一种促性腺激素的纯度测定方法

一种促性腺激素的纯度测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种促性腺激素的HPLC纯度测定方法，具体地，本发明提供了一种用交联葡聚糖或交联琼脂糖或两者的混合交联物为填料的分子排阻层析柱对原粉和/或原料药进行高压液相色谱测定的方法；其中，所述分子排阻层析柱的主峰USP理论塔板数不低于1600。该方法具有良好的专属性、准确度和重复性。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及促性腺激素的纯度分析。尤其涉及人尿卵泡刺激素的纯度分析。 一种促性腺激素的纯度测定方法

【背景技术】
[0002] 治疗不孕症的促性腺激素是一类结构接近的糖蛋白物质，包括绒毛膜促性腺激素 (HCG)、绝经期促性腺素（HMG)、卵泡刺激素（FSH)、黄体生成素（LH)，其中绝经期促性腺素 是含有卵泡刺激素和黄体生成素且两者成一定比例（2:1-1:2)的混合物。
[0003] HCG、FSH、LH都是由α链和β链两个亚基通过非共价键的形式结合，其中它们 的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺 是发生Ν-糖基化的氨基酸。HCG的β亚基有145-147个氨基酸，分子量22200-39000D，其 中第13、30位置上的天冬酰胺以及第121、127、132、145位置是发生糖基化的地方。FSH的 β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生 Ν-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D。
[0004] 临床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特 定妇女（孕期或绝经期）的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。
[0005] 治疗不孕症的促性腺激素的第一代产品是上世纪60年代Serono公司的 Profasi (HCG)、Pergonal (HMG)，它们的纯度都较低，含有大量杂质。上世纪80年代之后， Serono公司分别推出了 Metrodin-HP，它是一种杂质含量很低的高纯度的FSH制剂；后来又 推出利用DNA重组技术生产的Gonal-F(rFSH)、Luveris(rLH)等，另外，Ferring公司也推 出了高纯度绝经期促性腺素一Menopur。
[0006] 低纯度的产品由于杂蛋白含量大，对人体有较大的副作用，主要的临床不良反应 表现为过敏、皮疹、发热、关节疼痛以及下腹不适或胀感、腹痛、恶心、呕吐等，对使用安全性 带来一定的风险。另外，由于低纯度产品杂质含量大，刺激性较大，因此给药方式也只能局 限于肌肉注射。由于肌肉注射需要一定深度的刺入，故一般都是选择臀大肌或上臂三角肌 部位，这种注射方式的缺点是疼痛大、注射不便。因此，若能开发出比活高、杂质少的高纯度 产品，就能在临床不良反应和注射方式这两方面得到极大地改善，一是大大减少副作用，提 高产品的安全性，二是可以进行皮下注射，减轻患者的痛苦并且操作方便，现在进行皮下注 射的患者一般都在家中自己进行注射给药。但皮下注射时对产品纯度的要求格外高，微量 杂质的存在更容易引起局部过敏反应。目前已经投入市场的高纯度促性腺激素类糖蛋白药 物通过皮下注射仍有发生过敏反应的报道。因此有必要进一步提高和控制促性腺激素类药 物的纯度，然而，现有检测方法并不能很精确的检测出产品中的所有杂质，由此无法真正有 效地控制杂质的含量，以保证用药的安全性。
[0007] 因此，如何改进此类促性腺激素的纯度的测定方法，提高测定的准确性，一直以来 都是人们不断研究的课题。蛋白类的药物与一般的化学药物在性质上有很大的不同，一般 的化学药物检测方法针对于蛋白类的药物的检测往往不能发挥较好的作用，尤其是针对于 促性腺激素类药物。主要原因是蛋白类物质分子量相对较大，结构非常复杂，存在有四级结 构，结构上的差异可以让同一种蛋白表现出不同的性质。促性腺激素由于在蛋白的骨架上 连有糖链，同一种蛋白质的每个蛋白分子上连有的糖链数目可能有所不同，而每一条糖链 的长短、糖链的单糖组成也不尽相同，这就造成了促性腺激素性质不均一性非常明显。另 夕卜，经高度纯化后的蛋白质药物，其残留的杂蛋白在性质上已与主成分非常相似，正是因为 这种相似，让常规的蛋白分离手段不能有效的去除这些杂蛋白，因此，常规的纯度分析方法 也无法有效的检测促性腺激素的纯度。
