纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒。所述试剂盒包含包括R1试剂，R2试剂和脂联素抗原校准品溶液，其中R1试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；R2试剂包含包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、缓冲液；所述胶乳颗粒是由苯乙烯和丙烯酸组成的共聚物；脂联素抗原校准品溶液包含脂联素和稳定剂。R2试剂中胶乳颗粒的表面存在羧基基团，粒径范围为80～100nm。本发明试剂盒操作简单、测定快速、准确、灵敏度高、特异性强，检测成本低。
【专利说明】纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种采用纳米胶乳增强免疫比浊法测定人体血清中脂联素的试剂盒。
【背景技术】
[0002]脂联素(Adiponectin，APN)亦称Acrp30、GBP28 或 AdipoQ，是一种由脂肪细胞合成和分泌细胞因子，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为3.0?30.0mg/L，约占血浆蛋白的0.01%。人类脂联素含244个氨基酸，包括3个区域:氨基末端信号序列、胶原结构域和羧基末端的球形结构域。脂联素以三聚体(65kb)、六聚体(150kb)和高分子量聚合体(18-36个多体，>280kb)三种亚型存在于血液中。临床研究显示，脂联素与肥胖、II型糖尿病、冠心病、胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和血管损伤后抗内膜增生的特性。
[0003]脂联素的测定方法有多种，例如放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)(人脂联素ELISA试剂盒，CN102517256A)。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，操作时间长、自动化程度低。放射免疫法(RIA)灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。
[0004]纳米胶乳增强免疫比池法(Latex-enhancedturbidimetric immunoassay)是一种体液蛋白均相透射免疫比浊检测方法，原理是在纳米级高分子胶乳微球的表面交联多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的透光性能；反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。纳米胶乳增强免疫比浊法的优势具体体现在:①省时省力:在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，利用全自动生化分析仪直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，省却了 ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤。②稳定准确:操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测人类血清中脂联素的含量。③应用广泛:免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到人类血清中脂联素的下限值，可完全满足临床检测要求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种纳米胶乳增强免疫比浊法检测脂联素的试剂盒。
[0006]纳米胶乳增强免疫比浊法的原理是在纳米级高分子胶乳微球的表面交联多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的透光性能；反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。具有操作简单、快速准确、灵敏度高、特异性强的特点，而且检测成本低，可用于门诊体检检测，适用于全自动或半自动生化分析仪。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案:一种纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒，所述胶乳颗粒的表面存在羧基基团，粒径为80~IOOnm,为苯乙烯和丙烯酸的共聚物；所述抗人脂联素多克隆抗体与胶乳颗粒是通过化学键联方式结合。
[0008]进一步地，本发明的试剂盒包括Rl试剂，R2试剂和脂联素抗原校准品溶液，其中: 所述Rl试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；
所述R2试剂包含包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、缓冲液；
所述脂联素抗原校准品溶液包含脂联素和稳定剂。
[0009]所述胶乳颗粒是含有至少苯乙烯作为单体的共聚物，并且特别优选为苯乙烯和丙烯酸的共聚物，表面含有丰富的羧基基团。乳胶颗粒胶乳颗粒的粒径范围为80~lOOnm。
[0010]所述胶乳颗粒的制备方法是:将苯乙烯、丙烯酸、表面活性剂分散或溶于去离子水中，在氮气环境下缓慢添加引发剂，于约80°c搅拌反应2~4h，冷却，得到胶乳颗粒。
[0011]所述苯乙烯与丙烯酸的质量比优选为5:1。所述丙烯酸单体可以替换为等摩尔量的甲基丙烯酸等其他丙烯酸类单体。
[0012]所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠等。
[0013]所述引发剂选自过氧化物、过氧酯或偶氮化合物，例如过硫酸钾、过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化叔戊酸叔丁基酯、偶氮二异丁腈等。
[0014]所得的乳胶颗粒为纳米级乳胶颗粒，具有如下特征:
平均粒径(Mean Diameter):80 ~IOOnm
聚合物(Polymer):p (S/13%AA)
比重(Density):1.03
表面基团(Surface Group):-COOH
表面电荷(Surface Charge):40 ~510 ueq/g
基团占表面面积(Parking Area):100 ~115 sqA/g
浓度(％ Solid):5 ~10%
所述电解质选自无机盐类，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合，优选氯化钠。浓度在0.1~5%之间，优选I~4%，更优选2~3%，例如2.5%。
