专利名称：二硫键交联的糖蛋白激素类似物及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖蛋白激素的类似物及其制备和应用。更具体地说，本发明涉及二硫键交联的糖蛋白激素类似物及其制备和应用。
背景技术：
糖蛋白激素包括绒膜促性腺激素(CG)、促黄体素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)。人的这些激素称为人绒膜促性腺激素(hCG)、人促黄体素(hLH)、人促卵泡激素(hFSH)、人促甲状腺激素(hTSH)。这些激素在性腺和甲状腺功能上有重要作用(Pierce等人，1981，Molye等人，1995)。CG和LH结合并刺激LH受体，FSH结合并刺激FSH受体，TSH结合并刺激TSH受体。CG主要由一些哺乳动物(包括灵长类的那些动物)胎盘大量产生的激素。灵长类动物CGβ亚基的氨基酸序列通常和LH的不同。马也产生CG，但是它的氨基酸序列与马的LH相同(Murphy等人，1991)。
如Pierce等人1981年的综述所述，糖蛋白激素是包括α和β亚基的异二聚体。异二聚体并非通过共价键连接在一起，可以通过酸或尿素处理激素来分离它们的亚基(Pierce等人，1981)。大多数高等脊椎动物只有一种编码α亚基的基因(Fiddes等人，1984)；同一α亚基通常和LH、FSH、TSH以及CG(当其存在时)的β亚基结合。然而，翻译后的蛋白加工，尤其是糖基化(Baenziger等人，1988)会导致LH、FSH、TSH和CGα亚基的组成不同。这些激素间的大部分氨基酸序列差异在它们的激素特异性β亚基中(Pierce等人，1981)。它们由不同的基因产生(Fiddes等人，1984，Bo等人，1992)。
除很少例外(Blithe等人，1991)，α-β异二聚体的激素活性比游离亚基更高(Pierce等人，1981)。天然存在的α和β亚基形成的α，β异二聚体比它们形成的α，α均二聚体或β，β均二聚体更佳。实际上，hCG α亚基和β亚基基因在哺乳动物细胞内一起表达导致形成α-β-异二聚体、α亚基单体以及β亚基单体。如果有α，α均二聚体或β，β均二聚体，也只形成或从细胞中分泌出了很少的量。
两个实验室已经报道了人绒膜促性腺激素(hCG)的高分辨率X射线晶体结构(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)。这些结构指出，原来提出的二硫键方式(Mise等人，1980和1981)是不正确的，激素是半胱氨酸结节(knot)蛋白家族的一个成员(Sun等人，1995)。由于半胱氨酸在所有糖蛋白激素中的相对位置是相似的，因此它们可能具有在hCG中发现的半胱氨酸结节结构。
脊椎动物糖蛋白激素α亚基中的半胱氨酸残基的位置是相似的(
图1A和1B)。用hCGα亚基作为模型，看出半胱氨酸结节由第2、第3、第5、第7、第8和第9个α亚基半胱氨酸形成的。这产生了三个大的α亚基环(图1A和1B)。环1是第二和第三半胱氨酸间的氨基酸序列；环2是第五和第七α亚基半胱氨酸间的氨基酸序列；环3是第七和第八半胱氨酸之间的氨基酸序列。半胱氨酸残基在脊椎动物糖蛋白激素β亚基中的位置是相似的(Pierce等人，1981)。采用hCGβ亚基作为模型，看出半胱氨酸结节由第1、第4、第5、第6、第8和第9半胱氨酸形成。这产生了三个大的β亚基环(图2A和2B)。环1是第1和第4半胱氨酸之间的氨基酸序列；环2是第5和第6半胱氨酸之间的序列；环3是第6和第8半胱氨酸之间的序列。用另一α亚基的同源部分代替α亚基部分，或用另一β亚基的同源部分代替β亚基部分，可以制得每个糖蛋白激素亚基的功能性嵌合体(Campbell等人，1991；Moyle等人，1990；Moyle等人，1994；Cosowsky等人，1995；Moyle等人，1995；Cosowsky等人，1997)。图1C中大致示出了糖蛋白激素亚基中的结构元件，下表1A中显示了人糖蛋白激素亚基与氨基酸残基的对应关系。
表1A人激素亚基氨基酸序列与图1C所示结构元件的对应关系
除了它的半胱氨酸结节外，β亚基还含有称为“座位系带(seat-belt)”的序列(Lapthorn等人，1994)，该序列缠绕第二α亚基环。座位系带起始于第9半胱氨酸(β亚基半胱氨酸结节中的最后一个残基)，并包括第10、第11和第12半胱氨酸。它通过第12半胱氨酸(即座位系带的羧基末端)和第3半胱氨酸(即在第一个β亚基环中)之间形成的二硫键与第一β-亚基环相连。
座位系带是hCGβ-亚基的一部分，它对hCG鉴别LH和FSH受体的能力有显著(如果不是主要)的影响(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994)。用hFSH中发现的座位系带序列代替所有或部分的hCG座位系带氨基酸序列，结果改变了所得激素类似物的受体结合特异性。通常，hCG和LH受体的结合比与FSH或TSH受体的结合强1000倍以上。然而，hCG的类似物(例如CF94-117和CF101-109，其中hCG座位系带残基101-109(即Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr)被其hFSH对应物(即Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr)代替)与FSH受体的结合比与hCG受体的结合好得多(Moyle等人，1994)。另外，通过操纵座位系带的组成，可以制备具有不同程度的LH和FSH活性的hCG类似物(Moyle等人，1994；Han等人，1996)。这些类似物具有潜在的用于增强男性和女性生育力的治疗用途。
大多数、但并非所有的糖蛋白激素亚基内二硫键是其生物活性所必需的。用其它氨基酸(尤其是丙氨酸)代替各个半胱氨酸的研究表明，半胱氨酸结节所有的二硫键以及座位系带是异二聚体折叠所必需的(Suganuma等人，1989；Bedows等人，1993；Furuhashi等人，1994)。人α亚基半胱氨酸7-31和59-87之间以及hCGβ-亚基半胱氨酸23-72之间的其余二硫键并非为异二聚体形成或激素活性所必需。
但是还没有描述任何糖蛋白激素和其受体相互反应的高分辨晶体结构。已经建立了几个模型试图来描述激素受体复合物的结构。这些模型大部分是根据hCG和核糖核酸酶抑制剂(一种在结构上和糖蛋白激素受体胞外结构域相似的蛋白)的晶体结构。为鉴别接触受体的激素残基所做的大多数努力是根据导致受体结合减少的化学、酶促或基因突变的影响。不幸的是，由于结合的减少可能由特异性接触的破坏或激素构型变化所引起(Cosowsky等人，1997)，因此这些变化的效应很难解释(如果不是不可能的话)。这在本领域中产生了很大的分歧(Remy等人，1996；Berger等人，1996)，一些研究者得出结论，确定受体复合物中激素的取向是不可能的(Blowmick等人，1996)。
确定受体复合物中激素取向的其它方法依靠鉴定出不接触受体的激素区域。这些区域在激素结合受体后仍旧外露，和/或能发生改变而不破坏激素-受体相互作用。当在hCG晶体结构上作出这些图谱后(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)，就可以用hCG可能与LH受体相互作用的方式设计出假想模型(Moyle等人，1995)。该方法提示第二个α亚基环和第一个以及第三个β亚基环形成的激素沟槽涉及主要的受体接触(Cosowsky等人，1995)。这也解释了为什么最强的激素-受体结合需要两个亚基的原因(Pierce等人，1981)。在下面几段中将讨论支持该结论的数据。然而，应当注意，本领域中大部分(如果不是其它所有)研究者支持这样一个模型，其中激素的取向很不相同(Remy等人，1996；Berger等人，1996)，即使这些研究者意识到描绘的只是模型(即他们引用了描述该模型的论文，模型中的主要受体结合位点由激素沟槽(groove)形成)。
看来不与受体接触的hCGα亚基的许多部分可被替代而不会破坏与LH受体的结合。这些区域中有一些显然在激素-受体复合物中是外露的，因为它们在hCG结合LH受体时还能被单克隆抗体识别(Molye等人，1990；Cosowsky等人，1995；Molye等人，1995)。例如，尽管人和牛的α亚基具有很不相同的氨基酸序列，但是含有牛α亚基和hCGβ亚基的异二聚体能很好地结合大鼠和人LH受体(Cosowsky等人，1997)。这些异二聚体很容易用识别hCGα亚基的环1和3上表位的单克隆抗体来区分(Molye等人，1995)。这些观察表明，人和牛的α亚基环1和环3的表面不同，并提示激素的这一区域不形成关键的受体接触。
通过比较单克隆抗体识别hCG类似物(其部分α亚基从人或牛蛋白衍生获得)的能力，就可以鉴别出参与抗体结合的关键的α亚基残基(Molye等人，1995)。识别hCGα亚基上表位的一些单克隆抗体还与α亚基的片段(通过胰蛋白酶消化制得，缺少大部分的第二α亚基环)结合(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994；Birken等人，1986)。这一观察也用来确定和/或确认这些抗体的结合位点(Molye等人，1995)。当hCG和LH受体复合时，识别其α亚基表位的两个单克隆抗体(称为A105和A407)(Molye等人，1995)与hCG结合。因此，被这些抗体识别的α亚基残基看来不接触LH受体(Molye等人，1995)。α亚基的其余部分包括第二个α亚基环和蛋白的C端。α亚基的这些高度保守部分中的一些残基可能参与了受体接触。
看来不接触LH受体的hCGβ亚基的许多部分也可被突变代替而不破坏与LH受体的结合。这些部分包括hCGβ亚基第2环。hCG类似物(其中hCGβ亚基第2环的残基被hFSHβ亚基第2环中通常所见的那些残基(称为CF39-58)代替(Campbell等人，1991))很容易被识别FSH但不识别hCGβ亚基第2环中的残基的单克隆抗体区别开来。这表明，该类似物中的第二亚基环的结构与hCG中的不同。然而，该β亚基类似物与α亚基结合形成的α，β-异二聚体与LH受体相互作用类似于hCG(Campbell等人，1991)。因此，看来hCG第二β亚基环中很少(如果有的话)残基直接和LH受体形成必需的接触。类似地，hFSH第二β亚基环看来不接触FSH受体。已经报道了hCGβ亚基的类似物，其中第10个β亚基半胱氨酸和C端之间的残基或残基94-114之间的残基被hFSH的对应残基代替。这些类似物命名为CF94-117(Campbell等人，1991)和CFC94-114(Wang等人，1994)。两者与FSH受体的结合大大优于和LH受体的结合，即使它们在第2个β亚基环中含有全部hCG序列。由于hCG的第2β-亚基环看来对该激素结合LH或FSH受体的能力的影响最小，因此它似乎不可能参与和LH或FSH受体的高亲和性基本接触。另外，hCG的第2β亚基环靠近第一和第三α亚基环，该二部分α亚基似乎也不接触受体。因此，看来含有第一和第三α亚基环和第二β亚基环残基的hCG整个区域有可能不接触受体。如下面所讨论的，认为该部分激素伸入由受体胞外结构域形成的马蹄形空穴内(Molye等人，1995)。
不参与高亲和性受体接触的hCGβ亚基的残基在激素结合LH受体后仍可被单克隆抗体识别(Campbell等人，1991；Molye等人，1990；Moyle等人，1994；Cosowsky等人，1995)。它们包括距离α亚基界面最远的环1和3中发现的hCGβ-亚基的部分，它们可被例如B105、B108、B111和B112抗体所识别。这些抗体在hCG与LH受体复合时结合hCG(Molye等人，1990；Cosowsky等人，1995)，这证明β亚基第1环和第3环的这些部分不形成基本的受体接触。其它研究表明，可以除去hCGβ亚基的第1个半胱氨酸与N端之间以及第12个半胱氨酸与C端之间的残基而不会消除该激素结合LH受体的能力(Huang等人，1993)。β亚基的其余部分包括“座位系带”。这些残基中少数几个看来形成了高亲和性结合LH或FSH受体所需的基本接触。例如，发现改变“安全带”中第11和第12个半胱氨酸之间的残基对结合LH受体的影响最小(如果有的话)(Molye等人，1994)。改变第10和第11个半胱氨酸之间的残基对FSH受体的结合作用减少了5倍(Molye等人，1994)。另外，马LH(eLH)和马CG(eCG)座位系带中的大部分残基与FSH不同(Pierce等人，1981；Murphy等人，1991)，但是这些激素与大鼠FSH受体的结合很好。实际上，纯化eLH在体外结合大鼠FSH受体至少为hFSH的30％(Molye等人，1994)。仍未予说明的hCGβ亚基部分包括最靠近α亚基界面的环1和环3表面。因此，这些可能是激素接触受体的位点。当hCG与LH受体复合时，α亚基的某些部分也能被单克隆抗体识别。这些部分包括被抗体A105和A407识别的残基(Molye等人，1995)。
鉴别与受体相互作用的糖蛋白激素区域的其它策略包括采用识别多个受体的激素类似物(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994；Han等人，1996；Campbell等人，1997)。因此，通过将hCGβ亚基的座位系带简单地改变成hFSH的座位系带，可能制备能结合FSH和TSH变体的hCG类似物(Campbell等人，1997)。该类似物不含TSH特异性残基，但是仍然能刺激TSH应答，最大水平和TSH一样。如果比较这些多功能性类似物中一些类似物的活性，可以得出结论，大多数“座位系带”和几乎所有的第二β亚基环不可能形成关键的高亲和性受体基本接触。
关于LH、FSH或TSH受体晶体结构的报道还没有。然而，几种糖蛋白激素受体的氨基酸序列是已知的(Moyle等人，1994；McFarland等人，1989；Loosfelt等人，1989；Segaloff等人，1990；Sprengel等人，1990；Braun等人，1991；Nagayama等人，1991；Nagayama等人，1989；Jia等人，1991)。这些蛋白看来具有胞外、跨膜、和胞内结构域。在没有表达出跨膜或胞内结构域(Braun等人，1991；Ji等人，1991；Xie等人，1990；Moyle等人，1991)或与其它跨膜结构域一起表达(Moyle等人，1991)时，发现胞外结构域提供了受体对配体大部分的亲合力。这些蛋白的胞外结构域是富含亮氨酸重复序列蛋白家族的成员，而跨膜结构域看来具有7个跨越质膜的疏水性螺旋构型(McFarland等人，1989)。已经测定了核糖核酸酶抑制剂的晶体结构(一种富含亮氨酸重复序列蛋白质的模型结构)并显示出它具有马蹄形状(Kobe等人，1993和1995)。该发现提示LH、FSH和TSH受体的胞外结构域是马蹄形的(Moyle等人，1995)。利用LH/FSH受体嵌合体，已经鉴定出控制其hCG和hFSH结合特异性的LH和FSH受体胞外结构域的部分(Moyle等人，1994)。在考虑了最可能接触LH受体的hCG部分和负责配体结合特异性的LH受体部分后，设计出一种模型来解释该激素与LH受体相互作用并引发信号转导的能力(Moyle等人，1995)。在该模型中，第2α亚基环和第1和第3β亚基环之间的沟槽接触靠近马蹄形中间的受体胞外结构域边缘(Moyle等人，1995)。激素的其余部分伸入马蹄形臂之间的空间内。当激素与受体结合并伸入该空间时，它使信号转导所需的胞外结构域的构型稳定。这通过细胞表面上合适的受体表达所需的胞外结构域和跨膜结构域之间的特异性接触，来作用于跨膜结构域上(Moyle等人，1991)。这个模型解释了寡糖影响信号转导的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)。然而，尽管该模型能解释这些信息，但是还提出了hCG不同部分与受体相互作用的其它模型(Jiang等人，1995)。因此，仍然不清楚糖蛋白激素是怎样和其受体相互作用的。
激素受体相互作用的这种观点还解释了一些单克隆抗体对hCG结合的抑制作用，这些单抗识别认为不参与关键的受体接触的hCG区域。如以前所讨论的，这些区域包括由α亚基环1和环3以及β亚基环2形成的激素表面。在该模型中，这些区域伸入受体胞外结构域的N端和C端臂之间的空间内。抗体与这些部位的结合阻止了激素进入该空间。
大多数脊椎动物种类的糖蛋白激素中半胱氨酸位置相似(Pierce等人，1981)提示，它们会象hCG一样折叠。由于其胞外结构域中富含亮氨酸的重复序列以及其跨膜结构域中大量保守性残基的相似性(Moyle等人，1994；Braun等人，1991；Nagayama等人，1991)，糖蛋白激素受体的结构可能也非常类似。因此，成功地解释了hCG和LH受体相互作用的的任何模型似乎还能预计其它糖蛋白激素与其受体相互作用的能力。座位系带能影响配体-受体相互作用特异性的一种方式是改变激素亚基的相对位置(Cosowsky等人，1997)。这将改变第二α亚基环和第一和第三β亚基环之间沟槽的形状。已经指出，激素和受体中的抑制性元件负责阻止不合适的配体-受体相互作用(Moyle等人，1994)。因此，座位系带的作用是改变激素的形状以减少其装配入马蹄形中央部分的能力。
糖蛋白激素有几种治疗用途。FSH用来在女性排卵诱导准备中诱导卵泡发育(Galway等人，1990；Shoham等人，1991；Gast，1995；Olive，1995)。LH和hCG也用来诱导已经开始发育的卵泡的排卵。FSH、LH和hCG在男性中用来诱导睾丸功能。尽管现有的激素能用来刺激男性和女性生殖腺和甲状腺功能，但是这些激素实践用于此目的需要它们是异二聚体。这些可以从脑垂体腺(即LH和FSH)、血清(马绒膜促性腺激素)或怀孕妇女尿液(hCG)或绝经期后妇女尿液(hLH和hFSH的混合物)中分离得到。活性异二聚体还可自表达α和β亚基的细胞培养物，包括肿瘤细胞培养(Cole等人，1981)或已经转染了编码α和β亚基的cDNA或基因组DNA的细胞培养(Reddy等人，1985)中分离得到。实际上，后者是具有治疗用途的糖蛋白激素的重要来源。由于糖蛋白激素的寡糖已经表现出影响它们引发信号转导的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)，因此活性异二聚体的制备和合成最好在真核细胞中进行。这些细胞能将大量甘露糖寡糖加入寡糖中，并在一些情况下将它们加工成天然激素中所见的寡糖复合物(Baenziger等人，1988)。然而，由于真核细胞能以不同方式加工糖蛋白，因此糖蛋白激素的合成通常在哺乳动物细胞系(例如从中国仓鼠卵巢(CHO)衍生获得的细胞系)中进行。虽然能在非哺乳动物真核细胞中制得激素，但是其寡糖链的潜在抗原性限制了它们的临床应用。