[0008] 目前，促性腺激素的纯度分析方法使用最多的是SDS-凝胶电泳和凝胶色谱法，这 两种方法虽然都是根据分子的大小进行蛋白分离，但其原理不尽相同，电泳是通过蛋白质 与SDS结合后，通过蛋白质在电场中进行泳动来进行分离，而凝胶色谱法则是靠被分离组 分分子体积与凝胶的孔径大小之间的相对关系而分离。两种方法相互之间不可取代，互补 短长。
[0009] 凝胶色谱法测定促性腺激素的纯度同样也受到促性腺激素的分子大小不均一的 影响，其分离促性腺激素的效果一直不够理想，只有对分子量差异非常大，性质很均一的蛋 白才能够达到有效分离。而促性腺激素的分子量普遍在28KD至50KD之间，本身差异不大， 可能含有的杂质或有关物质的分子量也与之相差不是很大，因此，测定的效果也无法尽如 人意。
[0010] 现有文献也有报道采用凝胶色谱的方法检测促性腺激素纯度的方法，如 文献：Claudio ffolfenson and others, ^Article Batch-to-batch Consistency of Human-derived Gonadotrophin Preparations Compared with Recombinant Preparations，Reproductive biomedicine online, 10 (2005) ,442 - 454.以及其它多篇 文献都报道过采用Tosoh Bioscience公司的Bios印S2000 (TSKG2000)凝胶柱对卵泡刺 激素，绝经期促性腺激素或者绒毛膜促性腺激素进行纯度分析。然而这种分析方法对卵泡 刺激素，高纯度绝经期促性腺激素样品中的小分子杂质无法有效的分离，其小分子杂质峰 被主成分峰所掩盖，无法计算小分子杂质含量，其对绒毛膜促性腺激素的小分子杂质的分 离效果也不理想。
[0011] 另外，文献：Bert HM van de Wei jer and others, 'Compositional Analyses of a Human Menopausal Gonadotrophin Preparation Extracted from Urine(menotropin). Identification of Some of Its Major Impurities. '，Reproductive biomedicine online, 7(2003)，547 - 57.也报道过采用Superdex7510/30凝胶柱，以含有20%乙腈的 0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7. 0为流动相，210nm处紫外检测的方法对高纯度绝经期促性 腺激素，重组卵泡刺激素，重组绒毛膜促性腺激素和重组促黄体生成素等进行纯度分析。然 而，由于该方法的分离效果并不是很理想，其对高纯度绝经期促性腺激素的杂质没法有效 分离，造成主峰前伸和拖尾，致使大分子杂质和小分子杂质与主成分峰的USP分离度都小 于1，远不能符合要求，因此无法较准确的测定样品中的杂质量。发明人参照该文献分析方 法进行卵泡刺激素的纯度分析，发现该方法虽然可以同时较好的分离卵泡刺激素中的大分 子和小分子杂质，但在分离度上都不尽如人意，尤其是在杂质(或有关物质）量较低的情况 下，如杂质量小于2%的情况下，其分离度较差。
[0012] 文献：郑璐侠等，注射用绒促性素中纯度测定方法的研究，药物分析杂志，32 (2012),333-336.报道了采用两根TSK G3000SWXL进行串联对注射用绒促性素进行纯度分 析，虽然对于分子量在40KD附近的不同物质的分离情况有改善，但对于小分子杂质，尤其 是卵泡刺激素中分子量较小的蛋白杂质的分离情况没有改善，并且其试过了不同型号针对 于不同分子量段的TSK层析柱，都不如TSK G3000SWXL的效果好。
[0013] 由此可见，目前针对于治疗不孕症的促性腺激素的纯度液相分析方法还不够理 想，其主要原因为：首先，由于该类糖蛋白的杂质与主物质的分子量相差并不是很大，在现 有的分子排阻的填料上无法非常有效的分离。其次，由于该类糖蛋白上含有多个糖链，且每 个糖链都具有很大程度上的多样性，造成了同一种糖蛋白也具有分子量上的一定差异，因 此，在分子排阻的液相上反映出来的就是峰展宽，从而易造成主峰和杂质峰无法有效分离。 再次，由于糖蛋白在性质上的多样性，而杂质的性质又与主活性成分相似，因此无法通过其 他原理的分离分析方法进行有效的纯度分析。
[0014] 人们也尝试了通过两根凝胶色谱柱进行串联来增加柱长，提高理论塔板数，从而 提高杂质的分离效果的方法，虽然杂质的分离效果确实有所改善，针对于绒促性素的杂质 检测有明显的改善，但针对于高纯度卵泡刺激素中小分子杂质的检测并未有较好的改观。
