新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域，所述试剂盒包括样品稀释液，酶标板和新霉素金标快速检测条，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述金标结合垫是胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有二条检测线和一条质控线，通过胶体金免疫层析技术将新霉素抗体和抗原的反应以有色反应显现出来，检测过程中可通过两种检测线颜色的变化判定乳制品中是否存在新霉素残留及其残留量范围。本发明的检测试剂盒能够实现残留物的半定量检测，检测方法简单、时间短，检测成本低，检测范围广，检测结果精确可靠，可广泛应用于食品中新霉素半定量检测。
【专利说明】新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学领域，涉及快速检测食品中氨基糖苷类抗生素新霉素残留的试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食物的要求已不是简单的填饱肚子，而是更多的关注食品的营养和安全。由于乳制品中除含有高质量蛋白质、脂肪、碳水化物外，还含有大量维生素和矿物质，被公认为迄今为止的一种比较理想的食品，因此乳和乳制品已成为人们非常喜爱的日常食品之一。
[0003]从大环境上看，预计在未来三年，中国的城市化速度进一步加强，到2013年，中国的城市人口可能超过农村人口，成为真正的以城市消费带动全国消费的国家。再加上城乡人口可支配收入的不断增加以及三农政策的进一步落实和西部大开发进入攻坚阶段，在客观环境上，给中国乳业的发展提供了更加良好的平台。
[0004]然而近几年来，市场上频繁出现劣质奶粉、勾兑酸奶、毒奶粉等恶性事件，乳品安全问题由此受到了全民的广泛关注。自2008年以来乳制品安全问题层出不穷，在全国乃至全世界都造成了巨大的影响，给广大消费者、乳制品行业以及众多的奶牛养殖户都带来很大的损失。
[0005]乳制品的安全必须从源头抓起，通过各种检测技术对质量进行层层控制。由于乳制品生产涉及的原料数量巨大、来源众多，因此如何实现原料的快速流通，实现大量原料奶样品准确快速的筛选，是目前检测技术急需突破的难点之一。
[0006]新霉素(neomycin, ΝΕ0)属于氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides),是由新霉胺和新霉二糖胺结合而成的，其抗菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、结核杆菌、抗酸菌等均有良好的抑制作用。新霉素作为一种常用兽药，常用于抑制畜禽的细菌性胃肠道感染。随着新霉素在国内外养殖业中越来越广泛地应用，其在动物源性食品中的残留问题也日益突出。当其残留量超过一定范围时会对人和动物产生潜在的耳毒性和肾毒性，给人类健康造成了很大威胁。
[0007]我国农业部235号公告(2002)规定的新霉素最高残留限量为:牛奶、羊奶500 μ g/kg,鸡蛋SOOyg/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肌肉、脂肪、肝脏500 μ g/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肾脏10000 μ g/kg。目前，新霉素的残留检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法和免疫学测定法。这几种方法各有优势，但都不能用于大量样品的快速筛选检测。
[0008]免疫层析测试技术是九十年代初发展起来的一项新技术，因其具有简便、快速、直观、敏感、高特异性等特点，在临床诊断等诸多领域已得到广泛应用，主要用于快速检测血清或尿样中的抗原成分；也可用于检测样品中的致病菌和其它有害成分等。目前也已在该方法灵敏度高和特异性强，反应快速，操作简便，不需任何特殊仪器设备，适用于大量样品的快速筛查和现场检测。[0009]中国专利CN102778563A公开了一种胶体金试纸条，该试纸条由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠黏贴在塑料衬板上构成，硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，金标垫包被有胶体金标记的能识别新霉素，阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体。该发明还公开了一种胶体金试纸条的使用方法及其在新霉素残留检测中的应用。该发明可用于对牛奶、鸡肉、猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝等组织样品进行新霉素残留快速检测，最低检测限为500 μ g/L，但低于农业部235公告中对新霉素在牛奶中的残留限量400ng/kg的规定，且不能够进行半定量检测。
[0010]综上所述，现有免疫层析技术的应用仍然存在无法实现残留物的半定量检测、检测方法繁琐、检测耗时长、在实际工作中应用局限性大等缺陷。
【发明内容】
[0011]本发明的首要目的是提供一种食品中新霉素半定量快速检测试剂盒，利用免疫层析技术实现牛奶等样品中新霉素残留的半定量检测，使之具备当前快速检测产品所有优点的同时能够实现残留物的半定量检测，并且检测方法简单、时间短，可广泛应用于实际工作，为新霉素的残留检测提供了一种更安全、更简便的检测试剂盒及其检测方法。
