淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种淮山药温和花叶病毒（Yam?mild?mosaic?virus,YMMV）的多克隆抗体制备、检测及其应用。基于YMMV基因组，发明人通过原核表达纯化YMMV的核包涵体蛋白/外壳蛋白（NIb/CP）并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达YMMV的NIb/CP蛋白和侵染淮山药的YMMV病毒的NIb/CP蛋白，并产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏和准确的IC-RT-PCR、ELISA和Western?blot方法，可以特异性地从感染YMMV的淮山药植株中检测出YMMV。应用本发明，可为YMMV与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。
【专利说明】淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白原核表达、多克隆抗体制备、检测及其应用。
【背景技术】
[0002]淮山药又称山药、淮山，为薯蓣科植物，其块根富含淀粉、蛋白质、维生素、氨基酸及多种药用成分如胆碱、皂甙、粘多糖等，还含有Fe、Zn、Cu、Ca等多种矿物质，依据种和品种的不同，可作药用或食用，具有良好市场前景和产业开发潜势。病毒病严重影响淮山药的产量和品质，在淮山药生产上造成重大损失。文献表明，全球范围内，自然条件下侵染淮山药的病毒有杆状DNA病毒属的参暮杆状病毒(Dioscorea alata bacilliform virus,DaBV)、淮山药花叶病毒(Yam mosaic virus, YMV)、淮山药温和花叶病毒(Yam mild mosaicvirus, YMMV)、中国淮山药坏死花叶病毒(Chinese yam necrotic mosaic virus, CYNMV)、日本淮山花叶病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、香豆萎蔫病毒 2 (Broad bean wiltvirus-2, BBWV-2)o我国已发现DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山药，引发的症状包括花叶、斑驳、脉明、褪绿、生长迟缓和叶片扭曲等。不同淮山药病毒引起症状不同，也可以引起相似症状；其传播介体不一样，有不同的传播途径。为了保证淮山药生产的正常进行，首先要保证种薯不携带病毒，其次是在生产大田及时发现和鉴定病毒，以便制定有针对性的防治措施，包括控制传播介体来切断病毒病的传播。因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行检测。目前，用于植物RNA病毒病原检测的主要技术手段有 RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western blot 等，在病毒病原检疫检测方面应用最多的是ELISA和qRT-PCR。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用，以便用于快速检测淮山药温和花叶病毒。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，原核表达纯化淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。
[0005]NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因所编码。
[0006]上述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，取纯化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后,心脏采血,分离血清；抗血清经抗原亲和纯化获得该病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗体。
[0007]所得淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体在检测淮山药温和花叶病毒方面的应用。
[0008]基于上述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的ELISA检测方法。[0009]上述ELISA检测方法，包括以下步骤:
[0010](I)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病叶为阳性对照，未感染YMMV的健康叶为阴性对照，37°C孵育2h或4°C过夜；
[0011](2)用200 μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ；
[0012](3)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YMMV多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0013](4)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG结合物，100 μ I/孔，室温孵育Ih ；
[0014](5)用200 μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒(康为世纪公司)进行显色，室温避光孵育25- 30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50 μ 10.5Μ H2SO4终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值(Ρ/Ν)大于2.1为阳性；
