一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法
【专利摘要】一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，其特征在于，经过以下步骤：步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL，IL-1及受试药物，培养24小时。步骤4，检测以下项目中的任何一项：检测内皮细胞中的MCP-1，TNFα的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。
【专利说明】一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种药物的药效评价方法，特别涉及一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法。
【背景技术】:
[0002]关于动脉粥样硬化(AS)的发病机制曾有以下几种学说:脂质浸润学说、血小板聚集和血栓形成学说、单克隆平滑肌细胞增生学说及免疫学说和损伤反应学说，其中损伤反应学说和由此发展而来的炎症理论，较为全面地解释了 AS的形成发展过程。目前认为，AS从发生发展到转归的全过程就是一个慢性的炎症过程，众多炎症细胞和炎症介质参与其中，但炎症参与AS过程的作用机制至今尚未完全阐明，目前研究主要集中于各种炎症细胞、炎症介质的作用及相互关系方面。
[0003]AS病灶内存在内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞和肥大细胞等主要细胞，目前研究较多且与AS发生和发展关系较为密切的炎症细胞是单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞。
[0004]在AS发病过程中，补体系统的参与也促进了炎症反应。现已在AS病灶中发现了 Cl?9等补体固有成分以及多种补体活化片段，尤其是补体活化终末攻膜复合物C5b9(MAC)存在于所有增厚的动脉内膜及纤维斑块中。CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜表面的补体调节蛋白，其在调节MAC装组中发挥着关键作用。最近研究表明，较对照组相比⑶59与ApoE基因共敲除小鼠发生AS的进程加速，而此效应在内皮细胞过度表达⑶59时被削弱，研究者证实MAC有促AS作用，而⑶59则抑制AS，提示抑制MAC形成可能是一种抗AS疗法。
[0005]随着研究的深入，已发现越来越多的炎症介质参与了 AS的发生与发展。各种炎症细胞通过相关的细胞因子、黏附分子等炎症介质相互关联、相互作用，从而构成了复杂的网络，它们级联放大了炎症反应，共同促进了 AS的进展。如:C反应蛋白(CRP)，黏附分子，MCP-1，IL-6，TNF-a，salusins，除上述炎症介质以外，目前已经发现与AS关系较密切炎症介质还有 IL-2、IL-4、IL-10、IL-18、IFN1、TGF-β 等等。
[0006]AS从起始发病到出现临床心血管事件的整个过程中，炎症反应都发挥着重要的作用，然而目前人们对于这个复杂网络的众多环节所起的具体作用及其机制还知之甚少。此夕卜，虽然在一些AS动物模型中，针对炎症多个环节的抗炎治疗都取得一定的疗效，但临床上尚缺乏系统的大规|旲的实验研究。
[0007]炎症反应在动脉粥样硬化(AS)形成、发展的各个阶段普遍存在。单核细胞(MC)、内皮细胞(EC)、平滑肌细胞(SMC)之间的相互作用及触发的后继效应是AS炎症反应的核心环节。
[0008]本发明根据上述细胞之间的相互作用关系，开发了一种药物筛选模型，以期通过一种简单实用的方法对抗动脉粥样硬化的药物进行药效筛选，该方法用体外培养细胞的方法，可以大规模的进行药物初筛，给新药研发提供一种新的有效的筛选方法。[0009]本发明针对AS形成及炎症反应过程中复杂的细胞间相互关系，以MillicellOinsert为载体，采用EC-SMC-MC共培养的方法，观察在AS危险因子oxLDL和IL-1 β刺激下三种细胞的相互作用及其功能的特征性改变，以此构建AS治疗药物药效研究的新的方法和评价体系，为从炎症角度干预AS的药物研究提供有效工具。
【发明内容】
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[0010]本发明是一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，所述方法采用oxLDL和IL-1作为刺激因子，作用于内皮细胞-平滑肌细胞-单核细胞(EC-SMC-MC)共培养体系中，具有明显动脉粥样硬化炎性反应特征。
[0011]本发明所述的方法，实际操作需要经过以下步骤:
[0012]步骤I，将平滑肌细胞以种植于MiIlicelIOinsert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转；
[0013]步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天；
[0014]步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1及受试药物，培养24小时。