[0012]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0013]一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒，包括样品稀释液、酶标板和试纸条，所述试纸条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上，样品垫和金标抗体结合垫上包被有MAX线。
[0014]所述金标抗体结合垫上包被胶体金颗粒标记的新霉素单克隆抗体；
[0015]所述硝酸纤维素膜上包被有两条检测线(T线)和一条质控线(C线)，靠近金标抗体结合垫一端的为T1线，T1上包被有低浓度的新霉素-蛋白偶联物，靠近吸水垫一端的为T2线，T2线上包被有高浓度的新霉素-蛋白偶联物，浓度分别为0.05mg/mL和0.lmg/mL，包被量为I μ L/cm ；
[0016]所述质控线为能特异性认识单克隆抗体的羊抗鼠单克隆抗体,浓度为lmg/mL,包被量为I μ L/cm ；
[0017]所述试纸条的制备方法包括如下步骤:
[0018]一、金标抗体结合垫的制备
[0019]1.空白胶体金的制备:
[0020]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒为25nm的胶体金溶液，具体方法为:在带有磁力搅拌子的三角烧瓶中加入97.5ml双蒸水和Iml 1%氯金酸溶液加热至沸腾并持续沸腾3?5min后，加入1.5mLl%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态IOmin后停止加热，将烧瓶中的搅拌子取出，溶液置室温充分冷却后，冷藏备用；
[0021]2.胶体金标记抗体的制备:
[0022]取空白胶体金溶液100ml，加入浓度为0.lg/L的碳酸钾溶液400?450 μ L，匀速缓慢搅拌7?IOmin后，在搅拌状态下逐滴加入稀释好的待标记抗体，ImL胶体金颗粒标记新霉素单克隆抗体的量为3ng，继续搅拌30min后，离心，吸除上清，沉淀用金标抗体重悬液充分重悬；
[0023]所述金标抗体重悬液由四硼酸钠、硼酸、蔗糖以及牛血清白等，其主用作用为将经离心后沉淀下来的胶体金标记抗体重新溶解并保证抗体应有的特性及其稳定性。
[0024]3.金标抗体结合垫的制备:
[0025]将重悬好的金标抗体用金标抗体重悬液进行对倍稀释后，按每条2ml的量包被于尺寸为30*lcm玻璃纤维素膜上，37°C干燥过夜，干燥后成金标抗体结合垫，于密封避光干燥处保存，使用时取出。
[0026]二、硝酸纤维素膜上T、C线的包被
[0027]1.新霉素-蛋白偶联物的制备
[0028]取16mg NEO (新霉素)溶于ImL PBS中，20mg BSA (牛血清白蛋白)溶于ImL PBS中，将NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力搅拌器上搅拌，取EDC (水溶性碳化二亚胺)30mg溶于1.5mL PBS中，将EDC液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应2h，再将IOmg EDC溶于0.5mLPBS中，逐滴加入，室温搅拌反应24h.。将反应产物装入透析袋透析3d，每8h换液一次，透析后分装于-20°C贮存。
[0029]2.T、C线的包被
[0030]调试好三维喷点平台，将2种高低不同浓度的新霉素蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为质控线，每条线间的间隔为5mm±0.1mm，37°C干燥2h，密封避光干燥处保存；
[0031]三、试纸条的组装
[0032]将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，并在样品垫和金标抗体结合垫的表面覆上MAX线，最后将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条。
[0033]所述稀释液为常用的磷酸缓冲溶液，内含表面活性剂，主要用于样品的稀释，并将样品的PH值调整到最适状态；
[0034]所述酶标板为96孔酶标板，其主要用于样品溶液的混匀并在检测过程中担当载体的作用。
[0035]本发明的另一目的是利用一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒检测食品中新霉素残留量的方法，包括以下步骤:
[0036]一、样本检测
[0037]1.原料奶样本的检测
[0038](I)取所需数量的微孔，置于微孔板上；
[0039](2)向每个微孔中依次加入100 μ L样品稀释液和100 μ L待测奶样，混匀；
[0040](3)向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效。
[0041]2.奶粉样本的检测
[0042](I)称取1.2g奶粉样品，加入8.8mL蒸馏水溶解；
[0043](2)取所需数量的微孔，置于微孔板上；
[0044](3)向每个微孔中依次加入100 μ L样品稀释液和100 μ L待测奶样，混匀。
[0045](4)向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效。
[0046]二、结果判断
[0047]读取结果时，检测条应如图2所示摆放方式，置于观察者的正面，请勿从检测条侧面或倒置检测条进行结果观察，结果判定如图2所示:[0048]?阴性:T线(检测线，靠近样品溶液的一端)和C线(对照线)均显色，且无论显色深浅都判断为阴性，表示牛奶样品中新霉素浓度低于200ppb或不含新霉素残留。
