除蜂胶的干扰需将甲醇吹干，再加水溶解总皂苷，由于蜂胶依然存在于甲醇提取物中，并牢牢将总皂苷包埋，所以用水难以溶出总皂苷，导致结果偏低。本发明也曾采用热水回流法提取，虽然比甲醇法好ー些，回收率有所提高，但是依然偏低，且检验结果不稳定，这可能是因为加热可以増加崩解剂、填充剂的溶解度，但不能提高蜂胶在水中的溶解度，此外，结果不稳定与样品粗细、提取温度、时间等因素有夫。分析蜂胶与总皂苷的性质，本发明采用氢氧化钠水溶液提取总皂苷，蜂胶易溶于碱性水溶液，总皂苷得以从蜂胶中被释放到碱性水溶液中，再调节PH值至酸性，蜂胶被沉淀，而总皂苷仍留在水中，用氢氧化钠水溶液提取总皂苷，回收率可达到90.3%-109.7%。本发明在提取液浓度的选择上做出了创新，总皂苷在碱性水溶液中不稳定，最适pH值为6.03，这在1998年8月出版的《中国现代应用药学杂志》第15卷增刊中由许文祥研究的人參液体制剂人參总皂甙PHm測定中有记载。样品中的蜂胶含有大量酸性成分，提取剂氢氧化钠水溶液首先与蜂胶中的酸性物质进行中和反应，从而溶解蜂胶，蜂胶的量决定了提取剂的用量。如果提取液浓度过高，会加速皂苷的水解，浓度过低，则蜂胶不被溶解，皂苷成分不能充分溶出。本发明在大量试验的前提下，最終重点考察了摩尔浓度为0.1M、0.5M和IM这三种浓度，以及2mL、3mL和5mL这三种用量对样品的溶解情況，发现称样量在0.3g吋，使用5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠可很好地溶解样品，调节pH值时盐酸的用量最少。
本发明在提取pH值的选择上做出了创新，样品被氢氧化钠溶液溶解后，需要调节PH值，保证总皂苷被充分提取而不被水解。本发明在大量试验的前提下，最終重点研究了pH值为5、6、7吋，总皂苷的回收率，发现在pH值为7时的回收率最好，可能原因是由于在酸性条件下，蜂胶重新析出时包埋了部分皂苷所致。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。实施例。本实施例中以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法包括标准曲线制作エ序、样品处理工序、试液过柱エ序、显色エ序和总皂苷计算エ序。在标准曲线制作エ序中，分别吸取Oml、10ml、20ml、40ml、60ml、80ml、IOOml和120ml浓度为2.0mg/mL的人參皂苷Re标准液置于八个蒸发皿中，待蒸发皿中的人參皂苷Re标准液干燥后，先加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液，再加水20ml，摇匀后用盐酸调节PH值为6.5-7.0，从而得八份标准母液，将八份标准母液置于50°C的水浴中超声30min破乳，冷却到常温，分别采用50ml的容量瓶用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为标准试液，从而得到八份标准试液。采用层析柱对每份标准试液进行过柱操作，所用的层析柱的长20cm-25cm，内径0.6cm-0.8cm,顶部接30ml的！)&液漏斗；层析柱内装6cm高的Amberlite_XAD_2大孔树脂，上加高Icm的中性氧化铝。先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL标准试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液，用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，从而得到八个挥发后的蒸发皿。在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸5.0mL，摇匀后，以Icm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到八个吸光度值。ー个吸光度值和ー个蒸发皿中含有的人參皂苷的质量相对应，采用吸光度值和人參皂苷的质量做曲线，得到标准曲线，采用EXCEL软件，求得该标准曲线的回归方程为y=0.0036x-0.0043，其中，y表示吸光度值，I的单位为A，X表示人參皂甙的质量，X的单位为mg，该回归方程的相关系数R2=0.9937，说明在20mg-240mg范围内呈现良好的线性关系。本发明中的标准曲线的回归方程可以为y=ax+b，其中，y表示吸光度值，x表示人參皂甙的质量，a为正数，b为任意数。在样品处理工序中，取以蜂胶为原料的保健食品0.3g置于50ml容量瓶中，加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液来溶解保健食品，待保健食品溶解后，加水20ml，摇匀后用盐酸调节PH值为6.5-7.0，在50°C的水浴中超声30min破乳，冷却到常温，用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为待测试液。本发明在使用氢氧化钠溶液来溶解保健食品时，可以采用振摇分散的方式或者采用超声辅助分散的方式进行溶解；用于调节PH值的盐酸可以为体积百分比为10%的盐酸；以蜂胶为原料的保健食品通常是磨成粉末状的。
在试液过柱エ序中，采用层析柱对待测试液进行过柱操作，所用的层析柱的长20cm-25cm,内径0.6cm_0.8cm,顶部接30ml的！)&液漏斗；层析柱内装6cm高的Amberl ite-XAD-2大孔树脂，上加高Icm的中性氧化铝。先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL待测试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液，用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，得到待测试液挥干蒸发皿。在显色エ序中，在待测试液挥干蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸5.0mL,摇匀后，以1cm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到待测试液的吸光度值，该吸光度值和以蜂胶为原料的保健食品相对应。在总皂苷计算エ序中，将待测试液的吸光度值代入标准曲线的回归方程中，得到待测试液中含有的人參皂苷的质量，从而得到以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的含量。本发明可以采用由北京普析通用仪器有限责任公司制造的TU-1810SPC紫外可见分光光度计来测定吸光度值，可以采用Sartorius BS224S分析天平来称取样品，可以采用PH精密试纸来测pH值。本发明中以蜂胶、西洋參提取物为主要原料生产的片剂是由杭州蜂之语蜂业股份有限公司提供的；所用的人參皂苷Re标准品是中国药品生物制品检定所的，批号是110754-200822，质量百分含量是88.8% ;所用的正丁醇、氢氧化钠、盐酸、甲醇、こ醇、冰こ酸、高氯酸均为分析纯；中性氧化铝是层析用的；水可以是双重蒸馏水。下面对本发明中的測定方法的线性范围、检测限、回收率和精密度进行分析。线性关系:将浓度为2.0mg/mL的人參皂甙Re标准溶液0ml、10ml、20ml、40ml、60ml,80mlUOOml和120ml放在蒸发皿中，放在低于60°C的水浴中挥干，或热风吹干(勿使过热)。以y表示吸光度值(A)，X表示人參皂甙Re质量(mg)，用EXCEL软件，求得方法的回归方程为y=0.0036x-0.0043，相关系数R2=0.9937，说明在20mg_240mg的范围内呈现良好的线性关系。