[0015]所述稳定剂选自酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、牛血清白蛋白或其组合，优选酪蛋白或牛血清白蛋白。浓度在0.1~5%之间，优选I~4%，更优选2~3%,例如 2.5%ο
[0016]所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚或其组合，优选吐温80。浓度在0.1~10%之间，优选2~8%，更优选2~3%，例如2.5%。
[0017]所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、PiOClin系列，优选叠氮钠。浓度在0.1~1.0%之间，优选0.2~0.8%，更优选0.4~0.6%，例如0.5%。
[0018]所述缓冲液选自2-(N_吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，优选MES缓冲液。浓度在10~500mmol/L之间，优选50~300mmol/L,更优选200~250mmol/L。缓冲液的pH为5~9，优选pH6~8，例如pH 7~
7.5。[0019]所述脂联素抗原校准品是从美国BIO-RAD公司采购的，纯度> 95%。
[0020]所述脂联素校准品的浓度可以是高浓度单点校准品，在使用时用牛血清白蛋白稀释成多个不同浓度的校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的校准品。校准品包含浓度为O?200mg/L的脂联素。
[0021]所述抗人脂联素多克隆抗体是通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒表面。所述方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行。所述化学交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾或其组合。交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，例如MES、M0PS0、MOPS、HEPES, PBS 缓冲液，pH 在 6.0 ?8.0。
[0022]所述包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒在脂联素抗原校准品溶液中的浓度范围为 0.01 ?10%,例如 0.05%, 0.1%，0.5%, 1%，3%, 5%, 8% 等。
[0023]通过在胶乳壳聚合过程中引入丙烯酸类单体，使胶乳颗粒表面形成一层疏松的表面层，能够有效降低血浆或血清中的成分对凝集反应的干扰影响，提高分析的准确性。胶乳壳中的丙烯酸，其羧酸基团分布在胶乳颗粒表面，带有一定的负电荷，使胶乳颗粒成为一种亲水性胶乳，能够防止胶乳颗粒的絮凝，从而可以提高胶乳颗粒的稳定性。所述抗体通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒表面，胶乳颗粒与抗体Fe片段之间通过化学键结合，提高抗体的结合率和稳定性，有效地保护抗体与抗原结合的活性区域，提高检测灵敏度。
[0024]本发明的纳米胶乳增强免疫比浊法检测脂联素的试剂盒具有稳定准确、省时省力的优点，与全自动生化分析仪相结合，实现全自动快速测定样品的临床检测要求，与传统免疫比浊试剂相比灵敏度增加10倍以上，可用于临床检测。
【专利附图】
【附图说明】
图1是本发明脂联素标准品的标准曲线。
图2是本发明脂联素的测定浓度值与理论浓度的比对图。
图3是本发明试剂盒与对照试剂盒测定的脂联素浓度的比对图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，均为按照本领域内常规技术或条件，或按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为市售产品。如无特别说明，本发明的浓度百分比均为质量百分比。
[0026]材料及来源:
脂联素:购自美国BIO-RAD公司；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂:购自Sigma公司；氮气瓶:佛山奥格公司；恒温加热磁力搅拌器河南巩义科瑞仪器；玻璃仪器烘干器:C型，河南巩义豫华仪器；氢氧化钠，碳酸钠，过硫酸钠，苯乙烯，二乙烯基苯，十二烷基磺酸钠，己二胺，乙二胺，亚硫酸钠，过硫酸钾，丙烯酸等试剂购自美国Sigma公司。
[0027]实施例1抗人脂联素多克隆抗体的制备
采用购自美国BIO-RAD公司的脂联素作为抗原，皮下多点注射法免疫，制备抗人脂联素多克隆抗体。
[0028]将100 μ g脂联素以等量弗氏完全佐剂乳化抗原，背部皮下多点注射2.2?2.5kg的新西兰白兔，其后每隔两周以弗氏不完全佐剂乳化抗原，同法重复注射进行加强免疫3次，共计免疫4次。然后从静脉抽取IOOml兔子血液，离心获得血清。取IOml兔血清通过免疫亲和层析柱，用 1000ml TBS (20mM Tris, pH 7.4，500mM NaCl, 0.05% Tween-20)缓冲液反复冲洗层析柱，弃去流出液，冲洗完毕后，用IOml IOOmM的glycine/HCl (pH 2.5)缓冲液洗脱结合的抗体，收集于透析袋中，并放置于1000ml TBS(20mM Tris，pH 7.4，500mMNaCl，0.05% Tween-20)缓冲液中，冰箱中4°C透析过夜，获得抗人脂联素IgG多克隆抗体。
[0029]实施例2:包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒的制备
将10.0g苯乙烯，2g丙烯酸，0.1g十二烷基苯磺酸钠作为表面活性剂，分散于或溶于IOOml去离子水中，通入氮气，缓慢加入0.1g过硫酸钾作为引发剂，加热至80°C，搅拌反应约3h，冷却，得到胶乳颗粒，测定平均粒径范围为90nm。
[0030]抗人脂联素多克隆抗体Fe片断是通过化学键联的方法偶联于胶乳颗粒表面，具体步骤如下:
I) IOOmg含羧基的胶乳颗粒在5ml MES缓冲液中(50mM，pH 6.0)或PBS缓冲液中(50mM, pH 7.2)，加入表面活性剂十二烷基磺酸钠(最终浓度0.01%)，得到胶乳颗粒溶液。
[0031]2)将抗人脂联素多克隆抗体溶解于5ml MES缓冲液中(50mM，pH 6.0)或PBS缓冲液中(50mM，pH 7.2)，最终浓度达到I?10 μ mol/ml，得到抗人脂联素多克隆抗体溶液。