[0015] 另外，在促性腺激素类原料药和促性腺激素类制剂的制备过程中，其制备用的原 料，如促性腺激素类原粉和促性腺激素类原料药的质量直接关系到最终产品的质量，若所 用原料的质量不符合要求，则制备出的产品也将不符合药品质量标准。因此，迫切需要找到 一种切实可靠的检测方法，有效保障最终获得的制剂产品的质量。
[0016] 因此，本领域迫切需要开发出一种能更好的测定该类促性腺激素纯度的分析方 法。


【发明内容】

[0017] 本发明的一个目的在于提供一种测定促性腺激素纯度的分析方法。
[0018] 本发明的另一个目的在于提供一种高纯度，适合多种给药方式的促性腺激素类原 料药或促性腺激素类制剂的制备方法。
[0019] 本发明的第一方面，提供了一种通过HPLC测定样品中促性腺激素纯度的方法， 其特征在于，用分子排阻层析柱对所述样品进行高压液相色谱测定，从而测得所述样品中 的促性腺激素纯度，其中所述分子排阻层析柱的填料包括交联葡聚糖、交联琼脂糖或其组 合；
[0020] 并且，所述分子排阻层析柱的主峰USP理论塔板数彡1600。
[0021] 在另一优选例中，所述的分子排阻层析柱为葡聚糖、琼脂糖或其混合交联物为填 料的层析柱，较佳地为由琼脂糖和葡聚糖交联组成的Superdex为填料的层析柱。
[0022] 在另一优选例中，所述的分子排阻层析柱为Superdex7510/300GL层析柱。
[0023] 在另一优选例中，所述层析柱为预装柱或非预装柱。
[0024] 在另一优选例中，所述的理论塔板数不低于1700,更佳地不低于1800。
[0025] 在另一优选例中，采用2根分子排阻层析柱串联进行检测，较佳地，采用2根 Superdex7510/300GL层析柱串联进行检测。
[0026] 在另一优选例中，所述测定方法中使用的流动相为乙腈和缓冲盐溶液。
[0027] 在另一优选例中，所述测定方法中使用的流动相流速为0. 1?1. 0ml/分钟。
[0028] 在另一优选例中，所述测定方法中使用的检测波长为200?300nm。
[0029] 在另一优选例中，所述的流动相中乙腈对水相的体积比为0?1/2,较佳地为 1/20 ?2/5。
[0030] 在另一优选例中，所述的缓冲盐选自下组：磷酸盐、Tris、醋酸盐、氯化钠，或其组 合；较佳地，所述的缓冲盐选自下组：磷酸盐、氯化钠，或其组合。
[0031] 在另一优选例中，所述的缓冲盐是磷酸二氢盐，较佳地为磷酸二氢钠。
[0032] 在另一优选例中，所述的缓冲盐溶液浓度为10mM?1700mM，较佳地为lOOmM? 300mM ;所述缓冲盐溶液浓度为溶液中各种盐的总浓度。
[0033] 在另一优选例中，所述的缓冲盐的pH为5. 0?10. 0。
[0034] 在另一优选例中，所述促性腺激素包括选自下组的一个或多个成分：绒毛膜促性 腺激素、绝经期促性腺素、卵泡刺激素、黄体生成素；较佳地，所述促性腺激素包括卵泡刺激 素。
[0035] 在另一优选例中，所述方法还包括如下的一个或多个条件：
[0036] a、高压液相色谱系统包括两根串联的Superdex7510/300GL柱；
[0037] b、流动相：乙腈：缓冲盐溶液=1 :20?2 :5,其中所述的比例为体积比；
[0038] c、流速：0· 2 ?0· 8ml/min，
[0039] d、柱温：25 ?45°C ;
[0040] e、检测波长：210 ?235nm ;
[0041] f、进样浓度：3000 ?4500IU/ml。
[0042] 在另一优选例中，所述的样品为促性腺激素类原粉或促性腺激素类原料药。
[0043] 本发明的第二方面，提供了一种制备促性腺激素类原料药的方法，所述的促性腺 激素类原料药的制备过程包含如下步骤：
[0044] A、用如本发明第一方面所述的纯度测定方法，测定促性腺激素类原粉纯度；
[0045] B、若步骤（A)的测定结果表明原粉中总杂质含量> 2%，则对所述原粉重新进行纯 化，直至测定结果表明总杂质含量< 2% ;
[0046] C、若步骤（A)的测定结果表明该原粉中总杂质含量< 2%，则在该促性腺激素类原 粉中加入药学上可接受量的赋形剂，制得促性腺激素类原料药。
[0047] 本发明的第三方面，提供了一种制备促性腺激素类药物制剂的方法，所述的促性 腺激素类药物制剂制备过程包含如下步骤：
[0048] A、用如本发明第一方面所述的纯度测定方法，测定促性腺激素类原料药的纯度；
[0049] B、若步骤（A)的测定结果表明该原料药中总杂质含量< 2%，则在该促性腺激素类 原料药中加入药学上可接受量的赋形剂，制得促性腺激素类药物制剂。