权利要求
1.ー种以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:该测定方法包括标准曲线制作エ序、样品处理工序、试液过柱エ序、显色エ序和总皂苷计算エ序； 所述标准曲线制作エ序中，分别吸取Oml、10ml、20ml、40ml、60ml、80ml、IOOml和120ml已知浓度的人參皂苷Re标准液置于八个蒸发皿中，待蒸发皿中的人參皂苷Re标准液干燥后，先加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液,再加水20ml,摇匀后用盐酸调节pH值为6.5-7.0，从而得八份标准母液，将八份标准母液置于45-55°C的水浴中超声20_40min破乳，冷却到常温，分别采用50ml的容量瓶用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为标准试液，从而得到八份标准试液；采用层析柱对每份标准试液进行过柱操作，先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液,再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL标准试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液，用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，从而得到八个挥发后的蒸发皿；在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸5.0mL，摇匀后，以Icm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到八个吸光度值；ー个吸光度值和ー个蒸发皿中含有的人參皂苷的质量相对应，采用吸光度值和人參皂苷的质量做曲线，得到标准曲线； 所述样品处理工序中，取以蜂胶为原料的保健食品0.3g置于50ml容量瓶中，加入5ml摩尔浓度为0.1M的氢氧化钠溶液来溶解保健食品,待保健食品溶解后,加水20ml，摇匀后用盐酸调节PH值为6.5-7.0，在45-55°C的水浴中超声20_40min破乳，冷却到常温，用水定容到50ml，摇匀后过滤，弃去5ml初滤液，取1.0ml续滤液做为待测试液； 所述试液过柱エ序中，采用层析柱对待测试液进行过柱操作，先用25mL体积百分比为70%的こ醇洗柱，弃去洗脱液,再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL待测试液，过柱，用25mL的水洗柱，以洗 去糖份等水溶性杂质,弃去洗脱液,用25mL体积百分比为70%的こ醇洗脱人參皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴中挥干，得到待测试液挥干蒸发皿；所述显色エ序中，在待测试液挥干蒸发皿中准确加入0.2mL体积百分比为5%的香草醛冰こ酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.SmL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60°C以下的水浴中加热lOmin，取出，冰浴冷却后，准确加入冰こ酸5.0mL，摇匀后，以Icm比色皿于560nm波长处与标准管一起进行比色測定，从而得到待测试液的吸光度值，该吸光度值和以蜂胶为原料的保健食品相对应； 所述总皂苷计算エ序中，将待测试液的吸光度值代入标准曲线中，得到待测试液中含有的人參皂苷的质量，从而得到以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的含量。
2.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:在标准曲线制作エ序中和试液过柱エ序中，所用的层析柱的长20cm-25cm，内径0.6cm-0.8cm,顶部接30ml的！)&液漏斗；层析柱内装6cm高的Amberlite_XAD_2大孔树脂，上加高Icm的中性氧化铝。
3.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在干:在样品处理工序中，使用氢氧化钠溶液来溶解保健食品时，采用振摇分散的方式或者超声辅助分散的方式进行溶解。
4.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:在样品处理工序中，向已经溶解的保健食品中加入20ml水并摇匀后，用于调节pH值的盐酸为体积百分比为10%的盐酸。
5.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:所述标准曲线制作エ序中，标准曲线的回归方程为y=ax+b，其中，y表示吸光度值，x表示人參阜式的质量，a为正数，b为任意数。
6.根据权利要求5所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:所述标准曲线制作エ序中，标准曲线的回归方程为y=0.0036x-0.0043，表示吸光度值的I的单位为A，表示人參皂甙的质量的X的单位为mg。
7.根据权利要求6所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:所述回归方程的相关系数R2=0.9937，说明在20mg-240mg范围内呈现良好的线性关系。
8.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法，其特征在于:所述样品处理工序中，以蜂胶为原料的保健食品是磨成粉末状的。
9.根据权利要求1所述的以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的測定方法， 其特征在于:所述人參皂苷Re标准液的浓度为2.0mg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种保健食品中总皂苷的测定方法，尤其是涉及一种以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的测定方法。本发明包括标准曲线制作工序、样品处理工序、试液过柱工序、显色工序和总皂苷计算工序，标准曲线制作工序中，采用吸光度值和人参皂苷的质量做曲线，得到标准曲线，样品处理工序中，取以蜂胶为原料的保健食品0.3g得到待测试液，试液过柱工序中，采用层析柱对待测试液进行过柱操作，得到待测试液挥干蒸发皿，显色工序中，得到待测试液的吸光度值，总皂苷计算工序中，得到以蜂胶为原料的保健食品中总皂苷的含量。本发明提取方法简单，回收率高，准确性好，简便快速。
文档编号G01N1/34GK103115887SQ20131003576
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者周萍 申请人:杭州蜂之语蜂业股份有限公司