异二聚体激素也已被用作免疫原来引发抗血清用于限制生育力(Singh等人，1989；Pal等人，1990；Talwar等人，1986；Talwar等人，1992；Moudgal等人，1971和1972；Moudgal，1976；Ravindranath等人，1990；Moudgal等人，1978)。鉴于hCG在维持人怀孕中的基本作用，产生针对hCG的免疫应答可作为一种避孕方式，人们已经作了许多努力来设计一种以hCG为基础的避孕疫苗。然而，在原则上，针对激素的抗体也可用来促进生育力。例如，在一些患多囊性卵巢疾病的女性中，LH水平看来是过量的。因此，设计一种能减少但不消除循环性LH活性的方法将有利于恢复生育力。
对糖蛋白激素代谢的了解很少。已经知道，该激素的半衰期受其寡糖含量的影响(Baenziger等人，1988)，尤其是其末端糖残基含量的影响。最稳定的激素是该位置的唾液酸含量最高的那些激素(Murphy等人，1991；Baenziger等人，1992；Fiete等人，1991；Smith等人，1993；Rosa等人，1984)。然而，寡糖并不完全负责激素的稳定性，因为知道游离的激素亚基具有明显较短的循环半衰期，即使它们具有和异二聚体相同的寡糖(Wehmann等人，1984；Kardana等人，1991)。实际上，已经提出，激素可能被导致亚基解离的蛋白水解灭活(Kardana等人，1991；Birken等人，1991；Cole等人，1991；Cole等人，1991；Cole等人，1993)。有缺口的hCG比hCG更快地解离成其无活性的亚基(Cole等人，1993)。因此，预计能阻止或减少亚基解离的步骤将提高激素效率。
在变性条件(包括热处理、极端pH和尿素)下，糖蛋白激素亚基迅速解离(Pierce等人，1981；Cole等人，1993)。出于这个原因，大多数糖蛋白激素制备物以冻干粉末形式保藏。提高异二聚体稳定性的步骤能用来保藏激素制备物并使其分配在水溶液中。这样就不需要购买分开的激素稀释剂，成品使用者也不需要另外进行激素的重建。
人们已经作了一些尝试，试图通过“交联”它们的亚基来使激素稳定。化学交联方法已被采用(Weare等人，1997和1979)；然而，这会导致活性降低。还可以通过β和α亚基基因融合来产生单链激素。该分子比异二聚体更稳定，并具有高的生物活性(Sugahara等人，1995)；然而，它与天然分子有很大不同。
交联蛋白质的另一种方法是用二硫键将它们系在一起。这种策略自然地发生能使半胱氨酸结节超家族其它蛋白(Sun等人，1995)稳定，并可能替代“座位系带”。另外，在蛋白质中增加二硫键可增强它们的稳定性，只要该二硫键的加入不提高蛋白质内的内部应变力(Matthews，1987；Matsumura等人，1989)。加拿大专利CA 2188508已经报道了用二硫键使糖蛋白异二聚体稳定。在Han等人(1996)中也有关于这些亚基间二硫键的评论，但是该文献报道说，引入这样的二硫键可能会降低激素活性。这非常有可能，因为这些异二聚体是具有几个二硫键的复合蛋白。在这些蛋白中增加一个半胱氨酸可能会破坏折叠，产生无功能的蛋白。另外，人们也不可能根据其它半胱氨酸结节蛋白来预计使糖蛋白激素稳定的二硫键位置，因为其它半胱氨酸结节蛋白中的亚基组织方式和糖蛋白激素中的有很大不同(Sun等人，1995)。
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发明概述因此，本发明的一个目的是克服了如上所述的现有技术的缺陷。本发明的糖蛋白激素类似物提供了改进的稳定性，并同时保留了对应糖蛋白激素的至少一部分生物活性。较佳的是，本发明的类似物保留了对应激素针对其天然受体的至少25％的亲和力。本发明的这些类似物比现有技术中的糖蛋白激素类似物有所改进，因为通过修饰一个α或β或两个亚基中的残基，合理地设计亚基间二硫键的位置，从而最大程度地减少了亚基间交联对激素结构的潜在影响。
本发明者已经发现，这种改进的糖蛋白激素类似物最好应符合这样的规则，即亚基间交联必须放置在涉及天然二硫键的两个已有(天然)半胱氨酸残基内而不在对应的天然亚基最外面的半胱氨酸之外。具有亚基间二硫键的现有技术中的糖蛋白激素类似物没有一种符合该规则。
本发明另一方面是提供一种糖蛋白激素类似物，它在α亚基半胱氨酸结节和β亚基半胱氨酸结节之间有亚基间二硫键。这最大程度地减少了糖蛋白激素的微扰，并使其基本上保留了对应的天然激素所具有的刺激促性腺激素受体的活性，同时赋予了改进的稳定性。现有技术中也未曾公开或提示过该特征。
本发明另一方面是提供一种糖蛋白激素类似物，该类似物在α亚基环3内半胱氨酸残基和β亚基环2内半胱氨酸残基之间或α亚基环1和β亚基环2之间具有亚基间二硫键。这也限制了糖蛋白激素的微扰，并使其保留了一部分对应天然激素所具有的刺激促性腺激素受体的活性，同时赋予了改进的稳定性。现有技术中也未曾公开或提示过该特征。
将本发明的类似物配制到药物组合物中后，它可用来治疗不育症或限制需要治疗患者的生育力。本发明类似物的异二聚体能作为液体药物制剂稳定地运输和保藏。
本发明还提供了含有编码该糖蛋白激素类似物α和β亚基的核苷酸序列的重组DNA分子，该重组DNA分子可以是表达载体。本发明还提供了转化这些重组DNA分子的真核宿主细胞，以及用来制备本发明类似物的方法。
附图简述图1A-1C显示了hCGα亚基的结构(图1A)，用单字母密码表示氨基酸序列(图1B)，以及糖蛋白激素亚基中结构元件的大致示意图(图1C)。从图1A可以看出，半胱氨酸结节将亚基分成三个大环。环1和3显示在顶部。注意，黑线指氨基酸骨架的Cα原子，而灰线指二硫键。图1B中的线表示二硫键。表1A中列出的糖蛋白激素亚基的结构元件以示意图形式显示在图1C中。
图2A和2B表示hCGβ亚基的结构(图2A)及其用单个字母密码表示的氨基酸序列(图2B)。从图2A可以看出，半胱氨酸结节将β亚基分成三个大环。环2显示在顶部。发现图右侧的小环在座位系带中。该区域中带正电荷和负电荷的残基分别对LH和TSH活性很重要。显示出连接该小环和β亚基环1的残基(看上去从小的座位系带环向下跑向β亚基的其余部分)对FSH和TSH受体结合有主要的影响。注意，黑线指氨基酸骨架的Cα原子，而灰线指二硫键。已经绘出的图2B中的线来描述二硫键。
图3A和3B显示了质粒pSVL-α，pCI-α，pSVL-αC7S和pC7-αC7S编码的α(图3A)和αC7S(图3B)的翻译的氨基酸序列。由于每个翻译的蛋白具有相同的前导序列，因此预计两者以相同方式加工，产生由92个氨基酸组成的蛋白并具有以APD为开始的N端氨基酸序列。用于此图以及其它图中的单字母密码是A，丙氨酸(Ala)；C，半胱氨酸(Cys)；D，天冬氨酸(Asp)；E，谷氨酸(Glu)；F，苯丙氨酸(Phe)；G，甘氨酸(Gly)；H，组氨酸(His)；I，异亮氨酸(Ile)；K，赖氨酸(Lys)；L，亮氨酸(Leu)；M，甲硫氨酸(Met)；N，天冬酰胺(Asn)；P，脯氨酸(Pro)；Q，谷氨酰胺(Gln)；R，精氨酸(Arg)；S，丝氨酸(Ser)；T，苏氨酸(Thr)；V，缬氨酸(Val)；W，色氨酸(Trp)；和Y，酪氨酸(Tyr)。大写字母表示Cys7被丝氨酸替代形成C7S的位置。
图4A和4B表示质粒pSVL-hCGβ′和pSVL-hCGβ′C7S编码的hCGβ′(图4A)和hCGβ′Y37C(图4B)的翻译的氨基酸序列。由于每个序列具有相同的前导序列，因此预计两者以相同方式加工产生由145个氨基酸组成的蛋白质，并具有以SKE为开始的N端氨基酸序列。大写字母指Tyr37突变成半胱氨酸的位置。
图5表示α亚基中C7S突变对α亚基单克隆抗体A113和A407结合的影响。对在细胞培养中制备的重组hCG(rhCG)以及每对条图下所示的、其结构在实施例中有所描述的类似物进行夹心免疫试验，采用B112作为捕获抗体，放射性碘化的A113或A407作为检测抗体。B112识别含有β亚基环3中残基的表位；A113识别包括α亚基环1中残基的表位；A407识别包括α亚基N端以及α亚基环1不同部分的残基的表位。A407和A113识别的表位不重叠，因为两者能同时结合hCG。每一对的右侧条图指B112/A407试验。左侧条指B112/A113试验。从图中看出，C7S突变对A407结合的影响比对A113结合的影响大得多。
图6显示了hCG(α31-β37)与LH受体的结合。该图描述了细胞培养中制得的rhCG(向上的三角)、尿液中纯化的hCG(方块)或细胞培养中制得的hCG(α31-β37)(向下的三角)抑制125I-hCG和表达LH受体的200,000 CHO细胞结合的能力。纵轴数值指在培育末与细胞结合的放射性标记的hCG的数量。该试验表明，hCG(α31-β37)与LH受体的结合和hCG相似。
图7显示了hCG(α31-β37)的LH受体信号转导活性，并描述了rhCG和hCG(α31-β37)促进表达LH受体的200,000CHO细胞中环腺苷酸累积的能力。在对激素刺激应答中产生的环腺苷酸是一种广泛认同的信号转导参数。该试验表明，hCG(α31-β37)刺激的环腺苷酸累积和hCG相似。
图8显示了含有亚基间二硫键的hCG类似物以及hCG的热稳定性。根据横坐标指定的间隔时间85℃培育相似量的hCG和类似物。冷却样品作夹心免疫试验，用抗hCGα亚基抗体A113(捕获抗体)和放射性碘化的抗hCGβ亚基抗体B112(检测抗体)确定保留的异二聚体的量。横坐标上的数值指该试验中相对于加热前hCG起始量存留的活性量。该试验表明，在85℃，hCG被迅速破坏，而交联的类似物基本上保留其活性至少20分钟。
图9显示了hCG和交联类似物对尿素解离的稳定性。图中描述了在每条泳道顶部鉴定的8M尿素对rhCG和交联的hCG类似物的影响。用8M尿素处理hCG来促进其亚基解离是众所周知的，该发现在这里得到确认。从图中可以看出，用8M尿素处理交联类似物不会促进亚基解离而导致对应于异二聚体的条带丧失。图中左侧标出了异二聚体和游离的β亚基的位置。在未处理的和经尿素处理的样品进行电泳后，将凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上，封闭硝酸纤维素表面上残留的非特异性蛋白位点，用放射性碘化的B105检测二聚体和游离的β亚基。
图10A和10B示出了以氨基酸单字母密码表示的质粒pSVL-CFC101-114β和pSVLCFC101-114βY37C编码的CFC101-114β′(图10A)和CFC101-114β′Y37C(图10B)的翻译的氨基酸序列。由于两者有相同的前导序列，因此预计两者以相同方式加工产生由145个氨基酸组成的蛋白质，具有以SKE为开始的N端氨基酸序列。大写字母的位置表示Tyr37突变成半胱氨酸的位置。有下划线的序列从hFSHβ亚基衍生获得。残基Arg95-Ser96的密码子形成了BglII位点，Val102-Arg-103-Gly104的密码子形成了SstII位点。
图11显示了α31-β37以及α51-β99二硫键对α亚基单克隆抗体A113和A407结合双功能性hCG/hFSH嵌合类似物的影响。对每对条图下方示出的hCG和CFC101-114类似物(其结构在实施例中有所描述)进行夹心免疫试验，用B112作为捕获抗体，放射性碘化的A113或A407作为检测抗体。B112识别含有β亚基环3中残基的表位；A113识别包括α亚基环1中残基的表位；A407识别包括α亚基N端以及α亚基环1不同部分的残基的表位。A407和A113识别的表位不重叠，因为两者能同时结合hCG。每一对的右侧条图指B112/A407试验。左侧条图指B112/A113试验。从图中看出，α31-β37和α51-β99二硫键均没有恢复A407与CFC101-114的结合活性。
图12显示了hCG、CFC101-114和含有亚基间二硫键的CFC101-114类似物的热稳定性。根据横坐标指定的间隔时间85℃培育hCG、CFC101-114和CFC101-114类似物。冷却样品作夹心免疫试验，用抗hCGα亚基抗体A113(捕获抗体)和放射性碘化的抗hCGβ亚基抗体B112(检测抗体)确定存留的异二聚体的量。横坐标上的数值指试验中相对于加热前hCG起始量存留的活性量。该试验表明，在85℃，hCG和CFC101-114被迅速破坏，而交联的类似物基本上保留其活性至少20分钟。
图13显示了hCG、CFC101-114和CFC101-114在表达LH受体的细胞中刺激环腺苷酸累积的能力。该图表示，在为了比较它们刺激LH受体信号转导而设计的试验中，CFC101-114(α31-β37)(实心三角)的效力至少和CFC101-114(空心标记)一样高。尽管CFC101-114(α51-β99)也刺激了信号转导，但是其效力低于CFC101-114或CFC101-114(α51-β99)。因此，与制得α51-β99二硫键所需的突变相反，制得α31-β37二硫键所需的突变不影响信号转导。座位系带影响受体结合特异性是众所周知的。因此，此图中的数据支持了这样一个观点，即将二硫键导入认为不参与受体接触或结合特异性的激素区域会对受体结合或信号转导产生最低程度的影响。因此，不接触受体和/或不提供受体结合特异性的激素区域将是制备二硫键交联的异二聚体的较佳的部位。
图14显示了hFSH、CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)在表达FSH受体细胞中刺激环腺苷酸累积的能力。该图表明，在为了比较它们刺激FSH受体信号转导能力而设计的试验中，针对CFC101-114(α31-β37)(实心三角)的最大应答半值与CFC101-114(空心标记)的最大应答半值相近。CFC101-114(α51-β99)的活性比CFC101-114或CFC101-114(α51-β99)低得多。因此，与制得α51-β99二硫键所需的突变相反，制得α31-β37二硫键所需的突变对FSH诱导的信号转导的影响最小。座位系带影响受体结合特异性是众所周知的。因此，此图中的数据支持了这样一个观点，即将二硫键导入认为不参与受体接触或结合特异性的激素区域，将对FSH受体结合或信号转导产生最低程度的影响。因此，不接触受体和/或不提供受体结合特异性的激素区域将是制备二硫键交联的异二聚体的较佳部位。
图15A和15B示出了质粒pSVL-αK51C和pSVL-hcGβ′D99C编码的αKSIC(图15A)和hCGβD99C(图15B)的翻译的氨基酸序列。由于每个以hCGα-亚基为基础的蛋白和每个以hCGβ亚基为基础的蛋白具有和hCGα以及β亚基相同的信号肽前导序列，因此预计它们以相同方式被加工。因此，预计αK51C将含有含N端序列APD的92个氨基酸残基，预计hCGβ′D99C将含有含N端序列SKE的145个氨基酸残基。这里所用的氨基酸单字母密码已经在图3A和图3B图例中定义。大写字母指进行突变以形成亚基间二硫键的位置。
图16显示了hCG(用带圆圈的实线表示)和hCG(α51-β99)(用带向上三角的虚线表示)抑制放射性标记的hCG和表达LH受体的CHO细胞结合的相对能力。
图17显示了hCG(用带圆圈的实线表示)、hCG(α-βD99C)(用带向下三角的虚线表示)、hCG(α51-β99)(用带向上三角的虚线表示)和hCG(αK51C-β)(用带菱形的虚线表示)抑制放射性标记的hCG和表达LH受体的CHO细胞结合的相对能力。
图18显示了hCG(用带圆圈的实线表示)和hCG(αK51A-β)(用带向下三角的虚线表示)与放射性标记的hCG竞争结合表达LH受体的CHO细胞的相对能力。
图19显示了hCG(用带圆圈的实线表示)、hCG(α51-β99)(用带空心方块的虚线表示)、hCG(α-βD99C)(用带向上三角的虚线表示)和hCG(αK51C-β)(用带圆圈的虚线表示)的相对的LH受体信号转导活性。
图20显示了hCG(用带圆圈的实线表示)和hCG(αK51A-β)(用带空心方块的虚线表示)的相对的LH受体信号转导活性。
图21示出了质粒pSVL-CFC101-114β′D99C编码的翻译的氨基酸序列。由于该翻译的蛋白具有和hCGβ亚基相同的信号序列，因此预计它以相同的方式加工，并产生有145个氨基酸并具有N-端氨基酸序列SKE的分泌的蛋白。大写字母指进行突变以引入二硫键的位置。
图22描述了hCG(用实线表示)、CFC101-114(用带向上三角的虚线表示)、CFC101-114(α51--β99)(用带向下三角的虚线表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用带实心菱形的虚线表示)和CFC101-114(αK51C-β)(用带空心菱形的虚线表示)的相对的LH受体结合活性。
图23描述了rhCG(用带方块的实线表示)、CFC101-114(用带向上三角的虚线表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用带圆圈的虚线表示)的相对的LH受体结合活性。
图24描述了hCG(用带实心圆圈的实线表示)、CFC101-114(用带空心方块的虚线表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用带菱形的虚线表示)、CFC101-114(αK51C-βD99C)(用单个点表示)和CRC101-114(αK51C-β)(用最靠近横坐标的线表示)的相对的LH受体信号转导活性。
图25描述了rhCG(用带圆圈的实线表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用带向上三角的虚线表示)的相对的LH受体信号转导活性。