[0015]PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl,0.05%Tween20,pH7.4 ;抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6);抗体稀释缓冲液为 1%BSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
[0016]基于上述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的Western blot检测方法。
[0017]上述的Western blot检测方法,包括以下步骤:
[0018](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白质提取试剂盒提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ；
[0019](2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE ；
[0020](3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心将膜放入双蒸水中浸泡2min，再浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2，转移1.5h，转移结束后，断开电源将膜取出；
[0021](4)免疫反应:用0.01M PBS洗膜，Imin ;加入封闭液,室温封闭I~2h ;弃封闭液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YMMV多克隆抗体(一抗)，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和1%834，用0.0现PBST分别洗膜，5minX4次；加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG结合物(二抗)，平稳摇动，室温孵育2h ；弃二抗，用0.01M PBST洗膜，5minX4次；采用ECL法进行检测；
[0022]转膜缓冲液为25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；
0.01MPBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封闭液为 5%脱脂奶粉或3%BSA。
[0023]基于上述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的IC-RT-PCR检测方法。
[0024]上述的IC-RT-PCR检测方法，包括以下步骤:
[0025](I)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YMMV多克隆抗体，每个1.5mL的离心管中加入100 μ I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0026](2)将淮山叶片与含2%PVP的0.02M PBS研磨缓冲液按质量体积比0.2% (w/v)放入研钵中，研磨成叶汁匀衆，吸入1.5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ；
[0027](3)将步骤(1)中包被好抗体的1.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 μ I步骤
(2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h，此时暴露的病毒颗粒特异性地附着于离心管内壁上(免疫捕捉);
[0028](4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液；
[0029](5)用SuperRT —步法RT-PCR试剂盒(康为世纪公司)进行RT-PCR反应检测 YMMV，病毒检测引物为 YMMV-F:5’ -GGCACACATGCAAATGAARGC-3’ 和 YMMV-R:5’ -CACCAGTAGAG TGAACATAG-3’，PCR 阶段设置退火温度为 55°C，35 个循环；
[0030](6) RT-PCR结束后，取5 μ I的PCR产物用质量体积浓度1.0% (w/v)琼脂糖凝胶进行电泳检测，预期片段大小为249bp。
[0031]抗体稀释缓冲液为1%BSA, 0.01M PBS pH7.2。
[0032]为建立淮山药温和花叶病毒的检测方法，发明人深入研究了 YMMV江西分离物(桂淮6号，采自江西省南昌市))的全长基因组序列，该病毒的全长基因组序列(见序列表SEQ.1D.N0.3)共有9536个核苷酸，5’非编码区有137个碱基，3’非编码区有144个碱基(不包括polyA的长度)，编码一个包含3084个氨基酸大的多聚蛋白，该多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶剪切成10个蛋白质，从5’端到3’端的顺序编码的蛋白分别为:P1 (320aa),HC-Pro (457aa)，P3 (348aa)，6Kl (51aa)，CI (643aa)，6K2 (52aa)，NIa VPg (191aa)，NIaPro (240aa), NIb (516aa)，CP (266aa)。基于YMMV基因组，发明人通过原核表达纯化淮山药温和花叶病毒的核包涵体蛋白/外壳蛋白(NIb/CP)蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达YMMV的NIb/CP蛋白和侵染淮山药的YMMV病毒的NIb/CP蛋白，并产生特异性免疫反应，其ELISA效价为1:64000，Western blot效价为1:10000。发明人更进一步，基于针对YMMV外壳蛋白的特异性抗体，结合针对该病毒YMMV的基因组的特异性引物建立了 IC-RT-PCR方法，能够高效、高灵敏和准确地从感染YMMV的淮山药植株中检测出YMMV ;同理建立的ELISA和Westernblot方法也可以特异性地从感染YMMV的淮山药植株中检测出YMMV。应用本发明提供的YMMV全基因组序列以及多克隆抗体，可为YMMV与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1 是 YMMV 的 5’/3’RACE 电泳图，图中:M为 DNA分子量标准(O，GeneRulerlkbDNALadder, Thermo Scientific 公司)，I 为 5’ RACE 产物，2 为 3’ RACE 产物。