[0015]步骤4，检测以下项目中的任何一项:检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。所述步骤I，方法如下:
[0016]将平滑肌细胞种植于MiIlicelIOinsert的PE膜外侧，8h后翻转。
[0017]所述步骤2，方法如下:
[0018]翻转后在MillicellOinsert的PE膜的内侧种植内皮细胞,共培养6天。
[0019]所述步骤3，方法如下:
[0020]以IX 105/cm2接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1 β及受试药物，培养24h。
[0021]所述步骤4，其中，
[0022]检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量方法如下:
[0023]吸取MillicellOinsert内培养基，反复3次，然后吸尽上清，离心，取上清，检测EC层 MCP-1，TNFa ；
[0024]检测单核细胞表面⑶36的含量方法如下:
[0025]离心后得到的沉淀为单核THP-1细胞沉淀，重悬于Iml PBS,流式细胞仪检测单核细胞表面⑶36 ；
[0026]检测平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量方法如下:
[0027]吸取下层培养板内培养基，离心，取上清，检测MDA，MMP2含量;Millicell@insert膜免疫荧光染色取材方法如下:
[0028]取出MilliCell@inSert，PBS清洗insert内侧膜、外侧膜各3次，用手术刀片将膜沿insert边缘轻轻切下,每组2个insert内侧膜朝上，2个insert外侧膜朝上，粘片剂将膜固定在载玻片上。
[0029]观察内皮细胞ICAM-1的表达方法如下:
[0030]Insert内侧膜即EC层细胞滴加PBS50 μ I洗I次，吸尽PBS后，滴加PE-1CAM-1抗体10 μ I，培养箱中闭光孵育30min后，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。[0031]观察平滑肌细胞骨架的变化方法如下:
[0032]Insert外侧膜即平滑肌细胞层用3.7%多聚甲醒固定IOmin,丙酮脱水Imin,
0.2%TritonX100室温下渗透lOmin，再用PBS轻洗两遍，滴加10 μ g/ml FITC-鬼笔环肽20 μ 1，培养箱中闭光孵育30min，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm观察细胞骨架的变化；
[0033]本发明中，模型建立方法属创新方法，各个指标的检测方法均属于现有技术范畴，可以采用文献报道的方法进行检测，在该创新模型中各指标的检测结果可以判断药物的有效性。
[0034]本发明所述方法，其中有关名称术语的解释如下:
[0035]血管平滑肌细胞:血管平滑肌(vascular smooth muscle)是指存在于血管壁且组成其主要部分的特定类型平滑肌。构成平滑肌的细胞称为血管平滑肌细胞。
[0036]HASMC:人类胳动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells)。
[0037]种植:将细胞悬液接种在培养介质表面的过程。
[0038]Millicelliinsert 的 PE 膜外侧:MiIlicelIOinsert 是一个共培养小室的品牌，PE膜是共培养小室底层接种细胞的膜的材料名称。共培养小室是一个悬空站立在培养板中的小培养室，培养室底层的膜内、外侧都可以接种细胞，朝下的一侧，称为外侧。
[0039]Millicelliinsert的PE膜内侧:共培养小室朝上的一侧，称为内侧。细胞贴壁:细胞从悬浮状态到全部伸展、附着在培养介质上的过程。内皮细胞:内皮细胞是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁的接口。
`[0040]HUAEC:人类胳动脉内皮细胞(Human Umbilical Artery Endothelial Cells)。
[0041]细胞培养:细胞培养(Cell culture)是一种技术，是将真核生物或原核生物细胞培养在受控制的状态下，使其生长。这项技术的发展与方法，与组织培养或器官培养关系密切。培养液采用DMEM、RPM1-1640 (Gibicol)培养基，加入培养基的量为MillicellOinsert上层0.4ml/孔,下层培养板0.6ml/孔。
[0042]单核细胞:单核细胞(Monocyte)是人体免疫系统中的一种白细胞。其在人体免疫系统内有两种作用:1.补充正常状态下的巨噬细胞和树状细胞；2.在有炎症信号下，单核细胞会在8到12小时快速聚集到感染组织，并分化出巨噬细胞和树状细胞产生免疫反应。
[0043]单核细胞THP-1:人急性单核细胞白血病细胞株的名称，为悬浮生长细胞。
[0044]oxLDL:氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein)。
[0045]IL-1:白细胞介素-1 (Interleukin-1) ?