[0032]3)将胶乳颗粒溶液和抗人脂联素多克隆抗体溶液充分混合，然后加入IOOmg1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于混合液中，室温下反应2?4h，获得成功包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒。
[0033]实施例3:试剂盒的制备
Rl试剂:由下述重量百分比的组分制成:3%氯化钠，2.5%的甘露醇，5%的吐温80，0.5%的叠氮钠，PH7.4，250mmol/L的MES缓冲液。
[0034]R2试剂:由下述重量百分比的组分制成:4mg/mL的包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒，3%氯化钠，2.5%的甘露醇，5%的吐温80，0.5%的叠氮钠，pH7.4，250mmol/L的MES缓冲液。
[0035]校准品的制备:从美国BIO-RAD公司购买纯化天然脂联素做为母液，使用牛血清白蛋白梯度稀释母液，制备校准品:S5:50mg/L, S4:25mg/L, S3: I Omg/L, S2:5mg/L, SI:lmg/L, SO:纯净水。牛血清白蛋白浓度100?1000mg/L。
[0036]实施例4:标准曲线的制定
试剂盒测定使用日立7100全自动生化分析仪检测主波长:600nm，副波长:750nm。
[0037]试剂用量:样本3 μ I ;R1试剂200 μ I ；R2试剂50 μ I。
[0038]测定方法(两点终点法):200 μ I Rl试剂加入3 μ I样本，于37°C反应3分钟，然后加入50 μ I R2试剂即开始读点测得吸光度A1, 7分钟之后再次读点测得吸光度A2,计算吸光度差值Λ A= A2- A10
[0039]制作标准曲线:采用本发明的标准品，用生理盐水配制6个不同浓度的标准品溶液，浓度分别为 100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.25 mg/L 和 3.125 mg/L,按照上述步骤测得本发明脂联素标准品的标准曲线。如图1所示。图1中曲线上的每个点代表一个含量的标准品，其中X轴表示脂联素的浓度，y轴表示吸光度的差值。标准曲线方程为:y=0.004x-0.0016，相关系数 r=0.9997。
[0040]实施例5、线性范围的确定
将接近线性范围上限的脂联素高浓度样本100 mg/L，用生理盐水按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀释，共配制成7个不同浓度的标准品溶液，另以不含脂联素的生理盐水作为空白溶液。用实施例4所述方法检测各浓度，将测定浓度值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为:y= 1.0109x-0.1865，相关系数r= 0.9956，表明本发明试剂盒在O~100mg/L线性范围内相关性较好。如图2所示。
[0041]实施例6:准确度测定
分别使用本发明的试剂盒、对照试剂盒(日本三菱化学美迪恩斯株式会社)采用日立7100全自动生化分析仪对20例人血清(深圳市人民医院住院部检验科)进行测定，对测定值进行相关性分析。测试结果如下表1所示。计算回归方程为:y= 1.0062X-0.0166，相关系数r= 0.9999，如图3所示。结果显示本发明的试剂盒和对照试剂盒的相关性很高。
[0042]表1:
【权利要求】
1.一种纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，包括Rl试剂，R2试剂和脂联素抗原校准品溶液，其中: 所述Rl试剂包含电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液； 所述R2试剂包含包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性齐U、防腐剂、缓冲液；所述胶乳颗粒是由苯乙烯和丙烯酸聚合而成的共聚物，表面存在羧基基团；平均粒径范围为80?IOOnm ； 所述脂联素抗原校准品溶液包含脂联素和稳定剂。
2.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述苯乙烯与丙烯酸的质量比为5:1，所述抗人脂联素多克隆抗体是通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒表面。
3.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合，浓度为0.1?5%。
4.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒在脂联素抗原校准品溶液中的浓度为0.01?10%。
5.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述稳定剂选自酪蛋白、甘露醇、壳聚糖、乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白或其组合，浓度为0.1?5% ο
6.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚或其组合，浓度为0.1?10%。
7.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述防腐剂选自叠氮钠、苯酹、对轻基苯甲酸、对轻基苯甲酸乙酯、Proclin系列,浓度为0.1?1%。
8.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述缓冲液选自MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液，浓度为10?500mmol/L, pH 5 ?9。
9.如权利要求1所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述表面活性剂为Tween-80，所述缓冲液为MES缓冲液。
10.如权利要求2所述的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒，其中所述方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行；所述化学交联剂选自EDC、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾或其组合；所述交联缓冲液选自MES、MOPSO, MOPS、HEPES 和 PBS 缓冲液，pH 6.0 ?8.0。
【文档编号】G01N33/68GK103777023SQ201310686797
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】侯志波 申请人:深圳市安之酶生物技术有限公司