[0034]图2是YMMV的分段PCR扩增电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkbDNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为 YMMV 片段 2，2 为 YMMV 片段 3，3 为 YMMV 片段4，4为YMMV片段5。
[0035]图3是YMMV的基因组结构示意图。
[0036]图4是YMMV的多聚蛋白与其他马铃薯Y病毒属病毒代表种的进化关系图。
[0037]图5是YMMV的NIb/CP蛋白与其他不同地区和不同淮山药品种中获得的YMMV分离物的外壳蛋白进化关系图。
[0038]图6是YMMV的外壳蛋白基因PCR扩增电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ~3 为 3 个重复的 YMMV的NIb/CP蛋白基因的PCR产物。
[0039]图7是原核表达载体pET30a-YMMV_Nib/CP的酶切验证电泳图，图中:M为DNA分子量标准(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ~3 为 3 个重复的连接上YMMV的NIb/CP蛋白基因的pET30a-YMMV-Nib/CP质粒的酶切产物。
[0040]图8是验证YMMV的NIb/CP基因的重组蛋白表达形式的SDS-PAGE图，图中:M为蛋白分子量标准(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 为未诱导样品超声波破碎细胞后离心收集的沉淀，2为诱导样品超声波破碎细胞后离心收集的沉淀，3为未诱导样品超声波破碎细胞后离心收集的上清，4为诱导样品超声波破碎细胞后离心收集的上清。
[0041]图9是亲和纯化的YMMV的NIb/CP基因的重组蛋白的SDS-PAGE图，图中:M为蛋白分子量标准(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I ~4为镍柱纯化的带有6XHis标签的YMMV的NIb/CP蛋白的四次洗脱产物。
[0042]图10是YMMV多克隆抗体效价测定图，图中:1为免疫前血清，2为纯化抗体，3为检测因子。
[0043]图11是ACP-ELISA图，图中1_3是原核表达纯化的YMMV_NIb/CP蛋白样品，4-6是感染YMMV的淮山药总蛋白样品，7-9是未感染YMMV的健康淮山药样品，10-12是只加入蛋白裂解液的空白对照。
[0044]图12 是 Western blot 图，图中:M 为蛋白分子量标准(PageRuler PrestainedProtein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I ~6 为 YMMV 阴性样品，7 ~9 为 YMMV 阳性样品。
[0045]图13 是 IC-RT-PCR 图，图中:M 为 DNA 分子量标准(O，GeneRulerlOObp Plus DNALadder, Thermo Scientific公司)，I为空白对照,2为阴性对照(健康样品),3为阳性对照(YMMV感病样品)，4-13为疑似YMMV病毒病的待测样品(其中11的样品经ELISA检测为YMMV阳性)。
【具体实施方式】
[0046]以下所用材料包括:PrinK、STARKl HS高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。柱式 DNA胶回收试剂盒(Ε.Z.N.A* Gel Extraction Kit)购自 OMEGA 公司。RNAplant
plus植物总RNA提取试剂、质粒DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，5’ /3’ RACE试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自Roche公司。TMB底物显色试剂盒、蛋白质提取试剂盒购自康为世纪公司。琼脂糖为BIOWEST? Regular Agarose G-1O0胰蛋白胨、酵母提取物、尿素、BSA、PMSF、TEMED、DTT购自Sigma公司。限制性内切酶，RNase Inhibitor、IPTG、RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒、dNTP、GeneRulerIkb DNA ladder、GeneRulerIkbplus DNA ladder、PageRuler Prestained Protein LadderΛPageRuIer Unstained ProteinLadder购自Thermo Scientific公司。氨节青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、RNaseA、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、溶菌酶等购自生工生物工程(上海)有限公司。其它试剂均为分析纯。