图26描述了hFSH(用带圆圈的实线表示)、CFC101-114(用带方块的虚线表示)、CFC101-114(α-βD99C)(用带向上三角的虚线表示)、CFC101-114(αK51C-βD99C)(用带向下三角的实线表示)和CFC101-114(αK51C-β)(用带空心标记的实线表示)抑制125I-hFSH结合表达hFSH受体的CHO细胞的相对能力。
图27描述了hFSH(用带圆圈的实线表示)、CFC101-114(用带空心标记的虚线表示)在携带hFSH受体的CHO细胞中激发信号转导的相对能力。CFC101(α51-β99)、CFC101-114(α-βD99C)和CFC101-114(αK51C-β)的信号转导活性低得不能在所用类似物浓度下检测到。
图28描述了hFSH(用带圆圈的实线表示)、CFC101-114(用带空心方块的虚线表示)和CFC101-114(αK51A-β)(用带向上三角的虚线表示)在表达hFSH受体的CHO细胞中激发信号转导的相对能力。
图31A和31B显示了用小写字母氨基酸单字母密码表示的αC7S，K51C(图31A)和hCGβ′Y37C，D99C(图31B)的氨基酸序列。图31A中代替Cys7的丝氨酸和图31B中代替Tyr37和Asp99的半胱氨酸用大写字母表示。
图29描述了hCG(用带空心标记的实线表示)、hCG(α31-β37，α51-β99)(用带实心标记的虚线表示)抑制125I-hCG结合表达LH受体的CHO细胞的能力。
图30描述了hCG(用带向下三角的实线表示)和hCG(α31-β37，α51-β99)(用带圆圈的实线表示)在表达LH受体的CHO细胞内刺激信号转导的能力。
图32A和32B显示了αC27A(图32A)和hFSHβY31C(图32B)的氨基酸序列，αC27A是一种预计可用来制备通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键稳定化的hCG，hLH，hFSH和hTSH类似物的α亚基类似物，hFSHβY31C是一种预计可用来制备通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键稳定化的hFSH类似物的β亚基类似物。该图用小写字母氨基酸单字母密码描述了α亚基类似物和hFSHβ亚基类似物的氨基酸序列。预计αC7A氨基酸序列中用大写字母表示的α亚基中以丙氨酸替代Cys7和实施例1和2中描述的用丝氨酸替代Cys7有相同的效果。hFSHβY31C序列中31位的半胱氨酸残基的存在也用大写字母表示。表达该FSHβ亚基类似物以及αC7A或已经被鉴定为αC7S的α亚基类似物的细胞预计将分泌出具有FSH活性的二硫键交联的异二聚体蛋白。hFSHβY31C的这一信号序列与hFSHβ-亚基相同，因此，预计它象hFSHβ亚基一样加工。因此，它的N端序列将会是NSC。
图33显示了制备糖蛋白激素类似物的遗传密码。
图34A和34B显示了αQ5C(图34A)和hCGβR8C(图34B)的氨基酸序列，αQ5C是一种预计可用来制备通过α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定化的hCG，hLH，hFSH和hTSH类似物的α亚基类似物，hCGβR8C是一种预计可用来制备通过α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定化的hCG类似物的β亚基类似物。该图描述了一个α亚基类似物以及一个hCGβ亚基类似物的编码序列，当这两者共同表达时，预计会形成一个具有LH活性的二硫键交联的激素类似物。该蛋白的氨基酸序列及其信号序列以单字母密码描述。大写字母表示形成亚基间二硫键所需突变的位置。
图35显示了hFSHβS2C的氨基酸序列，它是一种hFSHβ亚基类似物，预计可用来制备通过α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定化的hFSH类似物，其中Ser2被转变成半胱氨酸。共同表达αQ5C(以前描述的)和hFSHβS2C的细胞预计将产生一个基本上有FSH活性的二硫键交联的异二聚体。
图36显示了hLHβY37C的氨基酸序列，它是一种β亚基类似物，预计可用来制备通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键稳定化的hLH类似物，小写字母代表氨基酸单字母密码。用大写字母表示37位存在半胱氨酸残基。表达该LHβ亚基类似物和以前鉴定为αC7S或αC7A的α亚基类似物的细胞预计将分泌出具有LH活性的二硫键交联的异二聚体蛋白。hLHβY31C的这一信号序列与hLHβ-亚基的相同，因此，预计它象hLHβ亚基一样被加工。因此，其N端序列将会是SRE。
图37显示了hLHβW8C的氨基酸序列，它是一种β亚基类似物，预计可用来制备通过α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定化的hLH类似物，其中Trp8被转变成半胱氨酸。共同表达αQ5C(以前描述的)和hLHβW8C的细胞预计将产生一个有LH基本活性的二硫键交联的异二聚体。
图38显示了hTSHβY30C的氨基酸序列，它是一种β亚基类似物，预计可用来制备通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键稳定化的hTSH类似物，小写字母代表氨基酸单字母密码。用大写字母表示30位存在半胱氨酸。表达该TSHβ亚基类似物和以前鉴定为αC7S或αC7A的α亚基类似物的细胞预计将分泌出具有TSH活性的二硫键交联的异二聚体蛋白。hTSHβY31C的这一信号序列与hTSHβ-亚基的相同，因此，预计它象hTSHβ亚基一样被加工。因此，其N端序列将会是FCI。
图39显示了hTSHβF1C的氨基酸序列，它是一种β亚基类似物，预计可用来制备通过α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定化的hTSH类似物，其中Phe1被转变成半胱氨酸。共同表达αQ5C(前面描述的)和hTSHβF1C的细胞预计将产生一个基本有TSH活性的二硫键异二聚体。
图40示出了αC7S密码子的构建。
图41示出了pSVL-CFC101-114β′的构建。
图42示出了pSVL-CVC94-114β′的构建。
图43示出了pSVL-CFC101-106β′的构建。
图44示出了pSVL-αK51C的构建。
图45显示了hFSH以及类似物αV76C+hFSHβV38C在表达人FSH受体的CHO细胞中刺激环腺苷酸累积的能力。
图46显示了hCG以及类似物α+hCGβR6C，Y37C在表达LH受体的CHO细胞中刺激环腺苷酸累积的能力。
发明详述本发明的糖蛋白激素类似物代表了超过CA2188508和Han等人(1996)通用说明的改进之处。亚基间二硫键使糖蛋白激素异二聚体的α和β亚基稳定。改进的类似物被特别设计成减少激素三维结构的微扰，因而更有可能在体内形成二聚体，形成的二聚体将对天然受体有亲合力，并对其有拮抗活性。
本文所用的术语“类似物”指糖蛋白激素选自人绒膜促性腺激素(hCG)、人促黄体素(hLH)、人促卵泡激素(hFSH)、人促甲状腺激素(hTSH)，及其功能性突变蛋白，其中对它们的α和β亚基的氨基酸序列作修饰，在每个亚基内产生游离的半胱氨酸来形成亚基间二硫键，从而使异二聚体稳定。
本文所用的术语“突变蛋白”指经修饰的、但未经修饰以产生亚基间二硫键的糖蛋白激素hCG、hLH、hFSH和hTSH，它们基本上(至少80％)保留了它们的功能性生物活性，例如受体亲和性和激素效能、抗体识别性，或针对不同的糖蛋白激素而言提高它们的亲和性或特异性(嵌合型糖蛋白激素会产生这种情况)，无论这些突变蛋白是否表述成具有功能。
为了产生糖蛋白激素的突变蛋白，可用本领域中认同的任何方法修饰蛋白。方便起见，修饰可分为在合适宿主细胞中表达编码修饰蛋白的修饰基因来实现的那些修饰(称为“突变”)，或是并非在细胞中表达的那些修饰(称为“衍生”)。
尽管通常衍生物的制备是首先合成前导分子然后再衍生，但是也可直接制备衍生物。然而，术语“衍生物”的隐含意义是通过修饰前导分子用可行技术获得衍生物，即使那不是较佳的生产方法。
对蛋白的修饰可分为下列几类有利的—这些修饰增强了特定用途蛋白的效用。
中性—这些修饰既不增强也不削弱特定用途蛋白质的效用。
不利的—这些修饰削弱(但不一定消除)了特定用途蛋白的效用。
灭活性—这些修饰消除了特定用途蛋白的效用。
可以忍受的—这些修饰是有利的、中性、或不利的，但是并非灭活。
由于蛋白可能有一种以上的用途，因此一种修饰可能对一种用途有利、对第二种用途不利、对第三种用途呈中性，而对第四种用途为灭活。
通常，对于蛋白特定结构或多或少有特异性的用途(而不是仅取决于蛋白质氨基酸组成、分子量或总体物理性质的用途)将讨论修饰对蛋白适合性的影响。
蛋白可出于各种原因被修饰，包括一种或多种下列目的
·为了使分子更容易被检测，例如放射性标记的、酶标记的和荧光标记的衍生物；·为了使分子对特定的物理、化学或生物因素(例如热、光、氧化剂、还原剂和酶)更稳定；·为了使分子在感兴趣的溶剂中更易溶(例如有助于给药)或更难溶(例如促进其沉淀或使其用于捕获其它分子)；·为了限制分子能参与反应的性质(例如将保护基团置于氨基酸侧链)，或相反地，用来扩展可能的反应(例如将反应基团置于分子上以促进随后的偶联反应)；·为了使分子的免疫原性更弱(或更强)；·为了增加(或减少)分子在给予对象后在特定器官或组织中的停留时间，或加速(或减慢)分子到达特定器官或组织；·为了增强(或削弱)分子的一种或多种生物学或免疫学活性，例如增加或减少分子其对受体的亲和性，或改变其特异性；或·为了赋予新活性以补充原先的天然活性(例如将毒素和抗肿瘤抗体连接)；或·为了抑制分子的不需要的负效应。
蛋白质大多数的残基能耐受一定程度的突变。突变形式可以是单个或多个替代、插入或缺失。较佳的是，插入或缺失发生在分子的末端、表面环或结构域间的边界上。
末端插入(更合适地应称为“增加”或“融合”)没有较佳的最大值。常规方法是将一种蛋白和另一种蛋白融合以促进表达，或提供具有其成分生物活性的组合的融合蛋白。融合蛋白可用作一种前体，它能断裂释放活性蛋白，即使融合蛋白本身缺少活性。
对于末端缺失，更合适地应称为“截短”，这种修饰的目的非常重要。常规的方法是，当感兴趣的仅仅是蛋白的免疫学性能时，将该蛋白充分地截短。人们可以将一个蛋白减至小到5个氨基酸的表位，并用其自身来引发T细胞应答，或和其自身拷贝或免疫原性载体偶联来引发B细胞应答。当它生物活性必须保留时，对截短的限制可能将更严格。
较佳的是，在考虑了替代和任何内部缺失和插入后，突变体的序列和原来的蛋白质至少有50％(更佳的至少80％)相同。
蛋白可能更耐受下列突变(a)突变是替代而不是插入或缺失；(b)突变是在末端而不是内部的插入或缺失，或如果突变在内部，则突变在环中或结构域间的接头中；(c)突变影响的是表面残基而不是内部残基；
(d)突变影响远离结合部位的分子部分；(e)突变是一个氨基酸被另一个大小、电荷和/或疏水性相似的氨基酸替代；和(f)突变所在部位实际上是在感兴趣的蛋白所属的同源蛋白家族中的变化。
这些考虑可用来设计功能性突变体。
较佳的对于读框残基来说，更佳的对于整个链来说，修饰蛋白的预计的或试验测得的三维结构具有这样一条主链(Cα碳)构型，它和原先天然蛋白的预计的或试验测得的三维结构的均方根偏差宜小于5，更佳的小于3，还要佳的小于2，最佳的小于1。
蛋白三维结构的测定对于人们设法修饰蛋白用于有用的目的或至少是避免灭活性修饰提供了相当多的指导。如果知道了全部三维结构，实践者就能知道那些残基在表面上，那些在内部，那些具有指向外部的侧链，那些残基被紧密包裹而那些没有，链在何处可屈曲，在何处受约束，那些残基在二级结构中，那些残基因链折叠而相互毗邻，那些残基可能以H键和盐桥形式相互作用。
表面残基的突变比内部残基更容易被耐受。内部残基的突变更有可能使蛋白不稳定，从而通过蛋白变性影响其整个结合活性。表面残基处的突变可能对结合活性没有一点影响，或可能影响了一些活性，但不影响其它活性。无论如何，它们都不可能使蛋白变性。
测定蛋白的全部三维结构的主要方法是X射线晶体学和NMR光谱学，而获得高分辨率X射线衍射数据的主要障碍是结晶化步骤。hCG的高分辨率晶体结构从两个实验室(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)获得，并作为hLH，hFSH和hTSH的模型。
就较小的蛋白(较佳的是小于20kDa)而言，核磁共振(NMR)光谱也可用来描述三维结构。关于NMR结构测定的用途参见McIntosh等人1987年的著作。NMR也能提供较大蛋白结构的部分信息。用重组DNA技术或可控制的蛋白水解方法可以分开产生较大蛋白的特别感兴趣的区域，然后用NMR研究。
各种光谱变化拌有某些氨基酸环境电荷的改变。如果将氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸移动到极性较低的环境中，λmax和ε增加。因此，如果在极性溶剂中这些氨基酸之一的λmax和ε较高，则对于其游离氨基酸和相同的溶剂来说，该残基必定被非极性氨基酸包围和屏蔽。另外，如果蛋白光谱对溶剂极性的变化敏感，则所关注的氨基酸必定在表面上。氨基酸的另一个例子是，如果可滴定基团(例如酪氨酸的OH、组氨酸的咪唑、和半胱氨酸的SH)带电荷，则λmax和ε始终增加。因此，通过将特殊变化和pH变化关联起来，可能能推导出可滴定基团在表面上还是被包埋。通过比较(溶剂)分子具有不同平均直径的溶剂所得的结果，可能能将深裂隙中的残基和完全在表面上或完全包埋的那些残基区分开来。
除了用于确定特定残基的位置外，这些光谱技术还能帮助解决X射线和NMR分析中的不确定处。
氨基酸特异性化学亲和标记可用来查出哪些残基实际上是外露的。最有用的标记可能是与带电荷残基反应的那些标记，因为那些标记最可能出现在表面上。样品标记包括下列
然后使标记的和未标记的蛋白分开受片段化试剂(例如溴化氰、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或亚碘酰基苯甲酸)的作用。用二维电泳比较标记蛋白断裂产生的肽和从天然蛋白衍生的那些肽。对迁移率改变的肽测序，确定已修饰的氨基酸。
Adachi等人(1989)用Arg和Lys特异性试剂来研究这些残基在EC-SOD的催化和肝素结合活性中的作用。他们发现，这些残基的修饰结果减弱了这些活性；然而，他们没有辨明那些残基已经被修饰。
表面残基还可用光亲和标记来鉴定，这些光亲和标记在光照时形成高度活性的中间产物，例如氮宾和卡宾。这些物质能插入C-H键，因此能和任何可及的氨基酸反应。出于这个原因，现已用光亲和标记来研究膜拓扑图。一些蛋白在膜的四周，其它一些与膜成为一体。
非特异性标记试剂的另一个例子是氚。可以使折叠蛋白氚化(用氚化水交换氢)、变性并变成片段，对片段测序并测试放射活性氚的存在。
所有这些标记方法还可用来确定残基(除了在表面上之外)是否还是结合部位的一部分。将游离蛋白标记后获得的标记分布与复合蛋白标记后获得的分布比较。由于在复合物中结合伙伴封闭了结合蛋白的结合部位残基，因此游离蛋白中的结合部位残基应当被标记，而复合蛋白中的则没有被标记。
通常，在序列和功能相似的蛋白家族中，表面残基比内部残基更可能改变。这更可能的原因是表面残基不可能参与与其它残基的相互作用，这种相互作用是维持蛋白整体构型所必需的。
鉴定蛋白表面残基的最可靠的方法是用X射线衍射测定蛋白的三维结构。即使是不完整的三维结构也能用来设计突变体。迁移率高的残基(通过高于平均晶体学热系数证明)是最不易发生失去稳定突变的那些残基。见Alber等人(1987)。
尽管在表面位置可进行许多氨基酸替代而不会产生不利的影响，但是内部位置的替代却会使蛋白严重地不稳定。在同源蛋白家族内，最保守的残基除了功能性氨基酸外就是被包埋的那些残基。
对蛋白折叠自由能、进而是蛋白稳定性的主要贡献来自包埋在内部的疏水性侧链，从而将它们和溶剂隔离。堆积密度通常很高。通常，蛋白对改变核心残基体积的突变的耐受能力更大程度上取决于整个核心残基体积中的净电荷，而不是单个残基体积变化量。换句话说，核心位置体积的增加可以补偿另一个核心位置体积的减少。较佳的是，整个核心残基体积中的净电荷不超过10％，更佳的不超过5％。见Lim等人(1989)；Lim等人(1992)。
在没有相反证据的情况下，所有被鉴定成是内部残基的残基可能被假定成是单个核心的一部分。然而，蛋白质可能折叠形成几个不同的核心，上述体积保守规则应分开应用于每个核心。
蛋白包埋核心的结构不仅取决于包埋的每个氨基酸(如果有的话)的倾向，而且还取决于该氨基酸在蛋白质中出现的总频率。最常见的包埋残基是(按递减次序)Val、Gly、Leu、Ala、Ile和Ser。
Lim等人(1992)报道，用亲水性氨基酸(Asn，Gln)代替蛋白核心中的单个疏水性氨基酸(Leu，Val)可防止蛋白完全折叠并破坏生物活性。
包埋的Cys(-S-S-形式)、Asp、Gly、His、Pro和Trp在同源蛋白中有70％以上的可能不带电荷。因此，如果这些残基出现在感兴趣蛋白内被包埋的位置中，则最好使它们不带电荷。它们的保守性可作如下解释Cys(二硫键键合)、Asp(带电荷但有刚性的侧链)、Gly(链的柔韧性)、His(在生理pH下带电荷和不带电荷状态均有)、Pro(唯一的链几何结构)和Trp(最大的侧链)。
其它残基(除Met外)在倍包埋隐蔽时有40-60％的可能不带电荷(Met只有26％的可能不带电荷，但是它有25％的可能被Leu代替)。
下列包埋残基替代的可能性超过10％Ala→Val，Glu→Gln，Phe→Leu，Ile→Leu，Ile→Val，Lys→Arg，Leu→Ile，Leu→Val，Met→Leu，Met→Val，Asn→Asp，Asn→Ser，Arg→Lys，Arg→Gln，Ser→Ala，Thr→Ser，Val→Ile，Val→Leu，Thr→Phe，Cys(-SH)→Ala下列替代的可能性在5-10％范围内Ala→Ser，Asp→Asn，Glu→Arg，Glu→Val，Phe→Ile，
Phe→Val，Phe→Tyr，His→Val，Leu→Phe，Met→Ala，Met→Ile，Gln→Glu，Gln→His，Gln→Met，Ser→Gly，Ser→Thr，Thr→Val，Val→Ala，Trp→Phe，Tyr→Leu，Cys(-SH)→Ser.