[0046]受试药物:在实验中被观察的对象。
[0047]检测内皮细胞中的MCP-1, TNF α 的含量:MCP-1 (monocyte chemoattractantprotein-1),单核细胞趋化蛋白，可趋化血液中单核细胞向炎症部位的募集。TNFa，肿瘤坏死因子，是一种既能直接杀死肿瘤细胞，又能通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用的细胞因子。用试剂盒检测细胞中MCP-1和TNFa，可评价药物对细胞炎症反应的作用。
[0048]检测单核细胞表面⑶36的含量:⑶36，B类清道夫受体，主要表达在单核细胞表面。检测单核细胞表面CD36的表达水平可评价单核细胞摄取脂质的能力。
[0049]检测平滑肌细胞中的MMP2，MDA的含量:基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase, MMP )是一种Zn2 +依赖性的中性蛋白酶家族。其主要功能是降解和再塑造细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡，参与人体许多病理和生理过程。MDA (alondialdehyde),丙二醒,脂质氧化终产物,与脂蛋白交联有毒性作用,在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。检测MMP2，MDA的变化可评价平滑肌细胞对斑块稳定的影响。
[0050]观察平滑肌细胞骨架的变化:细胞骨架概念是在细胞核中存在的核骨架-核纤层体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。观察平滑肌细胞骨架的变化可评价细胞在病理状态下细胞收缩的程度。
[0051]观察内皮细胞ICAM-1的表达:ICAM_1 (细胞间黏附分子_1)，又叫做⑶54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1在静息的血管内皮细胞(VEC)上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。
[0052]参莲提取物:是一个中药复方提取物，其配方如下:丹参:穿心莲=15:9 (W/W)，其制备方法如下:采用乙醇提取、提取物用大孔吸附树脂富集纯化的方法制备，提取物中含丹参酮IIA3%、丹酚酸B38%、穿心莲内酯20%。
[0053]用本发明的方法对参莲提取物进行了测试，其结果如下:
[0054]用已经体内实验验证对AS形成及其炎症反应有肯定疗效的参莲提取物为例，以Millicelliinsert EC-SMC-MC共培养体系为工具，从细胞、分子水平深入探讨参莲提取物对AS炎症反应的作用与机制。证实参莲提取物可通过影响THP-1膜分子CD36表达、黏附功能；影响HUVEC膜分子ICAM-1表达、TNFa，MCP-1分泌，HUSMC细胞骨架表达；影响HUSMC的MMP2、MMP9分泌等多个环节干预AS进程及炎症反应，与前期体内实验结果相应。
[0055]参莲提取物药效验证
[0056]1、参莲提取物对共培养体系中THP-1膜分子⑶36表达的影响
[0057]采用流式细胞术检测。细胞加入不同浓度的药物37°C预处置并施以IL-1 β (终浓度10ng/ml)或ox-LDL (终浓度100 μ g/ml)刺激细胞，后分别加入已优化效价的PE-⑶3610 μ 1，室温避光孵育30min，PBS洗3次，重悬细胞，流式细胞术检测参莲提取物对膜⑶36表达的影响。
[0058]结果表明，与对照组比较，模型组THP-1表面⑶36表达阳性率明显增高，SL组明显抑制CD36表达(Ρ〈0.01)。
[0059]表I参莲提取物对共培养体系中THP-1膜分子⑶36表达的影响
【权利要求】
1.一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法，其特征在于所述方法包括，采用OxLDL和IL-1作为刺激因子，作用于内皮细胞-平滑肌细胞-单核细胞(EC-SMC-MC)共培养体系，用所述方法建立的药效评价模型具有明显动脉粥样硬化炎性反应特征。
2.一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价模型的建立方法，其特征在于，经过以下步骤: 步骤1，将平滑肌细胞以种植于Millicell@insert的PE膜外侧，8h待细胞贴壁后翻转； 步骤2，在膜的内侧面种植内皮细胞，共培养6天； 步骤3，接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1及受试药物，培养24小时。 步骤4，检测以下项目中的任何一项:检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量；单核细胞表面CD36的含量；平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量，观察平滑肌细胞骨架的变化；观察内皮细胞ICAM-1的表达。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤3，方法如下: 以IX 105/cm2接种单核细胞THP-1，加入oxLDL, IL-1 β及受试药物，培养24h。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， 检测内皮细胞中的MCP-1，TNFa的含量方法如下: 吸取MillicellOinsert内培养基，反复3次，然后吸尽上清，离心，取上清，检测EC层MCP-1，TNFa。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， 检测单核细胞表面CD36的含量方法如下: 离心后得到的沉淀为单核THP-1细胞沉淀，重悬于Iml PBS,流式细胞仪检测单核细胞表面⑶36。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， 检测平滑肌细胞中的MDA，MMP2的含量方法如下: 吸取下层培养板内培养基，离心，取上清，检测MDA，MMP2含量。
7.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， Millicelliinsert膜免疫荧光染色取材方法如下: 取出MillicellOinsert，PBS清洗insert内侧膜、外侧膜各3次，用手术刀片将膜沿insert边缘轻轻切下,每组2个insert内侧膜朝上，2个insert外侧膜朝上，粘片剂将膜固定在载玻片上。
8.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， 观察内皮细胞ICAM-1的表达方法如下: Insert内侧膜即EC层细胞滴加PBS50 μ I洗I次，吸尽PBS后，滴加PE-1CAM-1抗体10μ 1，培养箱中闭光孵育30min后，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜575nm检测ICAM-1表达。
9.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤4，其中， 观察平滑肌细胞骨架的变化方法如下: Insert外侧膜即平滑肌细胞层用3.7%多聚甲醒固定IOmin,丙酮脱水Imin,0.2%TritonX100室温下渗透lOmin，再用PBS轻洗两遍，滴加10 μ g/ml FITC-鬼笔环肽. 20 μ 1，培养箱中闭光孵育30min，PBS清洗2遍，激光共聚焦显微镜488nm观察细胞骨架的变化。
10.权利要求1或2任何一项所述方法在动脉粥样硬化药效评价中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK103558392SQ201310487504
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】朱晓新, 李玉洁, 杨庆, 翁小刚, 陈颖, 王娅杰 申请人:中国中医科学院中药研究所