[0047]一、YMMV的全长基因组序列的克隆
[0048]1.1YMMV的3’端序列克隆
[0049]根据高通量测序获得的YMMV的序列，设计一条正向引物(YMMV-8242F:5’-GAGGAAGAGCGGATTGTTGC-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.4)，利用 5’/3’RACE 试剂盒(Roche 公司)合成 YMMV 的 3’端的 cDNA。在 20 μ I 的体系中加入 7 μ I (IdH2O(RNase-Free)JyUA5X cDNA synthesis buffer, I μ I NlT (10 μ Μ) (NIT:5’-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(T) 17V-3’，见序列表SEQ .1D.N0.5，试剂盒提供)，5 μ I受YMMV侵染的桂淮6号总RNA (约I μ g)和2 μ I dNTP (IOmM), I μ I Transcriptor Reverse Transcriptase,混匀，55。。反应 60min,然后在85°C反应5min使逆转录酶失活。以反转录获得的第一链cDNA为模板，YMMV-8242F和 NI (N1:5’ -GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.6，试剂盒提供)为引物进行PCR，扩增出一条特异性预期大小为1290bp的带(图1，泳道2)。利用pCR2.1PCR产物克隆试剂盒直接克隆3’RACE PCR产物。连接反应体系为:1 μ I新鲜PCR产物，2 μ 15X连接酶Buffer，I μ I pCR2.lvector,5y I ddH20和I μ I T4DNA连接酶。连接反应液在室温放置，反应30min后用于转化Ε.coli DH5 α的感受态细胞，涂布在加有100 μ g/L的氨苄青霉素、10 μ L IPTG (24mg/mL)和 20μ L X-Gal (20mg/mL)的 LA 培养基上，37°C培养 18 小时。挑取白色菌落提取质粒，并用EcoR I酶切鉴定，挑选3个鉴定正确的阳性克隆进行序列测定，将重组质粒命名为pCR-YMMV-3。
[0050]1.2YMMV 的 5’ 端 cDNA 的克隆
[0051]根据高通量测序获得的YMMV的序列，设计两条反向引物(YMMV-996R:5，-GCGAACTATCATATGTGAACCTGT-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.7) ;YMMV-928R:5’ -CGCTACAACCTCGTGTGATT-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.8)，利用 5’ /3’ RACE 试剂盒(Roche)合成 YMMV 的 5’端的 cDNA。在 20 μ I 的体系中加入 7μ I ddH20 (RNase-Free), 4 μ I 的 cDNAsynthesis buffer, 2 μ IdNTP (IOmM), I μ I YMMV-996R(10 μ Μ)，5 μ I 受 YMMV 侵染的桂淮 6号总 RNA (约 I μ g)和 I μ I Transcriptor Reverse Transcriptase 混匀，55°C 反应 60 分钟，然后在85°C反应5分钟使转录酶失活。反应结束后，用Roche的高纯PCR产物纯化试剂盒纯化第一链cDNA产物(根据试剂盒说明书进行操作)。取19 μ I纯化的第一链cDNA产物，加入2.5 μ IlOXReaction Buffer, 2mM dATP，轻柔混匀并短暂离心，于94°C反应3分钟，立即置于冰上。短暂离心，加入I μ I的末端转移酶(Terminal Transferase),轻柔混匀并置于37V反应20分钟。然后在70°C反应10分钟以使末端转移酶失活。取5 μ I已经加了 A 尾巴的 cDNA 作为模板，加入 I μ I Oligo dT-anchor primer (NIT), I μ 1YMMV-996R,I μ IdNTP (IOmM), 5 μ IlOXReaction Buffer, 0.5 μ I Taq DNA Polymerase (5υ/μ1)和36.5 μ I ddH20,进行第一次PCR，再以第一次PCR产物稀释100倍为模板，以YMMV-928R和NI为引物进行第二次PCR，扩增出一条特异性预期大小为928bp的带(图1，泳道I)。利用pCR2.1PCR产物克隆试剂盒直接克隆5’ RACE PCR产物。连接反应体系为:I μ I新鲜PCR产物，2 4 15父连接酶81^€61'，14 1 pCR2.lvector, 5 μ I ddH20 和 I μ I T4DNA 连接酶。连接反应液在室温放置，反应30分钟后用于转化E.coli DH5a的感受态细胞，涂布在加有100 μ g/L 的氨苄青霉素、10 μ L IPTG (24mg/mL)和 20 μ L X-Gal (20mg/mL)的 LA 培养基上，37°C培养18小时。挑取白色菌落提取质粒，并用EcoR I酶切鉴定，挑选3个鉴定正确的阳性克隆进行序列测定，将重组质粒命名为pCR-YMMV-5。
[0052]1.3克隆测序验证高通量测序结果
[0053]根据高通量测序获得的序列和3’ RACE以及5’ RACE的测序结果设计四对引物:
[0054]YMMV-839F:5’ -CGCAAGTTATAGCACCAATCCA-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.9，
[0055]YMMV-3172R:5’ -CACCTCCAACCGTTCTCAATG-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.10 ；