见Overington等人(1992)表5。
最相容的交换基团看来是(Arg，Lys)、(Leu，Ile，Met，Val，Phe)和(Ser，Thr，Ala)。然而，Ala和Val似乎相当容易混淆。
因此，通常最好完全避免突变包埋的残基。然而，如果它们被突变，则应限制核心体积中的总体变化，最好应将突变限制为一个残基用另一个残基代替，这种典型替代可能性超过0(较佳的至少5％，最佳的至少10％)。包埋的Cys(-S-S)、Asp、Gly、His、Pro和Trp的突变应当避免，这是不需要其它证据的正当理由。最安全的核心突变是一个疏水性氨基酸交换成另一个，以及Arg和Lys交换(或相反)。
然而，可以用内部残基的合理突变来改进蛋白的稳定性。这些突变可印入与本来的结构相容的增加的稳定化相互作用(氢键、离子对)，或通过用较大的氨基酸代替较小的氨基酸或用支链或芳族侧链代替线性侧链来减少附近的相互作用基团的迁移率。见Alber等人(1987)。
更重要的是，除了对上述糖蛋白激素中残基修饰的概述外，关于糖蛋白激素(尤其是hCG)的区域也有大量可获得的信息，这些区域在结合糖蛋白激素受体后可能外露或不外露，并且不破坏激素受体相互作用(即受体亲和性和激素效力)。关于可被安全修饰的残基和区域的这些可获得的信息在相关技术章节中以及本说明书其它处有所描述。因此，根据本文所述的以及从科学文献获得的大量结构和功能的资料，本领域技术人员很容易对糖蛋白激素的氨基酸序列作出不破坏其功能的修饰。
另外，糖蛋白激素的功能性突变蛋白包括嵌合的糖蛋白激素，其中糖蛋白激素的一个或多个残基或区域，即β亚基座位系带，被另一个糖蛋白激素的对应的残基或区域代替，这种代替例如可能改变了受体结合特异性。本说明书中将讨论影响受体结合特异性等的一些残基和区域例子。
糖蛋白激素突变蛋白还包括单链糖蛋白激素，其中α-和β-亚基被翻译成单链并正确折叠成其异二聚体构型。
下面概述了一种可用来鉴定具有形成二硫键可能的残基的程序。如下列实施例所证明的，并非所有的使hCG异二聚体及其类似物稳定化的二硫键都保留了其全部的生物学效力。然而，在半胱氨酸结节之间导入亚基间二硫键能提高蛋白质的稳定性而不破坏激素效力。
本发明的二硫键交联的糖蛋白激素类似物可如下制得在每个亚基中产生游离的半胱氨酸，这些游离的半胱氨酸能交联形成一个或多个亚基间二硫键。这可通过用半胱氨酸的密码子代替一个或多个氨基酸的密码子或用其它任何氨基酸的密码子代替已有二硫键中半胱氨酸残基密码子来实现。然而，不能期望所有的这些替代都会产生亚基间二硫键。这里描述了在设计类似物时应考虑的两个因素。
1)最有用的二硫键交联的糖蛋白激素类似物预计将具有类似于hCG，hLH，hFSH或hTSH的结构。因此，二硫键不应使蛋白的整个构型有很大的扭曲。从表1B中数据可以预测预计对蛋白构型破坏性影响最少的二硫键位置，该表描述了hCGα亚基中选定氨基酸(每对栏目的左栏)与hCGβ亚基的一个或多个邻近残基(每对栏目的右栏)的Cα和Cβ碳原子之间的大致距离。这些数值可以用几种熟知的、广泛使用的且公众可得到的分子模型软件包(包括Sybyl，Insight，Rasmol和Kinemage等一些名字)从hCG的晶体结构计算出。表1B中所示的hCGα亚基中的氨基酸残基和邻近的hCGβ亚基的一个或多个残基之间的距离，很容易从公开的hCG晶体结构数据(Lapthorn等人，1994；Wu等人，1994)计算出。
表1B选定hCGα-和β-亚基残基的Cα和Cβ碳原子之间的大致距离
*[Cα碳之间的距离()，Cβ碳之间的距离()]与每个β亚基残基有关的括号内每对数值的左面数值表示β亚基残基Cα碳原子与左栏内对应的α亚基残基之间的距离。括号内每对数值的右面数值表示这些残基的Cβ碳原子之间的对应距离。原理上，用半胱氨酸代替这些残基配对将允许形成亚基间二硫键，只要两个亚基内不存在其它干扰性半胱氨酸。并非所有的半胱氨酸配对形成亚基间二硫键的可能性都相同。预计对异二聚体构型影响最少的亚基间二硫键的形成将受其组成半胱氨酸侧链原子取向的影响。放置二硫键的有利和较佳的位置包括Cβ碳原子之间的距离小于Cα碳原子之间距离的氨基酸配对。放置亚基间二硫键的最有利和最佳的位置是Cα和Cβ碳原子之间距离与天然存在的二硫键类似(即分别约为5.0-6.5和3.5-4.2)的那些配对。
因此，产生Cα碳原子相距4-8、Cβ碳原子更近1-2的半胱氨酸亚基间配对的替代，预计将最有机会形成对整个蛋白结构影响最小的二硫键，和/或最有机会促进两个或多个分子的分子间交联。实际上，如实施例所示，本发明的这种“拇指(thumb)”规则已经成功地产生了几种保留hCG许多免疫学和激素性能的二硫键交联的hCG类似物。
2)最具活性的二硫键交联的糖蛋白激素类似物预计将在受体结合或信号转导不需要的部位和/或激素活性构型稳定化不需要的部位含有交联键。已经知道，糖蛋白激素中有大量残基是其生物活性所不需要的。这些残基包括半胱氨酸结节中的大多数N端残基(即天然α亚基中的第二个半胱氨酸和天然β亚基中的第一个半胱氨酸)。例如，已经制得了高效的hFSH类似物，其中FSHβ亚基残基(Asn1，Ser2)被其hCG对应物(Ser1，Lys2，Glu3，Pro4，Leu5，Arg6，Pro7，Arg8)代替。因此，分子的该区域中通过用半胱氨酸代替hCGα亚基Gln5和β亚基Arg8产生的二硫键预计不会消除二硫键交联的异二聚体的LH活性。类似地，通过用半胱氨酸代替hFSHα亚基Gln5和β亚基Ser2产生的二硫键预计不会消除二硫键交联的异二聚体的FSH活性。通过将α亚基Cys31改变成Ala或Ser，和用Cys代替hCGβ亚基Arg6，或在FSHβ亚基的N端增加Cys，预计可以在hCG或hFSH的α和β亚基的N端区域产生二硫键。预计该二硫键不会破坏此二激素类似物任何一个的活性。
hCG的晶体结构揭示，其每个亚基由半胱氨酸结节组成。因此，每个亚基含有称为α1、α2、α3和β1、β2、β3的三个环。另外，β亚基有额外的20个氨基酸，它们称为“座位系带”，围绕α2固定异二聚体，并在构型上使其稳定化使能结合其唯一受体。促黄体素、促卵泡激素和促甲状腺激素中的半胱氨酸位置提示，所有这三个分子具有类似的整体折叠方式，且hCG的晶体结构将是导入亚基间二硫键的合理指导。然而，FSH和TSH的结构还未确定，这只能从hCG的结构来推断。每个亚基的半胱氨酸结节的晶体结构均显示各自高度相似。这是因为它们受三个组成的二硫键的高度约束。因此，预计半胱氨酸结节内及毗邻的残基在每个激素中有类似的构型。另外，在所有三类激素中在环β1和β3中相似位置上均有一个半胱氨酸。它们在hCG中形成了二硫键，预计在所有糖蛋白激素中都将形成二硫键。hCG的这些环中的骨架原子内和之间的此二硫键和大量氢键提示，所有三个激素种类中的β1和β3的构型非常相似。环α1和α3也含有几个氢键，这提示分子的这部分在所有三个激素种类中也类似。这一观点得到以下观察结果的支持，即游离α亚基的NMR结构显示，α1和α3即使不在异二聚体中时也具有相似的构型(DeBeer等人，1996)。尽管所有三种激素的其它部分在构型上与hCG差不多相似，但是它们不可能象上述分子部分那样和hCG结构密切相关。例如，β2含有相对较少的内部氢键和/或和α1和α3接触。由于它看来并非如hCG中那样高度受约束，因此没有理由相信它的结构与其它激素的结构完全相同。实际上，TSH中的环β2比hCG或hFSH中的大2个氨基酸残基。α2的N端和C端参与大量的氢键接触，而α2的C端部分也接触β1。因此，α2的这些部分可能在大多数激素中相似。然而，α2的中央部分只和座位系带(在三种激素中并不是非常保守的蛋白区域)接触。α亚基的NMR结构表明α2是高度无序的，该观察结果提示，hCG中激素的这部分在异二聚体中有秩序良好的结构仅仅是因为它被夹在β1、β3和座位系带之间。座位系带中的差异预计会改变α2的构型，尤其是不靠近半胱氨酸结节的那些部分。
本发明者通过用免疫学探针研究能结合促黄体素和促卵泡激素受体的hCG类似物，已经洞察了座位系带对激素结构的影响。这些数据提示，座位系带的组成能改变激素构型。相似的数据还提示，激素构型能受受体影响。例如，结合位点已部分确定的单克隆抗体(Moyle等人，1990；Moyle等人，1995)已被用来研究双功能性hCG类似物(CF101-109)在游离时以及结合LH和FSH受体时的构型。已通过用hFSH座位系带残基95-103代替hCG座位系带残基101-109来制得CF101-109(Moyle等人，1994)。CF101-109被单克隆抗体识别的能力表明，座位系带中FSH残基的存在改变了两个亚基间的相互作用。因此，A407(一种针对包括hCG而不是hFSHα亚基N端残基的构型表位的抗体)大大减少了对CF101-109的亲合力，即使其表位远离突变部位(表1C)。通过在结合LH受体时能A407识别CF101-109但结合FSH受体时不能识别的这一事实(表1D)，可见受体对激素结构的影响。识别全部位于α1和/或α2内或β1和/或β3内的表位的其它抗体即使在CF101-109结合受体时也识别CF101-109。
综合起来，这些观察结果提示，激素内亚基的位置可能不相同，并可能受到与其受体相互作用的影响。因此，本发明者确定，除了考虑从hCG晶体结构获得的可进行半胱氨酸替代的相对位置和取向外，还应考虑这样一个可能hCG的晶体结构将代表促卵泡激素和促甲状腺激素的结构和/或激素-受体复合物中激素的构型。最有可能与hCG中的该部分相同、且最不可能在受体相互作用时被改变的激素部分包括在半胱氨酸结节之中或附近的残基。
表1C用抗hCGα亚基单克隆抗体识别hCG、hFSH和hCG/hFSH嵌合体
注意嵌合体通过hCG的残基被hFSH的残基代替来鉴定。因此，CF94-97指hCGβ亚基残基94-97被其FSH对应物替代的类似物。hCGβ亚基残基94-97在小的座位系带环内；101-109在座位系带的羧基端一半内；94-117在小的座位系带环、座位系带的羧基端一半、以及羧基端内；39-58在环2内以及环3的第一个残基上。hCG和嵌合体被B112(上行)和B410(下行)捕获。hFSH被抗体B602捕获。数值代表一式三份的平均值，并相对于hCG标准化(显示成100％)。当其与LHR复合时，只有A105和A407还和hCG结合(Moyle等人，1995)。
表1D放射性标记的抗体和与大鼠LHR或人HSFR复合的hCG或CF101-109的结合
注意形成配体受体复合物，然后如文中所述用放射性标记的单克隆抗体检测。所述数值(一式三份的平均值±SEM)是cpm减去空白值。在大多数情况下，在相同实验(用左栏数字表示)中获得结合LHR和FSHR的数据。“与B105之比”通过将每个抗体所见放射性标记量除以B015获得的量并对这些数值取平均值来计算出。除了A407对结合FSHR的CF94-117以及CF101-109的结合以外，所有数值均大于0(p＜0.05)。
半胱氨酸结节之间的区域是最具吸引力的用于工程改造二硫键的部位之一，是亚基间二硫键的较佳部位。每个亚基的半胱氨酸结节通过三个二硫键来稳定，使得其成为分子中最具刚性的部分。本发明者的实验结果表明，改变hCGβ亚基残基Tyr37对激素活性的影响相当小。因此，本发明者预计，该部位存在半胱氨酸不会改变激素活性。加拿大专利CA 2188508没有公开说明α和β亚基的半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键将使促性腺激素异二聚体稳定化，并保留激素活性。如本文实施例所示，能实现此目的的一种方式是用Ala或Ser代替α亚基残基Cys7，以破坏Cys7-Cys31的亚基间二硫键，并用Cys代替hCGβ亚基Tyr37。产生的交联的hCG类似物具有高的LH活性。类似地，在另一个非限制性例子中，可以制得一种交联的CFC101-114类似物，它是一种hCG/hFSH嵌合体，其中hCGβ亚基氨基酸残基101-114被其hFSH对应物(即β亚基残基95-108)代替。CFC101-114结合并激活LH和FSH受体。二硫键交联类似物也能结合并激活LH和FSH受体。后一观察结果表明，该二硫键没有妨碍FSH受体活性，因此hFSH中的相似的二硫键也非常有可能不破坏其激素活性。二硫键交联的hFSH的制备可这样实现使α亚基cDNA和hFSHβ亚基cDNA共同表达，α亚基cDNA中Cys7被转变成Ala，hFSHβ亚基cDNA中Tyr31被转变成Cys。半胱氨酸结节中的二硫键也能和其它地方(例如在α环2和β座位系带之间，或在α-N端和β-N端之间，这是一个较佳的实例)的另一亚基间二硫键一起出现。另外，α和β亚基的Cys结节之间形成的二硫键将游离出N端附近的残基，即αCys7Ser，它能有利地用于聚乙二醇化。
位于α和β亚基的半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键可能还符合这样一个一般规则通过将交联位置置于参与天然二硫键的两个已有(天然)半胱氨酸残基内部而不在最N端或C端天然半胱氨酸的外部(即更N端或C端)来最大程度地减少结构扰动的危险性，从而最大程度地减少亚基间交联对激素结构的潜在影响。加拿大专利CA2188508中公开和说明的亚基间二硫键没有一个符合该一般规则。
不符合上述一般规则的通过α亚基环1或3与β亚基环2之间的二硫键交联的激素类似物预计也会保留激素活性。这些区域对氨基酸替代高度顺从。因此，用牛α亚基代替人hCG或hFSH中的α亚基通常不会消除激素活性，即使牛和人α亚基在该区域中明显不同。同样，在β亚基环2中用hCG残基成批替代hFSH残基(以及反过来)不会消除任一激素的活性。因此，预计该区域中的二硫键不会破坏促黄体素或促卵泡激素的生物活性。这些二硫键包括通过将α亚基Gln27和hCG或hLHβ亚基Val44或hFSHβ亚基Val38变成Cys产生的那些二硫键。它们还包括通过将α亚基Val76和hCGβ亚基Val44或hFSHβ亚基Val38变成Cys制得的二硫键。预计保留基本活性的另一个亚基间二硫键交联的类似物是α亚基残基Lys75和hCG或hLHβ亚基残基Gln46、或hFSHβ亚基残基Lys40变成Cys的类似物。然而，后一类似物所带正电荷少于hCG或hFSH，因此其整体LH或FSH活性可能较低。还可以将亚基间二硫键插入促黄体素和促卵泡激素的其它区域。这些二硫键中的一些包括β亚基座位系带中的残基(即通过Cys替代hCGβ亚基Asp99产生)和α亚基环2中的残基(即，通过Cys替代α亚基Lys51产生)。该二硫键大大降低了hCG的LH活性以及双功能性类似物CFC101-114的LH和FSH活性。从表2-4所示的这些蛋白中α和β亚基残基的“等价”位置可以确定hLH、hFSH和hTSH中可以突变成半胱氨酸并且预计能产生二硫键的残基位置。
表2人糖蛋白激素β亚基中的等价位置(未描述前导序列)hCG SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRV..QGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPRLPGPSDTPILPQhLH SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRV..LQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL................... .
hFSH......NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE...........................
hTSH.......FCIPTEYMTHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPQCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSY...........................
注意点(.)指该位置没有残基。
表2中的信息可用来计算占据每种人激素β亚基中“等价”位置的残基。现在只获得了hCG的晶体结构。然而，由于所有糖蛋白激素的氨基酸序列有高度的相似性(尤其是它们的亚基内二硫键)，因此预计所有的激素将具有相似的形状。所有异二聚体的整体构型与hCG相似的结论还得到了下列观察结果的支持可以制得hCG/hFSH、hCG/hLH和hCG/hTSH嵌合体，这些嵌合体保留了用来衍生获得该嵌合体的先祖的区域中所见的表位。因此，预计该表中确定的等价残基的替代将使亚基间二硫键具有已经制得和鉴定的那些二硫键的类似性质。“等价位置”定义为纵坐标。因此，在hFSHβ亚基中，半胱氨酸3与hCGβ亚基的半胱氨酸9“等价”。
表3选定的脊椎动物α亚基氨基酸序列中的等价位置(未显示前导序列)人 ....APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS羊 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKS猪 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS牛 FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKPDAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNVRVENHTECHCSTCYYHKS马 FPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI大鼠LPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTKCHCSTCYYHKS小鼠LPDGDFIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS家兔FPDGEFAMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEAGCCVAKAFTKATVMGNAKVENHTECHCSTCYYHKS鸡 FPDGEFLMQGCPECKLKENRFFSKPGAPIYQCTGCCFSRAYPTPMRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKITLKDNVRIENHTECHCSTCYYHKS鲤鱼-1 YPRNDMNNFGCEECKLKENNIFSKPGAPVYQCMGCCFSRAYPTPKRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKEVKKILVNDV.KLVNHTDCHCSTCYYHKS鲤鱼-2 YPRNYMNNFGCEECTLKENNIFSKPGAPVYQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKNITSEATCCVAKEFKQVLVNDI.KLVNHTDCHCSTCYYHKSEur.Eel YPNNEMARGGCDECRLQENKIFSKPSAPIFQCVGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKNITSEATCCVAREVTRL...DNMKLENHTDCGCSTCYYHKF鳗鱼YPNNEISRGGCDECRLKDNKFFSKPSAPIFQCVGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVPKDITSEATCCVAREVTKL...DNMKLENHTDCHCSTCYYHKS鲑鱼-1 YQNSDMTNVGCEECKLKENKVFSNPGAPVLQCTGCCFSRAYPTPLQSKKAMLVPKNITSEATCCVAKEGERV.VVDNIKLTNHTECWCNTCYHHKS鲑鱼-2 YPNSDKTNMGCEECKLKPNTIFPNPGAPIMQCTGCCFSRAYPTPLRSKQTMLVPKNITSEATCCVAKEGERVTTKDGFPVTNHTECHCSTCYYHKS注意点(.)指该位置没有残基。
表3中的信息可用来计算占据每种激素α亚基中“等价”位置的残基。仅有hCG的晶体结构已经报道。由于所有糖蛋白激素的氨基酸序列高度相似，尤其是它们的亚基内二硫键，因此预计所有种类的激素将具有相似的形状。这一观点还得到了下列观察结果的支持可以制得人/牛α亚基嵌合体，该嵌合体保留了嵌合体中所见的其先祖区域中发现的表位。因此，预计该表中确定的等价残基的替代将使亚基间二硫键具有已经制得和鉴定的那些二硫键的类似性质。
表4选定脊椎动物β亚基序列中的等价位置(未显示前导序列)hCG SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRV..LQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ....
hLH SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRV..LQAVLPPLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDCGGPKDHPLTCDHPQLSGLLFL............................
cCG SRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRV..MPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTSdLH SRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVEITFTTTICAGYCPSMVRV..LPAALPPVPQPVCTYHELHFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGPCRLSNSDCGGPRAQSLACDRPLLPGLLFL............................
cLH LGGGGRPPCRPINVTVAVEKDGCPQCMAVTTTACGGTCRTREPV..YRSPLGPPPQSACTYGALRYERWALWGCPLGSDPRVLLPVALSCRCARCPMATSDCTVQGLGPAFCGAPGGFGGE..............................
bLH SRGPLRPLCQPINATLAAEKEACPVCITFTTSICAGYCPSMKRV..LPVILPPMPQRVCTYHELRFASVRIPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCRLSSTDCGGPRTQPLACDHPPLPDILFL............................
oLH SRGPLRPLCQPINATLAAEKEACPVCITFTTSICAGYCPSMKRV..LPVILPPMPQRVCTYHELRFASVRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCRLSSTDCGPGRTQPLACDHPPLPDIL..............................
lLH PEPARGPLRPLCRPVNATLAAENEACPVCITFTTSICAGYCPSMVRV..LPAALPPVPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPEVSFPVALSCRCGPCRLSSSDCGGPRAEPLACDLPHLPG.............................
sGTH SLGQ..P.CQPINQTVSLEKEGCPTCLVIRAPICSGHCVTKEPV..FKSPFSTVTQHVCTYRDVRYEMIRLPDCPPWSEPHVTYPVALSCDCSLCNMDTSDCTIESLQPDFCITQRVLTDGDHW..........................
sGTH1 .GTECRYGCRLNRMTIIVEREDCHGSITITT..CAGLCETTDLN..YESTWLPRSQGVCNFKEWSYEKVYLEGCPSGVEPFFI.PVAKSCDCIKCKTDNTDCDRISMATPSCIVNPLEN...............................
sGTh2 SLMQ..P.CQPINQTVSLEKEGCPTCLVIQTPICSGHCVTKEPV..FKSPFSTVIQHVCTYRDVRYETIRLPDCPPWVDPHVTYPVALSCDCSLCNMDTSDCTIESLQPDFCITQVLTDGDMW...........................
hFSH ......NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE...............................
eFSH ......NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATACHCGKCNSDSTDCTVRGLGPSYCSFGDMKE...............................
oFSH .......SCELTNITITVEKEECSFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSDIER...............................
bFSH .......SCELTNITITVEKEECGFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YRDPARPNIQKFKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCSKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFREIKE.............................
pFSH ......NSCELTNITITVEKEECNFCISINTTWCAGYCYTRDLV..YKDPARPNIQKTCTFKELVYETVKVPGCAHHADSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFSEMKE...............................
rFSH .......SCELTNITISVEKEECRFCISINTTTTWCEGYCYTRDLV..YKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE.............................
hTSH .......FCIPTEYMTHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPQCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSY...............................
