专利名称：快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞计数领域，特别涉及一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用。
背景技术：
目前测定活细胞数的方法有光学显微镜读数计数法、平板涂布培养菌落计数法、光电比浊法、最大或然数法，以及膜过滤法等。显微镜直接计数法:将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接观察计数。该方法简便、快速、直观，可以用于酵母、细菌、霉菌孢子和动物细胞等悬液的计数。缺点为不能准确识别细胞的死活状态，所测得的结果通常是死细胞和活细胞的总和。平板菌落计数法:将待测样品经适当稀释，使其中的微生物菌落或动物细胞充分分散成单个细胞状态，取一定量的稀释样液接种到平板培养基上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落或细胞群落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。这种方法广泛适用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源)等的含菌指数或污染程度的检测。缺点是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以经培养后形成的单菌落可能来自样品中的2-3个或更多个细胞，或者由于菌体的生长周期不同，在同一种培养基中由于适应性的差异，有的菌体需要3天即可长出菌落，有的菌体需要I个星期甚至更长的时间，因此平板菌落计数的结果往往偏低，通常使用菌落形成单位(colony-formingunits, cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用，该试剂盒可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简便，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点，不仅适用于动物细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。本发明的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，所述试剂盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的储存浓度为5-6mM，碘化丙啶染料的储存浓度为100 μ g/mL。所述花青素染料所使用的稀释缓冲液为IXTE buffer [含ImM EDTA(乙二胺四乙酸)的IOmM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-HCl)缓冲液，pH8.0]。这种染料能渗透到所有状态下的细胞，它倾向于结合细胞内双链DNA，对于单链DNA和RNA的结合较少，对细胞的核酸进行染色，使细胞发出绿色荧光。所述花青素染料使用时稀释1000-10000倍。所述花青素染料溶剂为二甲基亚砜，使用时的工作最终浓度(工作浓度指的是与细胞染色时的实际浓度)为5-6 μ M0
花青素染料，其结构式为:
权利要求
1.一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的储存浓度为5-6mM，碘化丙啶染料的储存浓度为100 μ g/mL。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述花青素染料所使用的稀释缓冲液为IXTE buffer，碘化丙啶染料所使用的稀释剂是超纯水。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述花青素染料使用时稀释1000-10000倍。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述花青素染料使用时的工作最终浓度为5-6 μ M。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述花青素染料的溶剂为二甲基亚砜，碘化丙啶染料的溶剂为超纯水。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，其特征在于:所述碘化丙啶染料的工作最终浓度为10-20 μ g/mL。
7.—种如权利要求1所述的快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒的应用，其特征在于:检测步骤如下:在生物样品液中加入试剂盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用荧光显微镜观察计数或者利用微孔荧光读板器在发射光波长下进行检测，根据不同颜色荧光值的强弱反映生物样品中细胞的存活状态。
8.根据权利要求7所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒的应用，其特征在于:所述利用荧光显微镜观察计数的具体步骤包括: (O吸取细胞悬液于包有锡箔纸的离心管中； (2)加入体积比为1-2:1的花青素染料和碘化丙啶的混合染料，细胞悬液与混合染料的体积比为7:3，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟；或者加入与细胞悬液体积比为4:1的花青素染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测活体；或者加入与细胞悬液体积比为9:1的PI染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测死体； (3)将染过色的生物样品液通过0.2 μ m的黑色过滤膜过滤，使细胞截留在黑色过滤膜上，将过滤膜转移到载玻片上，在膜中央滴一滴无荧光精油，盖上盖玻片； (4)将玻片置于突光显微镜下,在盖玻片中央滴一滴无突光镜油，用100倍的油镜观察，分别在花青素染料和PI染料的最适激发光下进行检测，目镜中呈绿色的细胞是活体，呈红色的细胞是死体。
9.根据权利要求7所述的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒的应用，其特征在于:所述利用微孔荧光读板器在发射光波长下进行检测的具体步骤包括: (1)将含有细胞的培养基经过0.2 μ m的过滤膜过滤，将收集的细胞用生理盐水重悬； (2)在微孔板中加入细胞悬液，在微孔中加入体积比为1-2:1的花青素染料和碘化丙啶的混合染料，细胞悬液与混合染料的体积比为7:3，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟；或者加入与细胞悬液体积比为4:1的花青素染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测活体；或者加入与细胞悬液体积比为9:1的PI染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测死体；微孔内总体积不超过300 μ L，染色10-30分钟，在激发光为460nm-500nm，发射光为500nm-530nm的条件下检测其荧光强度值， 荧光的强弱反映了此细胞悬液中活体的数量，在激发光为460nm-530nm，发射光为600nm_640nm的条件下检测其荧光强度值，荧光的强弱反映了此细胞悬液中死体的数 量。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用，试剂盒包括花青素染料和碘化丙啶染料。检测步骤如下在细胞悬液中加入试剂盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用荧光显微镜观察计数或者利用微孔荧光读板器在发射光波长下进行检测，根据不同颜色荧光值的强弱反映生物样品液中细胞的存活状态。本发明可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简便，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点，不仅适用于动物细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。
文档编号G01N15/10GK103175768SQ201310060140
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者洪枫, 张硕, 杜倩雯, 兰水, 陈琳, 李登新 申请人:东华大学