[0056]YMMV-3092F:5，-GGATGAGGACTGGTGTTAGGAT-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.11 ；[0057]YMMV-5038R:5’ -TGACTACGGAATGTGGTATTGC-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.12 ；
[0058]YMMV-4787F:5，-AGGCGGCGTTCTTGAGTT-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.13 ；
[0059]YMMV-7000R:5，-CTTGTTCCAGATCCATGAGTAGTT-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.14 ；
[0060]YMMV-6942F:5’ -AAGCAGCACACCATCAGAAC-3，，见序列表 SEQ.1D.N0.15 ；
[0061]YMMV-8458R:5’ -TCCGAAGAGCGTATTCAGAGAT-3’，见序列表 SEQ.1D.N0.16。
[0062]预期片段大小分别为2334bp、1947bp、2214bp 和 1517bp。以 3’ RACE 的 cDNA为模板，分别用这四对引物进行PCR扩增获得预期大小的目的片段(图2)，分别克隆至pCR2.lvector并挑取3个克隆进行测序。
[0063]通过3’ RACE、5’ RACE和分段克隆测序最终拼接获得包含9536nt的YMMV的全长基因组序列(不包括PolyA的长度)，5’非编码区有137个碱基，3’非编码区有144个碱基，经结构域预测和同源序列比对分析发现，其编码一个包含3084个氨基酸大的多聚蛋白，该多聚蛋白可被病毒自身编码的蛋白酶剪切成10个蛋白质(图3)，从5’端到3’端的顺序编码的蛋白分别为:Pl (320aa), HC-Pro (457aa)，P3 (348aa)，6Kl (51aa)，CI (643aa)，6K2(52aa), NIa VPg (191aa), NIa Pro (240aa), NIb (516aa), CP (266aa)。
[0064]分别选取多聚蛋白和外壳蛋白的氨基酸序列用MEGA4.0软件的邻接法构建系统进化树，均显示该病毒与YMMV巴西分离物在进化上的关系最近(图4和图5)。
[0065]二、原核表达纯化外壳蛋白并制备多克隆抗体
[0066]2.1引物设计与合成
[0067]根据3’ RACE获得的YMMV的3’端部分序列(GenBank JF357963)设计并由生工生物工程(上海)有限公司合成一对特异性引物YMMVNIbCP-F: 5’ -CCCGAATTCATGTCGCACAAAGCAGTTAAG-3’(见序列表 SEQ.1D.N0.17)和 YMMVNIbCP-R:5，-CCCGTCGACCTAGATATTGCGCACTCCAAG-3’(见序列表SEQ.1D.N0.18)。上游引物YMMVNIbCP-F位于NIb基因编码区，并在其中引入一个EcoRI酶切位点(下划线所示)。下游引物YMMVNIbCP-R与CP基因编码区3’端序列互补，并在终止密码子的下游加入一个Sal I酶切位点(下划线所示)。预期PCR产物大小为1191bp，包括部分NIb和完整CP基因以及酶切位点序列。
[0068]2.2NIb/CP基因的克隆与序列测定
[0069]以感染YMMV的桂淮6号病叶为材料，用RNAplant plus植物总RNA提取试剂按照说明书的方法提取病叶的总RNA。取I μ g总RNA为模板，采用RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒，根据说明书提供的标准程序以OligleDT (18)为引物进行反转录获得cDNA。然后取I μ L稀释20倍的反转录产物作为模板，加入10 μ M的YMMVNIbCP-F和YMMVNIbCP-R引物各 2μ L，10μ L5XPCR buffer,0.5 μ LlOmM dNTP,0.25 μ L PrimcSTARK HS 高保真 DNA聚合酶，36.25 μ L ddH20，进行PCR扩增。反应条件为:98°C预变性3min，98°C变性IOsec,55°C退火15sec，72°C延伸lmin，34个循环，最后在进行72°C反应5min。PCR产物采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳(图6)，切胶回收纯化目的DNA片段后，与用Sma I切开pUC19平端载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取转化子用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，用EcoR I/Sal I I双酶切鉴定重组质粒，选择鉴定正确的克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序，核苷酸和氨基酸序列采用Vector NTI Advance?10软件进行比对分析(见序列表SEQ.1D.N0.1 和 SEQ.1D.N0.2)。
[0070]2.3原核表达载体的构建
[0071]将纯化的重组质粒经EcoR I和Sal I双酶切后，回收目的基因片段与用相同酶切的pET30a连接。取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒DNA，用EcoRI和Sal I双酶切鉴定筛选阳性克隆(图7)，获得鉴定正确的原核表达载体pET30a-YMMV-NIbCP。再将该表达载体和对照空载体pET30a分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)PLysS感受态细胞，用卡那霉素抗性筛选获得携带目标表达载体pET30a-YMMV-NIbCP和空载体pET30a的表达菌株。