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dLG 缩写h，人；e，马；d，狗；c，鸡；b，牛；o，羊；l，兔；s，鲑鱼；p，猪；r，大鼠；m，小鼠注意点(.)指该位置没有残基表4中的信息可用来计算占据每种脊椎动物β亚基中“等价”位置的残基。
本发明的实施例描述了怎样将二硫键导入能结合LH、FSH和/或TSH受体的糖蛋白激素和类似物。亚基间二硫键的存在增强了hCG以及具有显著的FSH和TSH活性的hCG类似物的稳定性。因此，预计增加亚基间二硫键也能使该激素家族中的其它成员以及相关类似物稳定。当二硫键位于不参与受体结合或不涉及受体结合特异性的激素部位时，二硫键不妨碍激素功能。实际上，一些亚基间二硫键能增强激素类似物的功能。除了一个例外(Blithe等人，1991)，激素亚基几乎都没有内分泌活性。因此，使异二聚体稳定的方法可能能延长这些激素的生物活性，并且预计能增强它们的治疗用途。
本发明改善异二聚体糖蛋白激素稳定性的方法包括鉴定每个亚基中能被取代从而产生游离半胱氨酸的残基，游离的半胱氨酸很有可能形成亚基间二硫键，该亚基间二硫键将改善异二聚体的稳定性而不扭曲激素蛋白的整个构型。在每个亚基中取代这些残基产生游离的半胱氨酸可通过在α和β亚基的核苷酸序列中取代对应的密码子来在基因水平上实现。培养经重组DNA分子(携带有编码α和β亚基并与启动子序列操作性相连的修饰的核苷酸序列)转化的、能表达经修饰的糖蛋白激素的宿主细胞，并表达修饰的糖蛋白激素(本发明称为类似物)。然后，回收表达的糖蛋白激素类似物，并用糖蛋白激素纯化领域熟知的技术纯化。
在基因水平上，用本领域熟知的任何合适的定点诱变技术(如Ausubel等人，《当代分子生物学方法》Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience(New York，1987-1997)中第8章“克隆DNA的诱变”所述)产生本发明的糖蛋白激素类似物。该《当代分子生物学方法》出版物被纳入本文作参考，它是阐述重组DNA技术总原理的标准参考课本。
重组DNA分子中所含的编码糖蛋白激素类似物α和β亚基的核苷酸序列可以插入能在宿主细胞中表达该类似物的合适表达载体中。为了能够表达糖蛋白激素类似物，表达载体应当具有特定的核苷酸序列，这些序列含有转录和翻译调控信息，与编码亚基的DNA相连，从而允许糖蛋白激素类似物的基因表达和生产。首先，为了使基因被转录，它前面必须有可被RNA聚合酶识别的启动子，聚合酶和该启动子结合，从而启动转录过程。
如果DNA所含核苷酸序列含有转录和翻译调控信息且这些序列和编码多肽的核苷酸序列“操作性相连”，则称该DNA“能表达”该多肽。操作性相连是指DNA调控序列和待表达DNA序列以允许基因表达的方式连接。基因表达所需的调控区通常包括启动子区域以及在转录成RNA时会传递启动蛋白质合成信号的DNA序列。这些区域通常包括参与转录和翻译启动的5′非编码序列。在哺乳动物和昆虫细胞系统中有各种启动子常用于高水平蛋白表达。
将含有编码本发明类似物α和β亚基的核苷酸序列以及操作性相连的转录和翻译调控信号的重组DNA分子插入一个或多个载体中，该载体能在宿主细胞中瞬时表达亚基或能将所需的基因序列整合到宿主细胞染色体内。为了能选择其染色体中已经稳定整合了导入的DNA的细胞，采用一种或多种允许选择含有表达载体的宿主细胞的标记。标记能为营养缺陷型宿主提供原养型，杀生物剂抗性(例如对抗生素或重金属(如铜)等的抗性)。可选择的标记基因可直接连接待表达的DNA基因序列，或通过共转染导入同一细胞中。为使mRNA的合成最优，可能还需要其它额外的元件。这些元件可能包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。插入这些元件的cDNA表达载体包括Okayama(1983)中描述的那些。
能在转染真核宿主细胞后高水平瞬时表达所需蛋白的表达载体是本领域中熟知的，通常是公众能获得的或在商业上能从分子生物学供应商购得(例如质粒pcDM8，购自Invitrogen，San Diego，CA；pSVL，购自Pharmacia，Piscataway，NJ；pCI，购自Promega，Madison，WI；等)。一旦制得了用于表达的含有构建物的载体或DNA序列，就可用各种合适的方法将表达载体导入合适的宿主细胞中，这些方法例如是转化、转染、脂转染、偶联、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。
真核宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、猴(COS细胞)、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。然而，昆虫细胞(如 杆状病毒)能过量生产多肽，并且也能进行翻译后多肽修饰(包括糖基化)。COS、CHO和昆虫细胞中的异位蛋白表达是本领域熟知的，可以合适地采用例如Ausubel等人(1987-1997)章节16.9-16.14“用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达蛋白以及在哺乳动物细胞中表达蛋白”中所述的方法。可对表达糖蛋白激素类似物的α和β亚基的转化宿主细胞培养，以产生类似物。
可培养表达糖蛋白激素类似物α和β亚基的转化宿主细胞来产生糖蛋白激素类似物，然后用常见的熟知的糖蛋白激素纯化技术进行回收和纯化。产生的糖蛋白激素的量可用如实施例1所述的夹心免疫试验方法作定量测定。另外，测定本发明糖蛋白激素类似物的受体亲和性以及生物活性的试验(如实施例1中描述的放射性配体受体和信号转导试验(测定结合受体引发环腺苷酸累积应答的能力))也很容易进行而无需过多试验。
本发明的糖蛋白激素类似物有几种治疗用途。hFSH类似物可用来在准备女性排卵诱导中诱导卵泡发育。hLH和hCG的类似物将用于诱导已经开始发育的卵泡的排卵。这些类似物还可用来诱导男性睾丸功能。另外，本发明的糖蛋白激素类似物还可用作免疫原来引发抗血清以限制生育力，例如作为避孕疫苗。相反，针对糖蛋白激素类似物的拮抗类似物或抗体也可用来促进生育力，例如当一些患多囊卵巢病的女性中出现过量的hLH水平时。
一种具有改善的稳定性、且还保留了生物活性和功能(例如对糖蛋白激素受体的亲和性以及激素效力)的糖蛋白激素类似物，例如本发明的类似物，是非常有用的。本发明的类似物不仅可用于特定的治疗目的，而且这些类似物还能在溶液中和升高的温度下提供优秀的功能稳定性，抵抗蛋白变性剂(如尿素等)的变性作用。由于这种稳定性，预计本发明的类似物在体内会有改善的半衰期。
本发明的糖蛋白激素类似物能通过实现其目的的各种方式给予需要它的患者。例如，给予可以是不同的肠胃外途径，包括(但不局限于)皮下、静脉内、真皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服、经皮或颊途径。肠胃外给药可以是 烷基注射或随时间逐渐灌输。
一种预防、抑制或治疗淀粉样或类淀粉样沉积相关疾病的典型方案包括用单剂或用几个月到几年时间内的多剂给予有效量。
可以理解，给予的剂量取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重，并行治疗的类型(如果有的话)、治疗频率以及所需效果的性质。每次治疗所需的总剂量可通过多剂或单剂来给予。“有效量”是指能实现其指定目的的糖蛋白激素类似物的浓度。这些浓度通常可由本领域技术人员来确定。
肠胃外给药制剂包括无菌水性或非水性溶液，悬浮液和乳剂，它可以含有本领域技术人员已知的辅助剂或赋形剂。
包含本发明糖蛋白激素类似物的药物组合物包括所有组分，其中含有实现指定目的的有效量的类似物。另外，药物组合物可含有合适的药学上可接受的载体，包括有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂的赋形剂和辅助剂。合适的药学上可接受的载体是本领域中熟知的，它们在Alfonson Gennaro编辑的《Remington药物科学》第18版(Mack Publishing Co.)(Easton，PA，1990)的例子中有所描述，它是本领域中的标准参考课本。药学上可接受的载体通常根据给药方式以及糖蛋白激素类似物的溶解度和稳定性来选择。例如，用于静脉内给药的制剂可包括无菌水溶液，水溶液中还可含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。
用于肠胃外给药的合适的制剂包括以水溶性形式的活性化合物(水溶性盐)的水溶液。另外，可以给予以合适的油性注射悬液形式的活性化合物悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成的脂肪酸脂(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，它们例如包括羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、和/或葡聚糖。悬浮液还可任选地含有稳定剂。
在总地描述了本发明后，通过参考下列实施例将更容易了解本发明，提供这些实施例只是为了描述，并不意味着限制了本发明实施例1通过半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键稳定的hCG:hCG(α31-β37)按照亚基间二硫键交联的标准，表1B中的数据提示，如果在α亚基残基31产生一个游离的半胱氨酸，用半胱氨酸代替在β亚基Tyr37，则有可能制得通过半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键稳定的hCG类似物。通过制得Tyr37被半胱氨酸取代的hCGβ亚基类似物和Cys7被Ser取代的人α亚基类似物，实现此目的。后一变化破坏了α亚基内氨基酸Cys7和Cys31之间通常所见的二硫键，使得残基31留下的游离的α亚基半胱氨酸能和β亚基残基37导入的半胱氨酸形成二硫键。当这些亚基构建物每个都在培养的哺乳动物细胞中表达时，α亚基残基31的半胱氨酸和β亚基残基37的半胱氨酸形成亚基间二硫键。
二硫键的形成大大提高了异二聚体的稳定性。与hCG不同的是，交联的异二聚体在尿素或低pH下不解离。然而，hCH(α31-β37)被大多数单克隆抗体识别、结合LH受体、以及引发信号转导的能力与hCG类似。这表明，二硫键的存在没有破坏激素的功能。
在Campbell等人1991年描述的并含有hCGα亚基cDNA的表达载体(pKBM-hCGα)中，将α亚基中Cys7的密码子变成丝氨酸密码子。pKBM载体是pUC载体(Yanisch-Perron等人，1985)的衍生物，其中多接头被含有一个XhoI位点的多接头代替，它允许cDNA插入物在pKBM和表达载体pSVL之间转移(Pharmacia，Piscataway，NJ)。由于只有一个α亚基基因，因此hCG，hLH，hFSH和hTSH的α亚基cDNA含有相同的密码子，因此该表达载体称为pKBM-α。如图40所示，pKBM-α含有在α亚基编码序列5′的唯一的XhoI内切核酸酶限制性位点，在氨基酸9-11密码子的附近有唯一的BsmI内切核酸酶限制性位点。设计聚合酶链反应(PCR)引物(Oligo425和Oligo847，表5)以包括该区域，将Cys7的密码子改为丝氨酸密码子，产生一个能用来鉴别突变构建物的新的内切核酸酶限制性位点(BspEI)。
表5用来制备二硫键交联类似物的引物序列
以Xho I和BsmI消化用这些引物和pSVL-hCGα(Campbell等人，1991)作为模板的PCR产物，并用本领域熟知的技术亚克隆到pKBM-α的唯一的XhoI-BsmI位点内(Maniatis等人，1989)。
用双脱氧法(Maniatis等人，1989)测得含有BspEI内切核酸酶限制性位点的重组质粒的序列位于已经由PCR为基础的诱变改变的区域中。该载体(pKBM-αC7S)编码的蛋白质具有图3所示的氨基酸序列。通过XhoI和BamHI消化从pKBM载体中取出修饰的α亚基cDNA，并亚克隆到pSVL的XhoI-BamI位点中，产生pSVL-αC7S，该程序允许αC7S在COS-7细胞中表达。将编码序列另插入另一表达载体(pCI)的XhoI-BamHI位点中，该载体购自Promega(Madison，WI)，它已作修饰以有利于这种以及相关构建物的亚克隆。pCI的修饰涉及除去其BamHI位点，用具有下列内切核酸酶限制性位点的新的多接头代替它的多接头(即限制性位点NheI-NotI)NheI-XhoI-EcoRI-MluI-KpnI-XbaI-SalI-BamHI。通过从pKBM或pSVL中取出含有所需编码区的XhoI-BamHI片段，将其连接到已经用XhoI和BamHI消化的pCI中，这允许将构建物从pKBM和pSVL为基础的载体亚克隆到pCI为基础的载体中。本文其它处所指的pCI为基础的载体是指如上所述经修饰的pCI载体。α亚基编码区从pSVL转移到pCI分别产生了pCI-α和pCI-αC7S，以促进在培养细胞中的表达。
不一定要用丝氨酸代替半胱氨酸来制得不能在Cys7和Cys31之间形成二硫键的α亚基类似物。已经用丙氨酸来破坏该键(Furuhashi等人，1994)，预计用其它氨基酸取代Cys7也将破坏Cys7-Cys31二硫键。
通过已经插入pUC为基础的载体(称为pKBM-hCGβ′)(Campbell等人，1991)的hCGβ亚基cDNA中的盒式诱变来修饰hCGβ亚基编码序列，以便用Cys的密码子代替Tyr37密码子。该构建物在氨基酸35-36和45-46的密码子处含有唯一的NgoMI和PstI限制性位点。用Oligo845和Oligo874(表5)退火产生的盒代替NgoMI和PstI位点之间的短片段，导入突变密码子。这样还导入了一个PmlI内切核酸酶限制性位点，该位点能用来帮助鉴别含有该突变的质粒。
用本领域熟知的标准方法(Maniatis等人，1989)将该盒亚克隆到pKBM-hCGβ′(Campbell等人，1991)中，用双脱氧测序法确认突变区的所需序列。由于pKBM不是表达载体，将它亚克隆到pSVL中，使得该β亚基构建物在哺乳动物细胞中表达。它按如下方法实现取XhoI和BamHI消化pKBM-hCGβ′获得的小片段，将其和pSVL经XhoI和BamHI消化后留下的大片段连接，产生称为pSVL-hCGβ′Y37C的表达载体。pSVL-hCGβ′和pSVL-hCGβ′Y37C编码的氨基酸序列如图4所示。将它们也亚克隆到修饰的pCI载体的XhoI和BamHI位点中。
这些编码序列的制备还可用标准的DNA合成技术通过商业上可获得的仪器来实现。这些技术可用来制得能连接在一起的长的寡核苷酸，如Campbell等人，1992年所述。应注意，DNA编码序列还能购自专门构建合成寡核苷酸和制备合成cDNA基因的几家公司。这些公司包括Midland Certified Reagent Company，Midland，Texas，和Genosys Biotechnologies，Inc.，The Woodlands，Texas。这些亚基的表达还可在培养的哺乳动物细胞(即COS-7细胞)中用任何商业上可购得的载体如pSVL(Pharmacia，Piscataway，NJ)或pCI(Promega，Madison，WI)用类似于Campbell等人，1991已经描述的且本领域中常见的方法来实现。
用本领域熟知的且已有描述(Campbell等人，1991)的常规方法在COS-7细胞中共同表达pSVL-α和pSVL-hCGβ′、pSVL-αC7S和pSVL-hCGβ′Y37C、pCI-α和pCI-hCGβ′、pCI-αC7S和pCI-hCGβ′Y37C。用标准的磷酸钙沉淀法(如Kriegler，1990所述)转染入COS-7细胞中。COS-7细胞从ATCC，Rockville，MD获得。转染后第二天，除去细胞培养基，用无血清DMEM培养基代替。再培育细胞三天，使分泌的产物在培养基中累积。然后离心培养基，除去细胞碎片和其它沉淀物，将上清转移到透析袋中，将袋置于吸湿性粉末床上，浓缩高分子量组分(Aquacide，Calbiochem，La Jolla，CA)。
用夹心免疫试验(Moyle等人，1982)定量测定已经分泌到培养基中的hCG和交联的hCG，试验分别采用抗体A113和125I-B105来捕获和检测，用从尿中纯化出的hCG作为标准。在该试验中，使抗hCGα亚基抗体A113(0.05毫升中1微克)吸附到微量滴定板上，37℃放置1小时。除去未吸附的抗体，每个孔用含有0.9％NaCl和1毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液封闭其余的蛋白吸附位点。将转染三天的细胞培养基等份(0.05毫升)加入孔中，使hCG或交联的hCG类似物于37℃ 1小时结合吸附的抗体。除去未结合的激素或激素类似物，用0.9％NaCl清洗孔，使捕获的分析物和如上所述制得的放射性碘化的抗hCGβ亚基抗体125I-B105反应。吸弃不结合hCG或交联的hCG类似物的125I-B105，用γ计数器测定结合微量滴定板表面的放射性标记。该试验很容易检测0.1ng hCG。该试验不一定要用这些特定的抗体，还可使用几种商业上可购得的抗体。大多数抗hCGα亚基抗体以及对hCG和游离hCGβ亚基的亲合力高于108M-1的抗hCGβ亚基抗体均可使用。后者包括购自Pierce，3747 North Meridian Road，Rockford，IL的ZMCG13和ZMCG7。
抗体、hCG和hFSH的碘化用购自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的Iodo-Gen完成。在该步骤中，将50微升丙酮配的1.5微克Iodo-Gen加入能盛方约0.75毫升液体的小玻璃管中，使丙酮蒸发。这使得Iodo-Gen残余物包被在试管底部。然后，加入10微克B105，用塑料盖盖上试管，用微量注射器通过盖子注射加入0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.2)配的含250-500μCi Na125I的5微升溶液。20-30秒后，加入0.02M磷酸钠缓冲液(pH7.2)配的0.1毫升0.9％NaCl溶液，吸出混合物，加入2毫升BioGelP6DG(BioRad，Richmond，CA)柱中。用凝胶过滤分离游离的碘和碘化的蛋白质。用于碘化的Na125I的用量取决于蛋白质在放射性碘化后保留其功能的能力。抗体和hCG通常碘化至比活为50μCI/μg，而hFSH通常碘化至比活为10-25μCi/μg。
表6描述了突变不破坏交联hCG类似物的形成。已经转染了含pSVL编码序列或pCI编码序列的细胞产生了相当量的交联的类似物和hCG。
表6转染的COS-7细胞产生hCG和hCG(α31-β37)
在夹心免疫试验中相对于hCG标准测定了hCG和hCG(α31-β37)，用针对α亚基的抗体(A113)作捕获抗体，用针对β亚基的碘化抗体(B105)来检测。
在夹心免疫试验中用抗体A113和B105来测定交联的hCG类似物的产生是因为它们识别预计远离突变位点的激素区域(Cosowsky等人，1995；Moyle等人，1995)。hCG(α31-β37)类似物不象hCG那样和A407结合(图5)，已经表明，该抗体识别的表位包括α亚基的N端部分(C7S突变的部位)(Moyle等人，1995)。抗体A407从哥伦比亚大学(New York，NY)Robert E.Canfield博士处获得。然而，已经表明A407识别hCG-受体复合物(Moyle等人，1995)，因此激素构型的这种小变化预计不会干扰交联的hCG类似物的生物活性。
在放射性配体受体和信号转导试验中，监测了hCG(α31-β37)和其它交联的类似物的生物活性。这些试验采用已经转染了编码LH受体cDNA的基因并因此在其表面表达功能性LH受体的CHO细胞。CHO细胞从ATCC，Rockville，MD获得。大鼠LH受体cDNA用聚合酶链反应从大鼠卵巢文库获得(如Bernard等人，1990所述)。应注意，采用这些表达LH受体的细胞只是由于方便，放射性配体受体试验可用表达LH受体的其它组织来进行。这些组织包括成年大鼠睾丸的匀浆物或从已经注射了怀孕母马血清促性腺激素和hCG(均购自Sigma，St.Louis，MO)的未性成熟大鼠中获得的卵巢匀浆物。为了产生能高亲和性结合hCG的卵巢制备物，给予21日龄雌性大鼠皮下注射50i.u.怀孕母马血清促性腺激素。约65小时后，给予皮下注射25i.u.hCG。7天后处死，取其卵巢匀浆，将对应于1/20卵巢的匀浆等份用于各试验管中。表达大鼠LH受体的细胞结合放射性碘化hCG(可如上所述制得或购自New England Nuclear，Boston，MA的一种示踪物)。它们还结合未标记的hCG(一种购自Sigma Co.，St.Lousi，MO的激素)。表达LH受体的CHO细胞在对hCG 37℃处理10-30分钟的应答中合成环腺苷酸。用对环腺苷酸有特异性的放射性免疫试验(RIA)(已有描述，Brooker等人，1979)测定产生的环腺苷酸。