[0049]?阳性:C线显色，同时T2线显色而Tl线不显色，说明牛奶样品的新霉素的残留超过200ppb，但不高于400ppb ;当C线显色，而两条T线均不显色时，说明牛奶样品中的新霉素含量超过400ppb。
[0050]?无效:C线未显色，无论T线有无显色，均表明不正确的操作过程或检测条已失效。
[0051]本发明试剂盒的技术原理如下:
[0052]根据抗原抗体反应原理，进行抗体胶体金的有效标记，同时在硝酸纤维素膜上划制两条不同检测浓度的新霉素-蛋白偶联物作为检测线，该偶联物能够与样本中的新霉素残留物共同竞争金标记新霉素单克隆抗体形成有效的竞争抑制反应；再划制一条浓度为lmg/ml羊抗鼠单克隆抗体作为质控线。在层析过程中样本中的目标物残留物与金标抗体结合垫上金标复合物发生反应，当层析到检测线时，游离的金标抗体与与检测线上蛋白偶联物相结合，同时由于抗原抗体的可逆性反应，蛋白偶联物还竞争已与目标物结合的金标抗体从而被检测线捕获显色。样本中目标物残留量越多检测线显色就越浅，当样本中的目标物达到一定浓度时，检测线由于捕获不到金标抗体不再显色；多余的金标复合物继续层析，达到质控线时被其上包被的羊抗鼠单克隆抗体捕获从而显色。
[0053]本发明还有一个目的 是一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒在食品中新霉素残留量测定的应用。
[0054]有益效果:
[0055]该试剂盒主用的技术原理为通过胶体金免疫层析技术将小分子兽药新霉素残留检测以可见的抗原抗体反应呈现出来，又通过两条检测线的控制，实现了乳制品中新霉素残留物的半定量快速检测。仅需通过对样本简单的前处理，在10-20min内即可实现对新霉素的残留检测。该试剂盒具有以下特点:
[0056]1.前处理简单:只需将样品离心后取下层脱脂奶再进行对倍稀释后就可实现对乳制品中新霉素的检测；
[0057]2.检测时间短:在10-20min内即可实现对新霉素残留检测；
[0058]3.可实现半定量检测:通过两条检测线的控制，根据显色情况的不同，可实现样品中新霉素残留的半定量检测；
[0059]4.单个样品检测成本低:相对于仪器和ELISA检测，单个样本所需检测费用更低；
[0060]5.适用范围广:由于检测条对操作环境要求不高也无需昂贵仪器支持，可实现实验室、野外以及现场的检测；
[0061]6.适用于大量样品的快速筛选:由于具有前处理方法简单、操作时间短等特点，可用于大量样品的同时快速筛选检测；
[0062]7.人员要求低:由于在整个检测过程中需用的仪器及试剂较少，对实验人员的专业要求不高，整个操作过程简单，检测结果肉眼就能进行判读；
[0063]8.安全性较高:试剂盒内无任何有毒有害物质；
[0064]9.本产品与链霉素、卡那霉素、庆大霉素等其他氨基糖苷类抗生素交叉反应率〈0.1%，与β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、磺胺类和喹诺酮类等其他种类药物交叉反应率〈0.1%。
[0065]本发明所研究的新霉素半定量金标快速检测试剂盒，实现了对乳制品中新霉素残留检测并可对其残留量进行半定量，具有检测时间短，检测成本低，检测范围广等特点；检测灵敏度符合国家和欧盟标准。因此，它符合国家对食品安全与出入境检验检疫中检测技术的发展要求，有利于提高食品安全与出入境检验检疫工作的效率与准确率，有利于保证食品安全与进出口贸易，从而在公共安全领域发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0066]图1为试纸条结构示意图
[0067]图中，1-PVC底衬2-吸水垫3-质控线4_Τ2线5_Τ1线6_金标抗体结合垫
[0068]7-样品垫；
[0069]图2为结果判定方法示意图
[0070]图中，a_阴性b_阳性C-无效；
[0071]图3为实施例4检测结果说明图
【具体实施方式】
[0072]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0073]实施例1试剂盒的灵敏度实验
[0074]对于新霉素农业部235公告中规定其在牛奶中的残留限量为400ng/kg，目前没有国家标准可参考，仅在GB/T21323-2007 (动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱质谱法)中有提及，但该方法只适用于动物组织中新霉素的残留检测。荷兰EUR0-PR0XIMA新霉素检测试剂盒可用于检测牛奶样品中该药物的残留检测，检测灵敏度为18ng/ml，可满足阴性样品的筛选要求。
[0075]取5份经荷兰EUR0-PR0XIMA新霉素检测试剂盒和经GB/T22969-2008国标方法检测不含氨基糖苷类抗生素的牛奶样本，进行不同浓度标准品的添加(表I)。每份样品重复测定5次，以95%出现阳性结果的最低浓度作为试剂盒的检测灵敏度。
[0076]5份奶样不同浓度标准品添加的灵敏度测定结果见表I。结果表明，新霉素半定量金标快速检测条，当其样品中新霉素添加浓度达到200ng/mL时，Tl线(靠近加样端一侧)在75次检测中仅有I份为阴性，阳性检出率为98.7% ;当其添加浓度达到400ng/mL时，Tl和T2线阳性均为100%。因此，该试剂盒的两条检测线灵敏度分别为200和400ng/mL。
[0077]表I新霉素灵敏度实验结果
[0078]
【权利要求】