[0072]2.4诱导表达及表达条件优化
[0073]挑取新鲜培养的含pET30a-YMMV_NIbCP表达载体的BL21 (DE3) pLysS单菌落，接种于I mL含50 μ g/L卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，同时以含空质粒pET30a的BL21(DE3)pLysS菌作对照。按1:100的比例将过夜培养的菌液加入到5mL新鲜的含25 μ g/L卡那霉素的LB培养基中，其中含空质粒pET30a的BL21 (DE3)pLysS菌I小瓶，含pET30a-YMMV-NIbCP表达载体的BL21 (DE3) pLysS菌6小瓶。37°C继续振摇培养3h左右至OD600=0.4~0.6，然后向含pET30a-YMMV-NIbCP表达载体的BL21 (DE3) pLysS菌液中加入化学诱导剂 IPTG 至终浓度分别为 0mM、0.lmM、0.4mM、0.8mM、l.2mM、2.0mM，继续 28°C，200rpm振荡培养。诱导6h后从摇床取出置于冰上IOmin使菌体停止生长,然后1000Orpm离心Imin收集菌体，用PBS (pH7.4)清洗一次，再悬浮于200 μ IPBS (ρΗ7.4)，取30 μ I悬浮液加入10 μ 14 X蛋白上样缓冲液，煮沸10min，12000rpm离心2min,取10 μ I上清进行SDS-PAGE检测。根据SDS-PAGE结果选择梯度诱导目的蛋白表达量最好的IPTG浓度进行大量诱导表达。
[0074]2.5表达产物的可溶性分析
[0075]取5mL诱导表达的菌液，1000Orpm离心2min收集菌体,用PBS清洗一次,再悬浮于200 μ I PBS (ρΗ7.4)，用SONICS Uibra Cell?超声波破碎细胞，Amp (与功率对应)参数设置为38%，每次lOSec，间隔lOSec，直至菌液变澄清。4°C，12000rpm离心30min，取上清液于新的离心管。沉淀用200μ I含8M脲的PBS充分溶解，12000rpm离心lOmin。分别取10 μ I上清和沉淀进行SDS-PAGE检测(图8)。
[0076]2.6YMMV-NIb-CP重组蛋白的纯化
[0077]该表达载体含有6XHis标签,所以根据QIAexpressionist?手册采用亲合层析方法进行蛋白纯化，将IOOmL诱导表达的菌液用400mL Beckman离心管收集,在Beckman高速离心机上1000Orpm离心5min收集菌体,置于_20°C放置30min。然后于冰上融化30min,此时菌体在自身表达的溶菌酶的作用下开始发生裂解。用Lysis Buffer (IOOmM NaH2P04,IOmM Tris.Cl,8M urea, pH8.0)重悬菌液,超声波破碎细胞,直至菌液变澄清。12000rpm离心20min，取上清液与用Lysis Buffer平衡的N1-NTA树脂充分混匀，装柱，然后先用WashBufferC IOOmM NaH2P04, IOmM Tris ?Cl, 8M urea,ρΗ6.3)洗脱杂蛋白，再用 Elution Buffer(IOOmM NaH2PCM, IOmM Tris.C1，8M urea, pH4.5)连续洗脱目的蛋白，分管收集洗脱液，每管收集lmL，分别取10 μ I蛋白洗脱液进行SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化效果(图9)。
[0078]2.7多克隆抗体制备及效价测定
[0079]取纯化后的重组蛋白2mL，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔(免疫前采集正常血清作为阴性对照)，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7d后,心脏米血，分离血清；抗血清经抗原亲和纯化获得该病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗体。
[0080]以原核表达的YMMV NIb/CP为抗原，经ELISA法测定，纯化后的多克隆抗体效价为I:64000 (图 10)。
[0081]三、基于YMMV外壳蛋白多克隆抗体的检测方法
[0082]3.1间接抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法检测病毒
[0083]ACP-ELISA方法的操作步骤:
[0084](I)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病叶为阳性对照，未感染YMMV的健康叶为阴性对照，3 7°C孵育2h或4°C过夜；
[0085](2)用200 μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ；
[0086](3)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YMMV多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0087](4)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG结合物(Abmart)，100 μ I/孔，室温孵育Ih ；
[0088](5)用200 μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒(康为世纪公司)进行显色(图11)，室温避光孵育25-3011^11，反应产物呈蓝色，每孔再加入5(^10.51 H2SO4终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值(Ρ/Ν)大于
2.1为阳性。
[0089]其中，PBST含 3.2mM Na2HPO4, 0.5mM KH2PO4, 1.3mM KCl，135mM NaCl,