[0050] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0051] 图1显示了实施例1方法一所得的色谱图；
[0052] 图2显示了实施例1方法二所得的色谱图；
[0053] 图3显示了实施例1方法三所得的色谱图；
[0054] 图4显示了实施例1方法四所得的色谱图；
[0055] 图5显示了实施例2方法一所得的色谱图；
[0056] 图6显示了实施例2方法二所得的色谱图；
[0057] 图7显示了实施例3序号1实验所得的色谱图。

【具体实施方式】
[0058] 本发明人经过广泛而深入的研究发现，首次意外地发现，当采用交联葡聚糖和/ 或交联琼脂糖作为分子排阻层析柱的填料，并且分子筛的理论塔板数达到1600以上时，可 以有效地将杂质与主物质分离开，从而可以准确地测定高纯度促性腺激素样品中的少量杂 质的含量。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0059] 本发明的试验表明，当分子筛的理论塔板数达到1600以上（可采用两根串联的分 子筛柱，如两根Superd ex7510/300GL)，通过HPLC进行促性腺激素纯度测定时，以一定比例 的乙腈为流动相，以紫外检测器在200?300nm处进行监测，对于测定含有极低杂质含量的 促性腺激素，其杂质与主物质能够得到较好的分离，对于较准确的测定高纯度促性腺激素 的杂质含量起了积极的作用，为该类物质的安全性评价和质量的进一步提高提供了有力的 手段。
[0060] 术语
[0061] 如本文所用，"促性腺激素"选自下述的一种或多种混合：绒毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin, CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone, FSH)、 黄体生成素 （luteotropic hormone, LH)、绝经期促性腺素 （human menopausal gonadotropin，HMG)。所述"促性腺激素原粉"是促性腺激素在加入稀释剂制备成原料药之 前的干燥粉。所述促性腺激素类原粉可用现有技术的方法制备，如可以从特定妇女（孕期 或绝经期）的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。
[0062] 在另一优选例中，所述现有技术包括（但不限于），中国专利CN1246332C公开的 制备方法获得的高纯度的HMG ;中国专利CN1958603B公开的制备方法获得的HCG ;以及 CN101307103A公开的方法获得的FSH。
[0063] 如本文所用，"促性腺激素类原料药"是指含有促性腺激素类原粉的组合物，其组 成为促性腺激素和药学上/食品学上可接受的载体。可以为固体或液体，可以使用本领域 现有的制备促性腺激素组合物的方法来获得，其可以直接用来制备成药物制剂，其在药学 上定义为原料药。例如但不限于，中国专利CN101269215B公开的方法获得的促性腺激素类 原料药。
[0064] 以上原料药的取得方法仅是举例，本发明所述的原料药应当不受此限制。
[0065] 在本发明的优选实施方式中，所述FSH原料药中的FSH原粉含量为不低于10 μ g/ mg原料药或不低于100国际单位/mg原料药。
[0066] 如本文所用，术语"促性腺激素类药物制剂"是指含有治疗有效量的促性腺激素类 原料药，以及药学上可接受的载体，例如(但并不限于)，中国专利CN1795012A公开的方法获 得的FSH组合物或欧洲专利EP0618808公开的方法获得的FSH组合物。
[0067] 在本发明的优选实施方式中，所述FSH制剂中的FSH原料药占制剂总重量的 0. 001?99. 9wt% ;优选为组合物总重量的0. 01?99wt%，较优选为0. 02?95wt%，更优选 0. 05?90wt%。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
[0068] 如本文所用"总杂质含量"指除主成份之外的各个杂质含量的总和，包含了本文所 述的"大分子杂质"、"小分子杂质"和其它可能存在的杂质含量的总和。
[0069] 如本文所用"大分子杂质"是指分子量大于主成份的杂质，"小分子杂质"是指分子 量小于主成份的杂质。
[0070] 如本文所用，术语"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……构成"、和 "由……构成"。如本文所用，术语"治疗有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的 且可被人和/或动物所接受的量。