hCGα和β亚基半胱氨酸结节中的残基间加入亚基间二硫键没有破坏交联的异二聚体结合LH受体或引发环腺苷酸累积应答的能力。因此，hCG和hCG(α31-β37)均能阻断125I-hCG与表达LH受体的CHO细胞的结合(图6)。hCH和hCG(α31-β37)还能在这些相同的细胞中引发环腺苷酸累积(图7)。这表明，该亚基间二硫键的存在没有破坏hCG的整体功能活性。
亚基间二硫键的存在使得hCG(α31-β37)能抵抗破坏hCG的酸、尿素和加热处理。这可从图8和9的数据看出。图8描述了升高的温度对异二聚体稳定性的影响，异二聚体在夹心免疫试验中进行监测，用A113作捕获抗体，用125I-B112作检测抗体。注意，B105和B112结合的重叠表位包括靠近第3个β亚基环附近转折的残基(Moyle，1990；Cosowsky等人，1995)，该部位远离hCG(α31-β37)的α或β亚基中的突变。在该试验中，使hCG和hCG(α31-β37)受85℃的温度作用不同时间，最高为20分钟。hCG的活性在7-8分钟被基本上破坏，而交联的类似物在培育20分钟后还保留了至少75％的活性(图8)。由于该夹心免疫试验对二聚体有特异性，因此hCG活性的丧失看来是由于亚基的解离，该过程由于亚基间二硫键的存在而被阻止。
在高浓度尿素中培育促性腺激素会促进亚基解离是众所周知的(Pierce等人，1981)。因此，当hCG在8M尿素中培育时，它解离成其亚基，该现象很容易通过Western印迹来检测(图9)。已经转染了编码hCGα和β亚基的基因的哺乳动物细胞通常将游离的β亚基和αβ异二聚体分泌到培养基中。这很容易用采用α亚基特异性抗体和β亚基抗体的夹心免疫试验来区分。αβ异二聚体和游离的β亚基还可在Western印迹中通过它们的大小来区分。因此，通过用聚丙烯酰胺凝胶电泳将它们分离，然后在Western印迹中检测它们，就可以监测培养基中hCG和游离β亚基的相对量。这可用结合hCG和游离hCGβ亚基的放射性碘化单克隆抗体来实现(如图9所示)。分析表达hCGα和β亚基的细胞培养基，结果表明异二聚体(上方条带)和游离的β亚基(下方条带)均存在。用8M尿素处理培养基使得异二聚体解离成其亚基。结果，上方条带消失。尿素不能促使二硫键交联的异二聚体hCG(α31-β37)解离成其亚基，因此对应于异二聚体的条带保持完整(图9)。
实施例2通过位于α和β亚基中半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键而稳定的多功能糖蛋白激素类似物众所周知，座位系带会影响hCG的受体结合活性(Campbell等人，1991；Moyle等人，1994；Han等人，1996)。hCGβ亚基氨基酸残基101-109被其hFSH对应物(即hFSHβ亚基残基95-103)代替导致类似物的FSH活性大大增加，而不损害它的LH活性(Moyle等人，1994；Han等人，1996)。实际上，该替代还增强了hCG的TSH活性(Campbell等人，1997)，即使它不导入hTSH中见到的任何特殊残基。研究亚基间二硫键对相关的多功能类似物活性的影响显示了特异性二硫键怎样影响促黄体素、促卵泡激素和促甲状腺激素的活性。本实施例描述了半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键怎样影响hCG类似物(CFC101-114)(其中hCGβ亚基残基101-114被其hFSH对应物(即hFSHβ亚基残基95-108)取代)的LH和FSH活性。
CFC101-114(α31-β37)的表达需要使细胞被编码αC7S和CFCβ′101-114Y37C的载体转染。实施例1中已经描述了α亚基的修饰。用来制备CFC101-114β′Y37C的CFC101-114β亚基前体的DNA序列编码了按次序依次连接的hCGβ亚基残基1-100、hFSHβ亚基残基95-108、和hCGβ亚基残基115-145。它通过在两个hCG/hFSHβ亚基嵌合体共有的SstII位点上组合它们的编码序列来产生(图41-43)。将含有信号序列和pSVL-CFC101-114β′残基1-103的密码子的pSVL-CFC101-106β′的XhoI-SstII片段亚克隆到pSVL-CFC94-114β′的XhoI-BamHI片段中。这样，pSVL-CFC101-114β′中所见的hFSHβ亚基残基88-94的密码子被其hCGβ亚基同源物(即残基94-100)取代，并且导入了一个BglII位点。如下所述，这些编码载体每一个都通过修饰分子3′半中密码子从hCGβ亚基cDNA衍生获得。
通过PCR诱变pSVL-CFC94-106β′(一种载体，它编码了按该次序依次连接的hCGβ亚基残基1-93、hFSHβ亚基残基88-100、和hCGβ亚基残基107-145)制得pSVL-CFC94-114β′。制备pSVL-CFC94-114β′的第一步是用SOEing PCR诱变(Ho等人，1989)制得pSVL-CFCβ′94-106。PCR反应以Oligo508和Oligo368(表5)为引物，pSVL-hCGβ′(Campbell等人，1991)为模板，产生的产物含有CFC94-106β亚基密码子101-145，hCGβ亚基终止密码子、3′非翻译区、BamHI内切核酸酶限制性位点和BamHI位点3′的pSVL载体序列的一部分。用Oligo510和Oligo365(表5)的第二个PCR反应产生的产物含有其XhoI位点5′的pSVL序列、pSVL-hCGβ的5′非翻译区(Campbell等人，1991)、hCGβ亚基信号序列的20个密码子、以及CFC94-106β亚基密码子1-107。含有CFC94-106β亚基密码子101-107的这些PCR产物的部分是互补的，以满足在“SOEingPCR”期间重叠延伸的需求。使这两个PCR产物和Oligo363以及Oligo364(表5)混合，并在第三个PCR反应中扩增，以产生编码CFC94-106β亚基全长序列的PCR产物，该产物的5′和3′端附近分别有XhoI和BamHI限制性位点。该PCR产物在残基102-104密码子处也有SstII位点，将其克隆到pSVL的XhoI和BamHI位点内，产生pSVL-CFC94-106β′。用双脱氧测序法确认编码区的序列。
制备pSVL-CFC94-114β′β亚基的最后一步涉及用引物Oligo596和Oligo368(表5)以及模板pSVL-hCGβ′进行PCR来产生5′和3′端附近分别有SstII和BamHI位点的产物。当用这些酶消化后，它产生了一个DNA片段，该片段含有按次序的hFSHβ亚基残基97-108密码子以及hCGβ亚基密码子115-145。将它亚克隆到pSVL-CFC94-106β′的唯一的SstII-BamHI位点中，产生pSVL-CFC94-114β′，在PCR期间已经扩增的序列部分用双脱氧测序法确认。
pSVL-CFC101-106β′的制备从称为pMB135的载体开始，它编码残基114处截短的hCGβ亚基类似物，且Gly102密码子被缬氨酸密码子代替。pMB135这样制得，使Oligo435和Oligo436(表5)退火，用酶法填平3′末端，产生含有PvuII和SstI位点的双链弹夹。后一位点是终端密码子的3′端。该弹夹按以下序列编码hCGβ亚基残基87-101、缬氨酸、和hCGβ亚基残基103-114，并且在密码子94-95处含有一个BglII限制性位点。将它亚克隆到pSVL-hCGβ′的PvuII-SstI位点中，用双脱氧测序法确认PvuII-SstI位点之间的该序列。在PCR反应中，用pMB135作为模板，用Oligo562和Oligo365(表5)产生PCR产物，该产物在XhoI和SstII消化后按以下次序具有hCGβ-亚基cDNA非翻译区和信号序列、hCGβ亚基密码子1-100、以及hFSHβ亚基密码子95-98。将该PCR产物克隆到pSVL-CFC94-106β′的XhoI-SstII位点内，制得pSVL-CFC101-106β′，其序列用双脱氧测序法来确定。
显然，不一定要用这种方法来产生pSVL-CFC101-114β′。出于历史原因，采用这些步骤。因为在其它试验期间已经制得了各种中间载体，并可用来制备编码CFC101-114β′的载体。
组合编码Y37C突变的pSVL-hCGβ′Y37C的5′″半″和编码hFSHβ亚基氨基酸95-108的pSVL-CFC101-114β′的3′″半″，制得质粒pSVL-CFC101-114β′Y37C。这通过连接用XhoI和Bsu36I消化获得的pSVL-hCGβ′Y37C小片段和用相同酶消化pSVL-CFC101-114β′产生的大片段来实现。这就使CFC101-114β′的信号序列和氨基酸1-54的密码子被hCGβ′Y37C的密码子代替，该变化导致Tyr37被半胱氨酸代替。以前所述的将Xho-I-BamHI片段亚克隆到经修饰的pCI构建物的XhoI-BamHI位点中产生了称为pCI-CFC101-114β′Y37C的构建物。图10中描述了CFC101-114β′和CFC′101-114β′Y37C的氨基酸序列。
用实施例1所述的方法在COS-7细胞中共同表达pSVL-α加上pSVL-CFC101-114β；pSVL-αC7S加上pSVL-CFC101-114βY37C；pCI-α加上pCI-CFC101-114β；和pCI-αC7S加上pCI-CFC101-114βY37C，产生CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)。用夹心免疫试验(Moyle等人，1982)定量测定浓缩培养基中的CFC101-114和交联的CFC101-114(α31-β37)，用抗体A113作捕获抗体，用125I-B105或125I-B112作检测抗体，用从尿液中纯化的hCG作为标准。和前面一样，应注意该试验不一定要使用这些特定的抗体；商业上可获得的抗体预计均能满意地工作。大多数对hFSH也有高亲和性的抗hCGα亚基抗体(如A113)或对hCG有高亲和性的抗hFSHα抗体均可用于该试验。然而，由于这些类似物在座位系带区部分含有的hFSH残基(即第11和12个β亚基半胱氨酸之间的氨基酸残基(Moyle等人，1994))对FSH活性有主要影响，因此CFC101-114的类似物并不被所有的抗hCGα亚基抗体识别。这可以从A407看出(图11)，该抗体结合hCG但不结合hFSH。因此，尽管A407结合hCG，但它结合CFC101-114和交联的CFC101-114类似物的能力很差。A407结合CFC101-114(α31-β37)的能力也低。
除了识别β亚基中FSH残基占据区域附近的残基的那些抗体外，CFC101-114类似物能用大多数对hCG和游离hCGβ亚基亲和力高于108M-1的抗hCGβ亚基来抗体检测。因此，CFC101-114和类似物不被B111抗体识别，已经表明该抗体受hCG残基108-114的影响很大(Cosowsky等人，1995)。然而，大多数识别hCG、hLH、游离的hCGβ亚基和游离的hLHβ亚基的抗体(如B105)能用于该试验。另外，识别hCG和游离的hCGβ亚基的许多抗体(如B112)也能用于该试验。B105/B112表位区域是小鼠hCG中最具抗原性的区域，针对该区域的抗体可如实施例1所述在商业上购得。
CFC101-114(α31-β37)中二硫键交联的存在相对于CFC101-114而言提高了其热稳定性(图12)。夹心免疫试验表明hCG和CFC101-114的活性分别被85℃加热7.5分钟和15分钟破坏。然而，在同一温度下20分钟后，却保留了大量CFC101-114(α31-β37)。这表明，二硫键的存在增强了该类似物的稳定性。由于该类似物和在第11和12β亚基半胱氨酸之间有FSH残基的其它类似物具有FSH和TSH活性(Campbell等人，1997)，因此预计该二硫键也能提高FSH和TSH的稳定性。
CFC101-114能刺激LH受体处的信号转导。CFC101-114半胱氨酸结节之间加入α31-β37亚基间二硫键在该试验中不减少其活性(图13)。因此，在采用已经工程改造能表达LH受体的CHO细胞的试验中，CFC101-114和CFC101-114(α31-β37)具有大致相同高的刺激环腺苷酸累积的能力。因此，该二硫键的存在看来不影响具有促黄体素活性的分子的活性。该键使这些分子稳定的能力预计可赋予促黄体素有用的治疗性质。
尽管CFC101-114的氨基酸序列与hCG的序列比hFSH的序列更接近，但是CFC101-114(α31-β37)的FSH活性比hCG(已经知道该激素在该试验中几乎没有活性)高得多。CFC101-114半胱氨酸结节之间加入α31-β37亚基间二硫键对其在表达FSH受体的CHO细胞中刺激环腺苷酸累积的能力影响很小(图14)。因此，该二硫键的存在看来不会给具有促卵泡激素活性的分子的活性带来负面影响，该键使这些分子稳定的能力预计赋予促卵泡激素有用的治疗性质。
实施例3通过座位系带和α亚基环2之间的亚基间二硫键而稳定的hCGhCGα和β亚基中残基的Cα和Cβ碳原子之间的距离(表1B)提示，有可能制得亚基由一个或多个二硫键联接的其它许多二聚体。hCG和CFC101-114在α亚基残基31和β亚基残基37之间的交联，明显增强了所得类似物的稳定性，并且对其生物活性的影响最小。为了了解将二硫键导入前已表明影响受体结合的该分子一部分中是否会改变其稳定性和活性，在hCG和CFC101-114中的α亚基环2和座位系带之间工程改造产生二硫键。这些研究结果表明，在糖蛋白激素该区域内导入二硫键提高了它们的稳定性。然而，产生二硫键所需的替代影响了它们与受体相互作用并引发信号转导的能力。这表明最好将二硫键导入不参与受体相互作用或受体特异性的激素部分内来维持高的内分泌活性。由于两种二硫键交联的类似物保留了它们的免疫学活性，因此在设计免疫原时，二硫键的位置可能并不重要。该二硫键对信号转导的影响可能可用来开发激素拮抗剂或免疫原。
为了制备通过α亚基环2和座位系带之间的亚基间二硫键而稳定的hCG类似物，用半胱氨酸代替α亚基环2的Lys51和β亚基座位系带的Asp99。α亚基中的变化涉及以前未曾描述的已有载体的盒式诱变。因此，下面将描述这些中间载体的构建(图44)。
用含有限制性酶切位点EcoRI-XhoI-NcoI-PacI-BamHI-EcorI的多接头取代pIBI31(一种购自International Biotechnologies，Inc.(New Haven，CT)的克隆载体)的多接头，产生称为pRM102的载体。用NcoI和BamHI消化pKBM-α，并克隆到pRM102的NcoI-BamHI位点内，产生pRM116，从而消除了在克隆pKBM-α期间已经导入的5′非翻译前导序列和不需要的5′XbaI位点。这样，pRM116中唯一的XbaI位点对应于α亚基氨基酸34-35的密码子。用Oligo758和Oligo760(表5)对α亚基cDNA作PCR产生的载体的XbaI-BamHI片段，取代pRM116的XabI-BamHI片段，产生pRM117。这消除了α亚基cDNA中发现的3′非翻译区，该过程还消除了该区域中不需要的PstI限制性位点。pRM17中保留的唯一的PstI位点位于残基83-85的密码子中。将α亚基cDNA经Oligo 730和Oligo839(表5)作PCR获得的产物克隆到pRM117的独特的XbaI-PstI位点中，产生pMB507。这分别将BglII和SpeI位点导入α亚基编码序列的密码子42-43和54-55中。将pMB507的XhoI-BamHI片段亚克隆到pSVL的XhoI-BamHI位点中产生pMB512。pMB512在BglII和SpeI位点之间的片段用Oligo877和Oligo878(表5)代替，产生pMB561。最后，pMB512的BglII-SpeI片段用Oligo921和Oligo922(表5)退火得到的盒代替，产生pSVL-αK51C(图15)。不需要用该策略来制备pSVL-αK51C，采用该策略只是出于历史原因，因为可得到其它试验中产生的各种载体中间物。
通过PCR诱变，用pSVL-hCGβ′作为模板，Oligo368和Oligo925(表5)作为引物，制得β亚基类似物hCGβ′D99C。Oligo368是与pSVL中BamHI内切核酸酶限制性位点3′的一个部位互补的反向引物。Oligo925含有所需的突变，并产生BglII位点。用BglII和BamHI消化PCR产物并亚克隆到pSVL-CFC101-114β′的BglII-BamHI位点中。这从pSVL-CFC101-1114β′中除去了hFSH密码子，并将Asp99变成半胱氨酸(图15)。
如实施例1所述，在COS-7细胞中共同表达质粒pSVL-αK51C和pSVL-hCGβ′D99C。在夹心免疫试验中相对于hCG标准测定hCG和hCG(α51-β99)，用针对α亚基的抗体(A113)捕获，用针对β亚基的放射性碘化的抗体(B105)检测。该试验中不一定要用这些特定的抗体。识别异二聚体中hCGα亚基的任何抗体以及识别hCG及其游离的β亚基的亲和力超过108M-1的任何β亚基抗体均可用于该试验。转染的COS-7细胞产生hCG和hCG(α51-β99)导致细胞培养基中交联蛋白质类似物的累积，这很容易用A113/125I B105或A113/125IB112夹心免疫试验(表7)来检测，这表明导入二硫键所需的突变不阻碍亚基结合。
表7转染的COS-7细胞产生hCG和hCG(α51-β99)
用实施例1所述方法在LH受体结合和信号转导试验中测定hCG(α51-β99)的生物活性。hCG(α51-β99)能抑制125I-hCG与表达LH受体的CHO细胞结合，但是hCG只有5-10％的效力(图16)。二硫键引起的对LH受体亲和力的减少是由于1)α亚基残基Lys51被半胱氨酸取代(即带电荷氨基酸被中性氨基酸取代)，2)β亚基残基Asp99被半胱氨酸取代(即带负电荷氨基酸被中性氨基酸取代)，或3)由于两个亚基间存在共价键而增加的约束。已经表明，Asp99的修饰能减少或消除hCG的LH活性(Chen等人，1991)。通过比较hCG类似物(含有未修饰的β亚基以及Lys51变成半胱氨酸的α亚基(hCG(αK51C-β))，以及含有未修饰的α亚基和Asp99变成半胱氨酸的β亚基(hCG(α-βD99C)))和hCG以及hCG(α51-β99)的LH受体结合活性，就可以区分半胱氨酸取代的影响和二硫键的影响(图17)。这些分析表明，α亚基Lys51替代成半胱氨酸对类似物抑制125I-hCG结合LH受体的能力有很大的抑制性影响。hCG(α51-β99)和hCG(α-β99)的活性类似，这证明β亚基Asp99替代成半胱氨酸是hCG(α51-β99)的LH受体结合活性减少的主要原因。Lys51变成丙氨酸也减少了hCG的活性(图18)。
还测试了这些hCG类似物刺激信号转导(环腺苷酸累积)的能力。用半胱氨酸或丙氨酸取代α亚基残基Lys51使得激素刺激环腺苷酸累积的能力几乎完全丧失(图19和20)。与仅含α亚基Lys51的单个半胱氨酸替代的类似物相比，在两个亚基中加入半胱氨酸产生hCG(α51-β99)恢复了大量活性(图19)。β亚基残基Asp99被半胱氨酸替代本身对LH受体信号转导的影响小得多。这表明，二硫键减少了hCG类似物的相对效力，该性质可用于拮抗剂的设计。
座位系带和α亚基环2之间的亚基间二硫键的存在提高了hCG的热稳定性(图8)。它还防止亚基在8M尿素存在下解离(图9)。这些观察结果确认了亚基间二硫键对糖蛋白激素稳定性的有利作用。
实施例4通过座位系带和α亚基环2之间的亚基间二硫键稳定的双功能糖蛋白激素类似物在能和三种主要的糖蛋白激素受体相互作用的糖蛋白激素类似物CFC101-114的座位系带和α亚基环2之间产生二硫键。这样就能分析该蛋白区域对和LH和FSH受体相互作用的相对影响。