0.05%Tween20, pH7.4 ;抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ρΗ9.6);抗体稀释缓冲液为 1%BSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
[0090]3.2蛋白质免疫印记(Western blot)方法检测病毒
[0091]Western blot方法的操作步骤:
[0092](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白质提取试剂盒(康为世纪)提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ；
[0093](2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE ；
[0094](3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心将膜放入双蒸水中浸泡2min，再浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2，转移1.5h，转移结束后，断开电源将膜取出；[0095](4)免疫反应:用 0.01M PBS (3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mMNaCl，pH7.4)洗膜，lmin ;加入封闭液(5%脱脂奶粉或3%BSA)，室温封闭I~2h ;弃封闭液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YMMV多克隆抗体(一抗)，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和1%834，用0.0现PBST分别洗膜，5minX4次；加入用用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG结合物(二抗)，平稳摇动，室温孵育2h ;弃二抗，用 0.01M PBST 洗膜，5minX4 次；采用 ECL 法(PierceK ECL Western BlottingSubstrate, Thermo Scientific)进行检测(图 12)；
[0096]其中，转膜缓冲液为25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；
0.01M PBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封闭液为 5%脱脂奶粉或3%BSA。
[0097]3.3用免疫捕获反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)方法检测病毒
[0098]IC-RT-PCR方法的操作步骤:
[0099](1)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YMMV多克隆抗体，每个1.5mL的离心管中加入100 μ I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；
[0100](2)将淮山叶片与研磨缓冲液(0.02M PBS，2%PVP)按0.2% (w/v)放入研钵中，研磨成叶汁匀衆，吸入1.5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ；
[0101](3)将步骤(1)中包被好抗体的1.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 μ I步骤
(2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h，此时暴露的病毒颗粒特异性地附着于离心管内壁上(免疫捕捉);
[0102](4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液；
[0103](5)用SuperRT —步法RT-PCR试剂盒(康为世纪公司)按照说明书进行RT-PCR检测反应，YMMV 检测引物为 YMMV-F:5’-GGCACACATGCAAATGAARGC-3’(见序列表 SEQ.1D.N0.19)和 YMMV-R:5’-CACCAGTAGAGTGAACATAG-3’(见序列表 SEQ.1D.N0.20), PCR 阶段设置退火温度为55°C，35个循环；
[0104](6)RT_PCR结束后，取5μ I的PCR产物用L 0% (w/v)琼脂糖凝胶进行电泳检测，预期片段大小为249bp (图13)；
[0105]其中，抗体稀释缓冲液为1%BSA，0.01M PBS pH7.2。
【权利要求】
1.一种淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:原核表达纯化淮山药温和花叶病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:所述NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因所编码。
3.根据权利要求2所述的淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于:取纯化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；抗血清经抗原亲和纯化获得该病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗体。
4.权利要求1至3所得淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体在检测淮山药温和花叶病毒方面的应用。