[0071] 如本文所用，术语"药学上可接受的"或"食品学上可接受的"的成分是适用于人和 /或动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即有合理的效益/风险比的 物质。
[0072] 如本文所用，术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种 赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用 后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》 (Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上 可接受的赋形剂的充分讨论。
[0073] 所述的"药学上可接受的载体"可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些 载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解齐?、润滑剂、助流齐?、泡腾齐?、润湿剂或乳 化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受 的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8,较佳地，pH约为6-8。
[0074] 应理解，所用FSH的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体 情况根据对象的个体情况（例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果）来决定，这在 熟练医师或营养师可以判断的范围内。
[0075] 本发明的药物组合物，可以为固态（如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含 片）或液态（如口服液、水针剂）或其它合适的形状。
[0076] 按中国药典规定：除另有规定外，一般情况下，待测组分与相邻共存物之间的分离 度应大于1. 5。然而，由于促性腺激素属于生化药物，此类药物杂质的分离非常困难，因此本 领域已经形成共识：分离度大于1就符合要求。若分离度过小，则表明两峰之间分离情况很 差，其通过积分来计算纯度的误差就会非常大。
[0077] 另外，在本领域普遍使用的分析方法通常积分分析时采用峰谷对峰谷积分，这样， 会将基线人为的抬高，从而使分离度数值提高以满足大于1的要求。由于基线被人为的抬 高，各个峰的积分面积就会相差很大，尤其是当该峰面积本身很小时，即当杂质含量很低 时，这种情况会更明显。因此当杂质含量很低时，如杂质含量低于3%时，更优选杂质含量低 于2%时，该积分方法并不适用。另外，当杂质含量较低时，如杂质含量低于3%时，更优选杂 质含量低于2%时，主成分峰会很高，而杂质峰相对会很小，这样一来，两峰之间的分离情况 就会更差，分离度更低，纯度测定的误差就会更大。因此，本发明采用的积分方式为垂线分 割法的方式来分离峰，该种方法可以消除基线抬高而引入的误差，从而达到准确定量杂质 的目的。两种积分方法可以参照原著Hans-Joachim Kuss, Stavros Kromidas，陈小明、唐雅 妍编译的《液相与气相色谱定量分析使用指南》一书的详细介绍进行。
[0078] 理论塔板数
[0079] 如本文所用，"USP理论塔板数"或"理论塔板数"或"理论板数"是用于评价色谱 柱的分离效能的指标。由于不同的物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作 为衡量柱效能指标时，应指明测定物质，本文所述的理论板数为主峰的理论板数。理论板数 的计算公式为 ：
[0080] n=16 (tK/W)2 或 η=5· 54 (?κ/Χ/2)2
[0081] 其中，η为理论板数，
[0082] tK为峰的保留时间，
[0083] W为峰的峰宽，
[0084] Wh/2为峰的半高峰宽。
[0085] 通常，理论塔板数可通过控制峰的保留时间进行调控，如改变柱长，或将多根色谱 柱串联使用等方法实现。