通过pSVL-CFC101-114β′盒式诱变制得产生CFC101-114β′(α51-β99)所需的β亚基表达载体(即，pSVL-CFC101-114β′D99C)。该载体在氨基酸95-96的密码子中含有BglII内切核酸酶限制性位点，在氨基酸102-104的密码子中含有SstII位点。用BglII和SstII消化pSVL-CFC101-114β′，用Oligo924和Oligo923(表5)退火获得的合成的寡核苷酸盒取代小片段，制得pSVL-CFC101-114β′D99C。这也引入了用来选择重组克隆的BsrGI位点。所得载体pSVL-CFC101-114β′D99C中变化的碱基序列用双脱氧测序法确认。图21中描述了该载体编码的CFC101-114β′(α51-β99)的氨基酸序列。
如实施例1所述，从COS-7细胞共同表达pSVL-αK51C和pSVL-CFC101-114β′D99C。在夹心免疫试验中测定该二聚体，用A113作捕获抗体，用放射性碘化的B112作检测抗体，用纯化的尿hCG作为标准。和其它类似物一样，不一定要用这些特定的抗体来检测培养基中的CFC101-114(α51-β99)。能结合hCG和hFSH的大多数α亚基抗体可用作捕获抗体。能结合hCG和游离的β亚基的大多数抗体(除了识别包括已经变成FSH的序列的残基的那些)可用作检测抗体。不能使用的一个抗体例子是B111(Cosowsky等人，1995)。
A407(一种识别hCGα亚基N端部分决定簇的α亚基单克隆抗体(Moyle等人，1995))几乎不识别CFC101-114，并结合hCG(图5)。认为这是由于座位系带对糖蛋白激素α和β亚基整个相互作用的影响(可能涉及到受体结合特异性的控制)。在α亚基残基51和β亚基残基99之间增加二硫键不能使所得类似物被A407识别(图11)。
和其它二硫键交联的类似物一样，在热变性试验中也发现CFC101-114(α51-β99)比其亲代前体(即CFC101-114和hCG)更稳定(图12)。实际上，看上去α亚基残基51和β亚基残基99之间二硫键的存在使蛋白质稳定性增加的程度比α亚基残基31和β亚基残基37之间的二硫键高。
CFC101-114(α51-β99)的座位系带和α亚基环2之间二硫键的存在减少了它结合LH受体的能力(图22)。因此，尽管CFC101-114在抑制放射性碘化的hCG结合LH受体中和重组hCG几乎一样有效，但是CFC101-114(α51-β99)的活性低大约100倍。监测CFC101-114、CFC101-114(α51-β99)、CFC101-114(αK51C-β)、CFC101-114(αK51A-β)和CFC101-114(α-βD99C)的活性，比较了单个亚基突变以及二硫键的相对重要性。此比较表明，α亚基Lys51被半胱氨酸或丙氨酸替代本身对受体结合有很大的抑制影响(图22和23)。因此，CFC101-114(αK51C-β)的活性和CFC101-114(α51-β99)的活性相当。与其对hCG的LH活性的影响不同，用半胱氨酸代替CFC101-114β亚基Asp99只说明了CFC101-114(α51-β99)结合LH受体能力减少的一部分原因。然而，CFC101-114(α51-β99)比CFC101-114(αK51C-β)更具活性，该效应不能解释成是因为α亚基中Lys51被半胱氨酸代替而致。
还进行研究来测定座位系带-α亚基二硫键对CFC101-114的信号转导活性的影响(图24和25)。CFC101-114刺激LH受体处的信号转导的效能稍稍不如hCG(图24)。然而，二硫键交联的类似物CFC101-114(α51-β99)只是在测试的最高浓度下有活性。在前面讨论的研究确认，这看来主要是由于α亚基Lys51变成半胱氨酸，而只有β亚基Asp99变成半胱氨酸的类似物(即CFC101-114(α51-β99))却基本上保留了其活性。在结合试验中，此处的二硫键能补偿α亚基Lys51被半胱氨酸或丙氨酸替代引起的一些活性损失，亚基间二硫键恢复了一些信号转导(图24)。
CFC101-114在FSH试验中有显著的活性。然而，产生座位系带-α亚基环2二硫键交联所需的半胱氨酸替代对CFC101-114的FSH活性的影响比对LH活性的影响更大(图26、27和28)，不可能区分二硫键本身的影响。因此，只有α亚基Lys51或β亚基Asp99被改变的类似物丧失了其大多数FSH活性。β亚基Asp99的突变对FSH活性的影响高于对LH活性的影响这一发现支持了以前关于座位系带在LH和FSH活性中作用的观察结果(Han等人，1996；Baird等人，1993)。这些报道提示，影响LH受体结合的座位系带区域在氨基酸94-96附近，而影响FSH受体结合的区域在氨基酸101-109附近。
实施例5通过实施例1和3的二硫键稳定的hCG为了了解多个二硫键导入糖蛋白激素会怎样影响其生物活性，制得含有实施例1和3所示二硫键的hCG类似物。通过交换实施例1和3所述的表达载体的部分，制得这些类似物。用BsmI消化pSVL-αC7S和pSVL-αK51C，用琼脂糖凝胶电泳分离每次消化产生的小的和大的片段，连接pSVL-αC7S的大片段和pSVL-αK51C获得的小片段，制得pCI-α(C7S，K51C)。用XhoI和BamHI消化所得构建物，并连接入具有实施例1所述的修饰的多接头的pCI中。用AcoI(Bsu36I的isochizamer)和BamHI消化pSVL-hCGβ′(D99C)和pCI-hCGβ′Y37C，用琼脂糖凝胶电泳分离小的和大的片段，将pSVL-hCGβ′D99C衍生的小片段与pCI-hCGβ′Y37C衍生的大片段相连接，制得pCI-hCGβ′(Y31C，D99C)。图31中描述了这些载体编码的类似物的氨基酸序列。
如实施例1所述，在COS-7细胞中共同表达pCI-α(C7S，K51C)和pCI-hCGβ′(Y31C，D99C)。浓缩分泌到培养基中的蛋白质，如实施例1所述用夹心免疫试验监测，只是用放射性碘化的B112代替B105。多个二硫键的存在没有阻止糖蛋白激素折叠或从细胞中分泌出来(通过培养基中存在类似物来表明)(图8)。在夹心免疫试验中相对于hCG标准品测定hCG(α31-β37，α51-β99)，用针对α亚基的抗体(A113)作捕获抗体，并用针对β亚基的放射性碘化的抗体(B112)作检测抗体。该类似物不被抗体A407很好地识别，这可能是α亚基N端附近的突变造成的后果。由于蛋白的这个区域并非激素活性所需，因此缺少该表位看来影响不大。图31中的大写字母指导入形成二硫键的突变的位置。
表8转染的COS-7细胞产生hCG和hCG(α31-β37，α51-β99)
在热变性试验中，与hCG相比，hCG(α31-β37，α51-β99)中两个二硫键的存在增加了它的稳定性(图8)。另外，hCG(α31-β37，α51-β99)对尿素变性比hCG更稳定(图9)。这提示，多个二硫键的存在不会使此分子不稳定。
hCG(α31-β37，α51-β99)能结合LH受体并刺激环腺苷酸累积(图30和31)。它在这些试验中的活性与hCG(α51-β99)类似，这再一次表明α亚基残基31和β亚基残基37之间的亚基间二硫键对受体结合或信号转导的不利影响很小(如果有的话)。因此，当希望保留内分泌活性时，为了工程改造增加二硫键以便使糖蛋白激素稳定，α31-β37半胱氨酸结节间位点是较佳的。
实施例6通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键而稳定的hFSH类似物hCG和CFC101-114能通过它们的半胱氨酸结节之间的亚基间二硫键来稳定而且不破坏其LH和/或FSH活性的发现提示，该区域是激素活性所不需要的。因此，预计在FSH中工程改造增加类似的二硫键将产生具有增加的稳定性、强效FSH活性的hFSH类似物。预计该类似物还能结合识别hCG和hFSHα亚基的抗体(如A113)。预计它也能结合识别远离该突变位点的hFSHβ亚基环1和/或环3的区域的抗体(如B602)。
图3中已经描述了制备在α亚基残基31和β亚基残基31之间交联的hFSH类似物所需的一个α亚基类似物序列。图32说明了也可用于制备此类似物(αC7A)的极性较差的α亚基的氨基酸序列。图32中还示出了预计和αC7A或αC7S形成半胱氨酸结节间二硫键的hFSHβY31C的氨基酸序列。本领域技术人员可以用图33所示的遗传密码从人α亚基和hFSHβ亚基cDNA制得编码这些蛋白的载体所需的核酸序列。这些序列也可以从实施例1中列举的供应商处购得。
用任何本领域熟知的方法(如实施例1中参考的方法)，可以将能驱动αC7S和hFSHβY31C或αC7A和hFSHβY31C瞬时或稳定表达的载体导入COS-7或其它真核细胞中。在夹心免疫试验中，用作为标准品的hFSH、识别远离α亚基N端的hFSH表位的捕获抗体和识别β亚基环1和/或环3中hFSH表位部位的检测抗体，测定产生的蛋白质。
如实施例1中交联的hCG类似物所进行的那样，预计交联的hFSH类似物在热变性或尿素变性试验中比hFSH更稳定。交联的FSH类似物预计也将和放射性碘化的hFSH竞争结合已经转染了人FSH受体的CHO细胞。预计它还会在这些细胞中刺激环腺苷酸累积。体外试验可以成功地预测完全糖基化的糖蛋白激素类似物在体内的生物活性。由于预计导入突变来交联糖蛋白激素类似物不会改变它们相对于重组糖蛋白激素的整个糖基化方式，因此预计交联的FSH类似物在体内也将具有活性。
实施例7通过α和β亚基N端区域之间的二硫键而稳定的hCG类似物实施例1-4描述了糖蛋白激素及其类似物的亚基之间的单个亚基间二硫键能增强它们的稳定性。这些实施例还表明，二硫键对于分子的受体结合以及信号转导活性的影响很小，只要它不涉及对于受体结合、受体结合特异性重要的残基或不将蛋白扭曲成不适当的构型。α和β亚基的N端部分可作很大变化而不破坏激素活性，这说明蛋白的这一部分不参与关键的受体接触。因此，预计在糖蛋白激素N端在(图1B所示的有利位点)导入二硫键将使蛋白质稳定而不严重地破坏它们的生物活性。
图1B显示，α亚基Gln5和hCGβ亚基Arg8的位置很有利，用半胱氨酸替代这些残基将导致形成二硫键交联的类似物。预计该类似物相对于hCG而言具有增强的稳定性，并保留了结合和刺激LH受体的能力。
图34A和34B描述了制备用来表达该类似物的载体所需的氨基酸序列。
实施例8通过α和β亚基N端部分之间的二硫键而稳定的hFSH类似物如前所述，实施例1-4描述了糖蛋白激素及其类似物的亚基之间的亚基间二硫键能增强它们的稳定性。这些实施例还说明了二硫键对受体结合以及信号转导的影响，只要二硫键不涉及对受体结合或受体结合特异性重要的残基。因此，根据本发明，预计在hFSH N端引入一个二硫键将使其稳定，并导致产生一种具有有用的治疗性质的类似物。
根据表1B(显示了α亚基Gln5和hCGβ亚基Arg8的有利位置)以及表2(显示了hCG和hFSH中的“等价”残基)中的数据，预计用半胱氨酸残基取代α亚基Gln5和hFSHβ亚基Ser2会产生二硫键交联的hFSH类似物。预计这些类似物的稳定性比hFSH有所增强，并且将保留结合和刺激FSH受体的能力。图35中描述了制备用来表达该类似物的载体所需的氨基酸序列。
实施例9通过α和β亚基间的半胱氨酸结节间二硫键或α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定的hLH类似物最密切相关的人促黄体激素是hCG和hLH。因此，预计制备有活性的二硫键交联的hCG类似物所需的突变也可用来制备有活性的二硫键交联的hLH类似物。hLH是促性腺激素中最不稳定的，因此预计亚基间二硫键将大大提高hLH的稳定性。图36和37中分别描述了制备半胱氨酸结节间二硫键交联的hLH所需β亚基的氨基酸序列以及在其N端附近交联的hLH。
实施例10预计能用来制备通过α和β亚基之间的半胱氨酸结节间二硫键、或α和β亚基N端部分之间的亚基间二硫键稳定的hTSH类似物的β亚基类似物-hTSHβY30C如前所述，实施例1-4描述了糖蛋白激素及其类似物的亚基之间的亚基间二硫键能增强它们的稳定性。这些实施例还说明了二硫键对受体结合和信号转导的影响，只要二硫键不涉及对于受体结合或受体结合特异性重要的残基。因此，预计在hTSHα和β亚基的半胱氨酸结节中或hTSHα和β亚基N端中的残基之间，引入二硫键将使该异二聚体稳定，从而产生具有有用治疗性能(例如在放射性碘切除治疗前刺激甲状腺)的类似物。
根据表1B(显示了α亚基Cys31和hCGβ亚基Tyr37的有利位置)以及表2(显示了hCG和hTSH中的“等价”残基)中的数据，预计表达αC7S或αC7A以及Tyr30被半胱氨酸残基取代的hTSHβ亚基类似物的细胞将产生二硫键交联的hTSH类似物。同样，根据表1B(显示了α亚基Gln5和hCGβ亚基Arg8的有利位置)以及表2(显示了hCG和hTSH中的“等价”残基)中的数据，预计用半胱氨酸残基取代α亚基Gln5和hTSHβ亚基Phe1会产生二硫键交联的hTSH类似物。预计这些类似物的稳定性比hTSH有所增强，并且将保留结合和刺激TSH受体的能力。
图38和39中描述了制备用来表达这些类似物的载体所需的氨基酸序列。
实施例11二硫键交联的激素拮抗剂的制备众所周知，糖蛋白激素的去糖基化降低了它们引发生物信号的能力(Moyle等人，1975；Matzuk等人，1989)。然而，由于它们不稳定，去糖基化的激素不能用于治疗。预计将二硫键交联入通过基因改变而去糖基化的激素会提高它们作为激素拮抗剂的用途。LH或hCG的拮抗剂有促进生育力和抗生育力的用途。因此，当其给予具有不适当高水平LH而不育的女性时，LH拮抗剂将增强生育力。当其给予处于怀孕早期的女性时，hCG拮抗剂将终止怀孕。也可使用双功能LH/FSH分子的拮抗剂，例如CFC101-114或CF101-109(Moyle等人，1994)。该拮抗剂的短时期使用可用来终止不适当的卵巢功能，从而使月经周期重新恢复。这具有潜在的促进生育的效应。在怀孕早期使用这种拮抗剂预计能抑制孕酮和雌二醇的产生并终止怀孕。
除了引入亚基间二硫键交联，交联的拮抗剂的制备还涉及改变已描述的或能参照表1B可产生的类似物中α亚基上或α和β亚基上的N连接的糖基化信号。这将涉及到改变在糖蛋白激素α和β亚基中发现的序列Asn-X-Ser/Thr，用另一氨基酸取代Asn，将Ser或Thr变成另一个氨基酸，或将Asn或Ser/Thr之间的氨基酸(用X表示)变成脯氨酸。
实施例12表9-15中列出了预计比亲代激素更稳定的促性腺激素的其它二硫键交联类似物。这些类似物可通过用能表达α亚基和β亚基构建物的载体共转染细胞来制得(如实施例1-5所述)。
表9可用来制备hCG、hLH、hFSH和hTSH的二硫键交联类似物的人α亚基的其它类似物(注意突变用大写字母表示)
表10用来制备与适当的α亚基类似物结合的二硫键交联的hFSH类似物的hFSHβ亚基的其它类似物(注意突变用大写字母表示)
表11用来制备与合适的α亚基类似物结合的二硫键交联的hCG类似物的hCGβ亚基的其它类似物(注意突变用大写字母表示)
表12用来制备与合适的α亚基类似物结合的二硫键交联的hLH类似物的hLHβ亚基的其它类似物(注意突变用大写字母表示)
表13含有提高其稳定性的亚基间二硫键的hFSH异二聚体
注意预计基本上保留生物活性的那些构建物用星号表示。这根据参与受体结合或受体结合特异性的残基的作用来计算(如实施例1-4所示)。交联的异二聚体可用实施例1所述的方法通过指定的α和β亚基类似物cDNA共转染到哺乳动物细胞中来制得。
表14含有提高其稳定性的亚基间二硫键的hCG异二聚体
注意预计基本上保留生物活性的那些构建物用星号表示。这根据参与受体结合或受体结合特异性的残基的作用来计算(如实施例1-4所示)。交联的异二聚体可用实施例1所述的方法通过指定的α和β亚基类似物cDNA共转染到哺乳动物细胞中来制得。
表15含有提高其稳定性的亚基间二硫键的hLH异二聚体
注意预计基本上保留生物活性的那些构建物用星号表示。这根据参与受体结合或受体结合特异性的残基的作用来计算(如实施例1-4所示)。交联的异二聚体可用实施例1所述的方法通过指定的α和β亚基类似物cDNA共转染到哺乳动物细胞中来制得。
实施例13β亚基环2和α亚基环3之间含有二硫键的hCG类似物产生该二硫键的残基在认为未参与高亲和性受体接触的hCG区域内(Moyle等人，1995)。hCG的第二β亚基环和第三β亚基环均非促黄体素活性所需的，因此可以制得两者均缺失的有活性的hCG类似物(Moyle等人，1998)。另外，已经制得了具有全部活性的β亚基环2被其hFSH对应物代替的hCG类似物(Campbell等人，1991)。因此，本发明者预计，在蛋白的这些部分之间加入亚基内二硫键不会破坏其生物活性。该类似物可通过修饰编码hCGα和β亚基的载体并在哺乳动物细胞中共同表达这些载体来制得。α亚基构建物编码了具有表9所示称为αV76C的氨基酸序列的蛋白质。该构建物通过用寡核苷酸1131和1132作为引物(表5)，pMB589作为模板利用PCR诱变来制得。质粒pMB589是在pCI′中的一种构建物，它所编码的人α亚基类似物中Asn52的密码子被变成天冬氨酸，Arg42和Ser43的密码子被修饰产生沉默的BglII位点。
将pMB532的XhoI-BamHI插入物亚克隆到pCI′载体的XhoI-BamHI位点之间，制得pMB589，而pBM532则通过以寡核苷酸850和851为引物(表5)、以pMB507为模板的PCR从以前描述的构建物pMN507制得。用BglII和SpeI消化PCR产物，并亚克隆到pMB507的BglII和SpeI位点中并测序，获得pMB532。
用BglII和PstI消化PCR产物，将插入物克隆到pMB507的BglII和PstI位点中，产生pMB910。通过已经导入该构建物的额外的DraI位点的存在来鉴定阳性克隆。在用双脱氧法确认pMB910的DNA序列后，通过XhoI和BamHII消化从pMB910中除去编码整个α亚基类似物的DNA片段，并亚克隆到pCI′载体的XhoI和BamHI位点中，产生pMB926。pMB926编码αV76C。
为了产生αV76C的hCGβ亚基伙伴，制得编码hCGβ′V44C的载体。这是hCGβ亚基的类似物，预计它将和在pMB926同一细胞中表达的αV76C形成二硫键交联的异二聚体。合成寡核苷酸1133和1134(表5)，并连接到pKMB-β′的NgoMI-PstI位点中，产生pMB909。将pBM909的XhoI-BamHI片段转移到pCI′中，产生pMB941。表11显示了pMB941编码的hCGβV44C的氨基酸序列。
实施例14β亚基环2和α亚基环3之间含有二硫键的hFSH类似物根据hCG和hFSHβ亚基的氨基酸序列、尤其是半胱氨酸(表4)的相似性，预计此两种蛋白具有类似的结构。hCGβ亚基环2中Val44和α亚基环3中Val76的相对位置提示，将这些残基变为半胱氨酸将在β亚基环2和α亚基环3之间产生亚基间二硫键。Val38在hFSHβ亚基中占据的位置与hCGβ亚基中的Val44相似。因此，认为将hFSHβVal38变成半胱氨酸并使所得构建物和αV76C一起表达将导致二硫键交联的异二聚体。为了将hFSH中的Val38变成半胱氨酸，本发明者从pMB603开始，该构建物在pCI′载体中XoI和BamHI限制性位点之间含有减去非翻译3′和5′末端的hFSHβcDNA编码序列。pMB603的BstXI和PpuMI之间的小DNA片段被寡核苷酸1154和115(表5)退火制得的寡核苷酸盒取代。
筛选缺少BstXI位点且存在PpuMI位点的所得构建物，称为pMB920。在DNA测序确认所需变化存在后，将pMB920和pMB926(驱动αV76C表达的载体)一起共同转染到COS-7细胞中。该细胞将异二聚体分泌到培养基中，该异二聚体很容易在夹心免疫试验(用抗α亚基单克隆抗体A113作捕获抗体、用放射性标记的抗hFSHβ亚基的单克隆抗体B602)中检测到。表10中显示了pMB920编码的hFSHβ38C氨基酸序列。由αV76C和hFSHβV38C组成异二聚体在表达人FSH受体的CHO细胞中刺激了环腺苷酸的累积(图45)。