5.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的ELISA检测方法。
6.根据权利要求5所述的ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病叶为阳性对照，未感染YMMV的健康叶为阴性对照，37°C孵育2h或4°C过夜； (2)用200μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ； (3)用200μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的YMMV多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ； (4)用200μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，100 μ I/孔，室温孵育Ih ； (5)用200μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒进行显色，室温避光孵育.25-3011^11，反应产物呈蓝色，每孔再加入5(^10.5Μ H2SOjS止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性；
所述 PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl，0.05%Tween20,pH7.4 ;所述抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6 ;所述抗体稀释缓冲液为P/oBSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
7.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的Westernblot检测方法。
8.根据权利要求7所述的Westernblot检测方法,其特征在于包括以下步骤: (1)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白质提取试剂盒提取淮山药总蛋白样品,用Bradford法进行蛋白质定量，调整蛋白质浓度为2mg/mL ； (2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE； (3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心将膜放入双蒸水中浸泡.2min，再浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2，转移1.5h，转移结束后，断开电源将膜取出；(4)免疫反应：用0.01M PBS洗膜，Imin ;加入封闭液，室温封闭I~2h ;弃封闭液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YMMV多克隆抗体，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代ー抗，其余步骤与实验组相同；弃ー抗和1%BSA，用0.01M PBST分别洗膜，5minX4次；加入用抗体稀释缓冲液稀释.3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，平稳摇动，室温孵育2h ;弃二抗，用0.OlM PBST洗膜，5minX4次；采用ECL法进行检测；
所述转膜缓冲液为 25mM Tris, 192mM glycine, 0. 01%SDS, 20%methanol, pH8. 3 ;所述0.01M PBS 含有 3. 2mM Na2HPO4,0. 5mM KH2PO4,1. 3mM KCl，135mM NaCl，pH7. 4 ;所述封闭液为5%脱脂奶粉或3%BSA。
9.基于权利要求1所述多克隆抗体的淮山药温和花叶病毒的IC-RT-PCR检测方法。
10.根据权利要求9所述的IC-RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1)用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释YMMV多克隆抗体，每个15mL的离心管中加入100 u I稀释好的抗体，37°C孵育Ih或室温孵育3h ； (2)将淮山叶片与含2%PVP的0.02M PBS研磨缓冲液按质量体积比0. 2%放入研钵中，研磨成叶汁匀衆，吸入I. 5mL离心管中，9000rpm离心IOmin ； (3)将步骤（I)中包被好抗体的I.5mL离心管用PBST洗两次，加入200 U I步骤（2)准备好的叶汁上清液，37°C水浴3h ； (4)移去叶汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗毕作短暂离心去除管底余液； (5)用SuperRT—步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应，检测引物为YMMV-F ：5’ -GGCACACATGCAAATGAARGC-3’ 和 YMMV-R :5’ -CACCAGTAGAGTGAACATAG-3’，PCR 阶段设置退火温度为55°C，35个循环； (6)RT-PCR结束后，取5 u I的PCR产物用质量体积浓度I. 0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。所述抗体稀释缓冲液为1%BSA, 0.01M PBS pH7.2。
【文档编号】G01N33/543GK103539856SQ201310541297
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】陈保善, 邹承武, 蒙姣荣, 张蕾, 卢晓静 申请人:广西大学