[0086] 如本文所用，"USP分离度"或"分离度"是用来评价待测组分与相邻共存物或难分 离物质的分离程度的一种指标，其是衡量色谱系统效能的关键指标。其是参照美国药典对 分离度的定义而来的，而中国药典对分离度也具有相同的计算公式。在Waters公司的液相 色谱分析软件Empower2上，可以通过积分分析而自动计算给出"USP分离度"值。其计算公 式如下：
[0087]

【权利要求】
1. 一种通过HPLC测定样品中促性腺激素纯度的方法，其特征在于，用分子排阻层析柱 对所述样品进行高压液相色谱测定，从而测得所述样品中的促性腺激素纯度，其中所述分 子排阻层析柱的填料包括交联葡聚糖、交联琼脂糖或其组合； 并且，所述分子排阻层析柱的主峰USP理论塔板数> 1600。
2. 如权利要求1所述的纯度测定方法，其特征在于，所述的分子排阻层析柱为葡聚糖、 琼脂糖或其混合交联物为填料的层析柱，较佳地为由琼脂糖和葡聚糖交联组成的Superdex 为填料的层析柱。
3. 如权利要求1所述的纯度测定方法，其特征在于，所述的理论塔板数不低于1700,更 佳地不低于1800。
4. 如权利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述测定方法中使用的流动相为乙 腈和缓冲盐溶液。
5. 如权利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述测定方法中使用的流动相流速 为(λ 1?LOml/分钟。
6. 如权利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述测定方法中使用的检测波长为 200 ?300nm〇
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的流动相中乙腈对水相的体积比为0? 1/2。
8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐选自下组：磷酸盐、Tris、醋酸 盐、氯化钠，或其组合；较佳地，所述的缓冲盐选自下组：磷酸盐、氯化钠，或其组合。
9. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐溶液浓度为10mM?1700mM， 较佳地为100mM?300mM。
10. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐溶液的pH为5. 0?10. 0。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促性腺激素包括选自下组的一个或多 个成分：绒毛膜促性腺激素、绝经期促性腺素、卵泡刺激素、黄体生成素；较佳地，所述促性 腺激素包括卵泡刺激素。
12. 如权利要求1?11任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下的一个或多 个条件： a、 高压液相色谱系统包括两根串联的Superdex7510/300GL柱； b、 流动相：乙腈：缓冲盐溶液=1 :20?2 :5,其中所述的比例为体积比； c、 流速：0· 2 ?0· 8ml/min， d、 柱温：25 ?45°C ; e、 检测波长：210?235nm ; f、 进样浓度：3000 ?4500IU/ml。
13. 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的样品为促性腺激素类原粉或促 性腺激素类原料药。
14. 一种制备促性腺激素类原料药的方法，其特征在于，所述的促性腺激素类原料药的 制备过程包含如下步骤： A、 用权利要求1所述的纯度测定方法，测定促性腺激素类原粉的纯度； B、 若步骤（A)的测定结果表明原粉中总杂质含量> 2%，则对所述原粉重新进行纯化， 直至测定结果表明总杂质含量< 2% ; C、若步骤（A)的测定结果表明该原粉中总杂质含量<2%，则在该促性腺激素类原粉中 加入药学上可接受量的赋形剂，制得促性腺激素类原料药。
15. -种制备促性腺激素类药物制剂的方法，其特征在于，所述的促性腺激素类药物制 剂制备过程包含如下步骤： A、 用权利要求1所述的纯度测定方法，测定促性腺激素类原料药的纯度； B、 若步骤（A)的测定结果表明该原料药中总杂质含量<2%，则在该促性腺激素类原料 药中加入药学上可接受量的赋形剂，制得促性腺激素类药物制剂。
【文档编号】G01N30/60GK104101656SQ201310111942
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】洪云海, 王科伟, 季晓铭 申请人:上海天伟生物制药有限公司