1.一种新霉素金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括稀释液、酶标板和试纸条，所述试纸条包括样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有两条检测线和一条质控线，两条检测线分别设置有能与金标新霉素单克隆抗体进行特异性结合的不同浓度的新霉素蛋白偶联抗原，质控线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含有表面活性剂的磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述金标抗体结合垫上的胶体金标记的新霉素单克隆抗体由新霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒以物理的方法结合组成。
4.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上检测线包被的新霉素蛋白偶联抗原，靠近胶体金结合垫端的包被浓度为0.05mg/ml,靠近吸水垫端的包被浓度为0.lmg/ml,包被量均为1μ L/cm。
5.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上质控线包被羊抗鼠单克隆抗体，浓度为lmg/mL,包被量为1μ L/cm。
6.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫和金标抗体结合垫上包被有MAX线。
7.根据权利要求1所述的一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤: (1)金标抗体结合垫的制备 ①.空白胶体金的制备: 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒为25nm的胶体金溶液，具体方法为:在带有磁力搅拌子的三角烧瓶中加入97.5ml双蒸水和Iml 1%氯金酸溶液加热至沸腾并持续沸腾3~5min后，加入1.5mLl%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态IOmin后停止加热，将烧瓶中的搅拌子取出，溶液置室温充分冷却后，冷藏备用； ②.胶体金标记抗体的制备: 取空白胶体金溶液100ml，加入浓度为0.lg/L的碳酸钾溶液400~450 μ L，匀速缓慢搅拌7~IOmin后,在搅拌状态下逐滴加入稀释好的待标记抗体，1mL胶体金颗粒标记新霉素单克隆抗体的量为3ng，继续搅拌30min后，离心，吸除上清，沉淀用金标抗体重悬液充分重悬； ③.金标抗体结合垫的制备: 将重悬好的金标抗体用金标抗体重悬液进行对倍稀释后，按每条2ml的量包被于尺寸为30*lcm玻璃纤维素膜上，37°C干燥过夜，干燥后成金标抗体结合垫，于密封避光干燥处保存，使用时取出。 (2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被 ①.新霉素-蛋白偶联物的制备 取16mg NEO (新霉素)溶于1mL PBS中，20mg BSA (牛血清白蛋白)溶于1ImLPBS中，将NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力搅拌器上搅拌，取EDC (水溶性碳化二亚胺)30mg溶于1.5mL PBS中，将EDC液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应2h，再将IOmg EDC溶于0.5mLPBS中，逐滴加入，室温搅拌反应24h.。将反应产物装入透析袋透析3d，每8h换液一次，透析后分装于-20°C贮存。 ②.T、C线的包被 调试好三维喷点平台，将2种高低不同浓度的新霉素蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为质控线，每条线间的间隔为5mm±0.1mm，37°C干燥2h，密封避光干燥处保存； (3)试纸条的组装 将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，并在样品垫和金标抗体结合垫的表面覆上MAX线，最后将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条。
8.根据权利要求7所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述金标抗体重悬液包括 四硼酸钠、硼酸、蔗糖以及牛血清白。
9.根据权利要求1所述的一种新霉素金标快速检测试剂盒检测食品中新霉素残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤: 一、样本检测 (1)取所需数量的微孔，置于微孔板上； (2)向每个微孔中依次加入100μ L样品稀释液和100 μ L待测样品，混勾； (3)向每孔中插入金标检测条，等待5分钟观察结果，30分钟后结果无效； 二、结果判断 阴性:Τ线和C线均显色，且无论显色深浅都判断为阴性，表示样品中新霉素浓度低于200ppb或不含新霉素残留； 阳性:C线显色，同时T2线显色而Tl线不显色，说明样品的新霉素的残留超过200ppb，但不高于400ppb ；当C线显色，而两条T线均不显色时，说明样品中的新霉素含量超过400ppb ； 无效:C线未显色，无论T线有无显色，均表明不正确的操作过程或检测条已失效。
10.如权利要求1-6任意一项所述的新霉素金标快速检测试剂盒在食品检测中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103743908SQ201310529332
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】王丽哲, 唐慧林, 何艳玲, 赵瑜, 王丽丽, 于重楠, 刘敏, 李瑾 申请人:北京陆桥技术有限责任公司