实施例15每个亚基N端之间以及半胱氨酸结节之间含有二硫键的hCG类似物前述的二硫键交联的异二聚体通过修饰每个亚基产生能参与亚基间二硫键的游离的巯基来制得。这里要说明的是，有可能只通过修饰hCG的β亚基来制备二硫键交联的hCG。hCG的晶体结构显示，α亚基Cys31位于β亚基Tyr37附近，两个亚基的侧链彼此指向对方。前面用该观察结果将亚基间二硫键插入hCGα亚基残基31和β亚基残基37之间。hCG的晶体结构还显示，α亚基残基Cys7位于hCGβ亚基残基Arg6附近。实际上，α亚基残基Cys7和Cys31位于β亚基残基Arg6和Tyr37附近，因此转变Arg6和Tyr37可能会促进形成含有αCys7-αCys31以及βCys6-βCys37亚基间二硫键的异二聚体、含有αCys7-βCys6以及αCys31-βCys37亚基间二硫键的异二聚体、或含有αCys7-βCys37和αCys31-βCys6亚基间二硫键的异二聚体。计算机模拟显示，这些二硫键每一个都能形成而蛋白不会有过度的应变。多个二硫键的形成可用来产生一组具有不同半衰期的异构体或同种型。这些异构体或同种型可能有新的治疗用途，特别是当生物应答需要“跳跃-启动”时。在使用这些物质时，可以给予大块类似物来启动激素应答。预计未交联的异二聚体组分的清除比交联的异二聚体更快。因此，最初的大量注射足以启动应答，但是它的活性会降低至较低的水平，该水平将长时间地维持以保持应答。预计该类似物还可作为中间产物来制备聚乙二醇化的类似物。半胱氨酸残基具有独特的反应性，通常希望在蛋白质表面增加游离的半胱氨酸。然而，由于半胱氨酸的反应性，这种类型的蛋白很难产生。已经知道，α亚基Cys7-Cys31二硫键很容易还原成产生游离半胱氨酸的状态。在β亚基中残基6和37之间引入半胱氨酸预计会产生相似类型的二硫键。预计这些二硫键中的半胱氨酸会比蛋白中的其它半胱氨酸更活泼，特别是因为它们在促进二硫键交换的位置中。因此，本发明者预计，可以使α亚基残基Cys7处已有的半胱氨酸和β亚基残基Cys6处加入的半胱氨酸和修饰蛋白的试剂反应。这些可包括能使蛋白聚乙二醇化、使其生物半衰期稳定的那些半胱氨酸。该方法中“释放出的”半胱氨酸能形成使蛋白质稳定的亚基间二硫键。该类似物的制备需要在已知为hCGβ′Y37C的类似物中加入第二个半胱氨酸。
用寡核苷酸1161和1163(表5)作为引物，pCI′-hCGβ′作为模板，通过PCR诱变制得编码类似物hCGβ′的构建物pMB940。寡核苷酸1161引导了位于pCI′载体内的序列，而寡核苷酸1163编码了突变。用XhoI和BanI消化PCR产物，和pSVL-hCGβ′Y37C获得的BanI-BamHI片段一起连接到pCI′的大的XhoI-BamHI片段中，产生pMB941。用双脱氧法确认pMB941编码序列的DNA序列。pMB941编码的氨基酸序列如下所示hCGβ′R6C，Y37CmemfqglllllllsmggtwaskeplCprcrpinatlavekegcpvcitvntticagCcptmtrvlqgvlpalpqvvcnyrdvrfesirlpgcprgvnpvvsyavalscqcalcrrsttdcggpkdhpltcddprfqdssssk将pMB940和pSV2Neo共同转染到CHO细胞中，选择对毒性药物G418有抗性的稳定的细胞系。用夹心免疫试验定量测定从培养基收获的蛋白，用抗α亚基抗体A113作捕获抗体，用放射性碘化的抗β亚基抗体B112作检测抗体。该试验确认培养基中存在异二聚体。在环腺苷酸累积试验中，用表达大鼠LH受体的CHO细胞测定该异二聚体的生物活性。图46描述了该试验的结果。
实施例16每个亚基N端之间以及半胱氨酸结节之间含有二硫键的hFSH类似物如前所述，多个二硫键的形成可能能用来产生一组具有不同半衰期的蛋白同种型。相似的类似物将提供一种改善的方法来刺激卵泡发育。不含亚基间二硫键因此不交联的异二聚体组分的清除应当比含有亚基间交联的异二聚体组分更快。因此，最初的大量注射足以刺激初始的卵泡发育，但是它的活性将降低至较低的水平，该水平应维持较长的时间。这将更接近地模拟卵泡期所见的FSH刺激类型，并可能减少过量刺激的机会。预计将半胱氨酸加到hFSHβ亚基N端或将hCGβ亚基氨基端加到hFSHβ亚基N端将有助于形成异二聚体和亚基间交联。预计hFSHβ亚基类似物形成与实施例15中的类似物相似的异二聚体将具有下列氨基酸序列hFSH′βR-2C，Y31CmemfqglllllllsmggtwaskeplCnsceltnitiavekegcgfcitinttwcagCcytrdlvykdparpkiqktctfkelvyetvrvpgcahhadslytypvatqchcgkcdsdstdctvrglgpsycsfgemke实施例17具有强效hFSH活性、含有类似于实施例15类似物的二硫键排列的hCG类似物β亚基氨基酸94-110被其hFSH对应物取代的hCG类似物具有高的FSH活性。含有hFSHβ亚基残基95-103代替hCGβ亚基残基101-109、且在β亚基残基6和37处有半胱氨酸的hCG和hFSH的嵌合物预计将形成和实施例15中类似的二硫键排列。预计它们也将具有高的FSH活性。这样一种类似物的β亚基的氨基酸序列将会是CFC94-117βR6C，Y37CmemfqglllllllsmggtwaskeplCprcrpinatlavekegcpvcitvntticagCcptmtrvlqgvlpalpqvvcnyrdvrfesirlpgcprgvnpvvsyavalscqcalcdsdstdctvrglgpsycsfgemkesssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq现在在全部描述了本发明后，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围下无需作过多试验，就可在范围相当宽的等价参数、浓度和条件下进行相同的发明。
尽管本发明已经联系特定的实例作了描述，但是应当理解，它能作进一步改进。本申请覆盖了通常按照本发明理论对本发明所作的任何变化、应用或改编，所包括对本文公开内容的改动是本发明所属领域内已知的或在常规实践内，可能适用于下文所附权利要求范围内的提出的必要技术特征。
本文引用的所有参考文献，包括杂志、论文或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请，均全部纳入本文作参考，其中包括引用文献中的所有数据、表格、图形以及文本。另外，本文引用的参考文献中引用的文献的全部内容也全部纳入本文作参考。
引用参考已知的方法步骤、或常规的方法步骤并不等于以任何方式承认本发明的所有方面、描述或实例已经在相关技术领域中公开、指出或有提示。
前面对特定实例的描述非常全面地揭示了本发明的总体特征，其它人无需作过多试验就可在不脱离本发明的总体思路下运用本领域技术人员已知的知识(包括本文引用文献中的内容)将这些具体实例改进和/或改用于各种应用。因此，根据本文的说明和指导，这些改动和变化均在所公开实例等价意义和范围内。应当理解，本文的措词和术语只是为了描述，而无限制性，本说明书的术语或措词可由本领域技术人员依据本文的说明和指导结合本领域普通技术人员的知识来作解释。
参考文献Adachi等人，J.Biol.Chem.2648537-41(1989)Alber等人，Biochemistry263751-3758(1987)Ausubel等人，《当代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublications and Wiley Interscience(New York，1987-1997)Baenziger等人，Biochim.Biophys.Acta947287-306(1988)Baenziger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89334-338(1992)Baird等人，Oxf.Rev.Reprod.Biol.15191-232(1993)Bedows等人，J.Biol.Chem.26811655-11662(1993)Berger等人，Molecular and Cellular Endocrinology12533-43(1996)Bernard等人，Mol.Cell.Endocrinol.71R19-R23(1990)Birken等人，J.Biol.Chem.26110719-10727(1986)Birken等人，Endocrinology1291551-1558(1991)Blithe等人，Endocrinology1292257-2259(1991)Blowmick等人，Mol.Endocrinol.101147-1159(1996)Bo等人，J.Biol.Chem.2673179-3184(1992)Braun等人，EMBO.J.101885-1890(1991)Braustein等人，Endocrinology911030-1036(1972)Brooker等人，Adv.Cyclic Nucl.Res.101-33(1979)Campbell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA88760-764(1991)Campbell等人，Mol.Cell.Endocrinol.83195-200(1992)Campbell等人，Nature Biotech.15439-443(1997)Chen等人，J.Biol.Chem.26619357-19361(1991)Cole等人，Cancer.Res.411615-1619(1981)Cole等人，Endocrinology1291559-1567(1991)Cole等人，J.Biol.Med.64627-637(1991)Cole等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.76704-710(1993)Cosowsky等人，J.Biol.Chem.27020011-20019(1995)
Cosowsky等人，J.Biol.Chem.2723309-3314(1997)DeBeer等人，Eur.J.Biochem.241229-242(1996)Fiddes等人，《激素研究进展》第40卷，R.O.Greep编辑，Academic Press，New York(1984)，第43-78页Fiete等人，Cell671103-1110(1991)Forastieri等人，J.Biol.Chem.2577976-7981(1982)Furuhashi等人，J.Biol.Chem.26925543-25548(1994)Galway等人，Endocrinology1273023-3028(1990)Gast，M.J.，Am.J.Obstet.Gynecol.172753-759(1995)Gennaro，A.，编辑，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmacautical Sciences)，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA，1990)Han等人，Mol.Cell.Endocrinol.124151-161(1996)Ho等人，Gene7751-59(1989)Huang等人，J.Biol.Chem.2689311-9315(1993)Imai等人，Bioconjug.Chem.1144-148(1990)Ji等人，Endocrinology1282648-2650(1991)Jia等人，Mol.Endocrinol.5759-768(1991)Jiang等人，Structure31341-1353(1995)Kardana等人，Endocrinology1291541-1550(1991)Kobe等人，Nature366751-756(1993)Kobe等人，Nature374183-186(1995)Kriegler，M.，《基因转移和表达实验手册》(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)Stockton Press，New York(1990)Lapthorn等人，Nature369455-461(1994)Lim等人，Nature33931-36(1989)Lim等人，Biochemistry314324-4333(1992)Loosfelt等人，Science245525-528(1989)Maniatis等人，《分子克隆实验手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)Matsumura等人，Nature342291-293(1989)
Matthews，B.W.，Biochemistry266885-6888(1987)Matzuk等人，J.Biol.Chem.2642409-2414(1989)McFarland等人，Science245494-499(1989)McIntosh等人，J.Biomolecular Structure and Dynamics521-33(1987)Mise等人，J.Biol.Chem.2558516-8522(1980)Mise等人，J.Biol.Chem.2566587-6592(1981)Moudgal等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.32579-581(1971)Moudgal等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.35113-116(1972)Moudgal，N.R.，Immunization with Hormones in ReproductionResearch，E.Nieschlag，编辑，North-Holland，Amsterdam(1976)，233页Moudgal等人，Fertility & Sterility30223-229(1978)Moyle等人，J.Biol.Chem.2509163-9169(1975)Moyle等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA792245-2249(1982)Moyle等人，J.Biol.Chem.2658511-8518(1990)Moyle等人，J.Biol.Chem.26610807-10812(1991)Moyle等人，Nature368251-255(1994)Moyle等人，Endocrinology，L.J.DeGroot，编辑，Saunders，Philadelphia(1995)，第230-241页Moyle等人，J.Biol.Chem.27020020-20031(1995)Moyle等人，Chemistry & Biology5241-254(1998)Murphy等人，Endocr.Rev.1227-44(1991)Nagayama等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1651184-1190(1989)Nagayama等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA88902-905(1991)Pal等人，Am.J.Reprod.Immunol.22124-126(1990)Okayama，Mol.Cel.Biol.3280(1983)Olive，D.L.，Am.J.Obstet.Gynecol.172759-765(1995)Overington等人，Protein Science1216-226(1992)Pierce等人，Ann.Rev.Biochem.50465-495(1981)
Ravindranath等人，J.Reprod.Fertil.8825-30(1990)Reddy等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA823644-3648(1985)Remy等人，Molecular and Cellular Endocrinology12579-91(1996)Rosa等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.591215-1219(1984)Segaloff等人，Recent.Prog.Horm.Res.46261-301，disc.(1990)Shoham等人，Fertil.Steril.561048-1053(1991)Singh等人，Fertil.Steril.52739-744(1989)Smith等人，J.Biol.Chem.268795-802(1993)Sprengel等人，Mol.Endocrinol.4525-530.
Sugahara等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA922041-2045(1995)Suganuma等人，J.Biol.Chem.26419302-19307(1989)Sun等人，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24269-291(1995)Talwar等人，Fertil.Steril.46120-126(1986)Talwar等人，Indian.Journal.of Experimental.Biology.30947-950(1992)van Dijk等人，Endocrinology132534-538(1993)Wang等人，《诱导排卵基础科学和临床进展》，M.Filicori和C.Flamigni编辑，Excerpta.Medica.Int′l.Congr.Series 1046，Elsevier Science B.V.Amsterdam(1994)，第191-196页Weare等人，J.Biol.Chem.2546964-6971(1979)Weare等人，J.Biol.Chem.2546972-6979(1979)Wehmann等人，Ann.Endocrinol.(Paris)45291-295(1984)Wu等人，Structure2545-558(1994)Xie等人，J.Biol.Chem.26521411-21414(1990)Yanisch-Perron等人，Gene33103-119(1985)
权利要求
1.一种糖蛋白激素类似物，它选自人绒膜促性腺激素hCG、人促黄体素hLH、人促卵泡激素hFSH、人促甲状腺激素hTSH、以及它们的功能性突变蛋白，它具有α亚基和β亚基，其中所述糖蛋白激素亚基的氨基酸序列经过修饰在所述α亚基环3和所述β亚基环2之间、或在所述α亚基环1和所述β亚基环2之间形成一个亚基间二硫键来改善稳定性，所述类似物保留了针对对应的天然糖蛋白激素受体的至少一部分生物活性。
2.根据权利要求1所述的类似物，其中所述α亚基的氨基酸序列经过修饰，Val76被半胱氨酸取代，所述hFSHβ亚基经修饰，Val38被半胱氨酸取代，从而在所述α亚基的残基76和所述hFSHβ亚基的残基38之间产生一个亚基间二硫键。
3.一种药物组合物，它包含有效量的权利要求1所述的类似物以及药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，它是一种液体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，它是稳定的。
6.权利要求3所述的药物组合物用于制备治疗不育症的药物中的用途。
7.权利要求3所述的药物组合物用于制备限制生育力的药物中的用途。
8.一种重组DNA分子，它包含编码权利要求1所述的类似物α亚基的核苷酸序列。
9.根据权利要求3所述的重组DNA分子，它是一种表达载体。
10.一种用权利要求9所述的重组DNA分子转化的真核宿主细胞，其中所述宿主细胞能表达糖蛋白激素类似物的α亚基。
11.一种重组DNA分子，它包含编码权利要求1所述的类似物的β亚基的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的重组DNA分子，它是一种表达载体。
13.一种用权利要求11所述的重组DNA分子转化的真核宿主细胞，其中所述宿主细胞能表达糖蛋白激素类似物的β亚基。
14.一种生产权利要求1所述的类似物的方法，该方法包括下列步骤培养经同一表达载体或分开的表达载体上携带的α和β亚基核苷酸序列转化的真核宿主细胞；表达该类似物；和回收表达的类似物。
全文摘要
本发明涉及具有亚基间二硫键交联的糖蛋白激素类似物及其制备和应用。本发明还公开了对应的DNA序列、宿主细胞以及药物组合物。
文档编号A61K38/00GK1548458SQ20031010284
公开日2004年11月24日 申请日期1998年6月25日 优先权日1997年6月25日
发明者W·R·莫伊尔, W R 莫伊尔 申请人:应用研究系统Ars股份公司