一种丙酮酸脱氢酶复合物酶活力检测方法和试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种丙酮酸脱氢酶复合物(PDH?complex，PDHC)酶活力分析和检测的方法，本发明还提供了测定PDHC酶活力的试剂，上述方法和试剂可用于分析和测定样本中PDHC的酶活力，从而可以用于临床疾病的分析、检验和诊断。本发明的原理是：PDHC能够有序的将丙酮酸催化脱羧生成产物CO2、乙酰辅酶A和NADH。因此检测最终产物NADH的生成即可检测PDHC的酶活力。NADH在特定的激发波长下可以发射荧光，且其反应的速率与产物的荧光强度成正比，通过检测荧光值的变化就可以计算样本中的PDHC酶活力。本发明提供的PDHC酶活力检测的方法可以快速、特异和灵敏的测定样本中的PDHC酶活力。基于该方法，本发明提供的测定PDHC酶活力的试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。
【专利说明】一种丙酮酸脱氢酶复合物酶活力检测方法和试剂
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定丙酮酸脱氢酶复合物(Pyruvate dehydrogenase complex,PDH complex, PDHC)酶活力的方法，同时本发明还提供了作为丙酮酸脱氢酶复合物的酶活力分析和检测的试剂。
【背景技术】
[0002]丙酮酸，原称焦性葡萄酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一。丙酮酸可通过乙酰CoA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸的氧化脱羧反应是一切需氧生物体内糖、蛋白质和脂肪彻底氧化分解，释放能量，供给机体生理功能需要的关键步骤。丙酮酸的氧化脱羧过程发生在线粒体基质中，由丙酮酸脱氢酶复合物催化该反应的进行。
[0003]丙酮酸脱氢酶复合物(也称丙酮酸脱氢酶复合体，PDHC)属于a-酮酸脱氢酶复合体家族中的一种，存在于微生物、哺乳动物及高等植物中。I3DHC是定位在线粒体基质中的多酶复合体，这个多酶复合体由三种主要的酶，即丙酮酸脱氢酶(E1，EC1.2.4.1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2，EC2.3.1.12)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3，ECl.8.1.4)，和调节它活性的丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶(TOP)及E3结合蛋白(E3BP)，还有一些辅助因子(TPP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA和Mg2+)组成。丙酮酸脱氢酶是I3DHC多酶体系中一种TPP依赖性的脱羧酶，催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP，接下来将在E2的作用下，羟乙基氧化转变为乙酰基同时转移到E2的辅基硫辛酰胺上，形成了乙酰硫辛酰胺。E2还催化乙酰硫辛酰胺上的乙酰基转移给CoA形成乙酰CoA。E3使被还原的硫辛酸重新氧化，将氢传递给辅基FAD，生成FADH2。最后，FADH2再使NAD+还原形成NADH。三个酶参与整个催化反应的过程见图1。
[0004]PDHC是一组限速酶，葡萄糖经糖酵解生成的丙酮酸在TOHC的催化下转化成为三羧酸循环所需要的乙酰辅酶A，同时将NAD+还原为NADH，生成的乙酰辅酶A则进入三羧酸(TCA)循环被彻底氧化分解，生成的NADH、FADH2等高能磷酸化合物通过氧化磷酸化过程最终生成ATP，从而为生物体提供大量的能量。丙酮酸脱氢酶复合物缺乏或发生变异致使其不能将丙酮酸转化为乙酰辅酶A而还原为乳酸，因此依靠三羧酸循环作为乙酰辅酶A的来源受阻，同时ATP的产量亦减少，从而导致代谢障碍，组织受损。丙酮酸脱羧、TCA循环和氧化磷酸化及丙酮酸羧化等各代谢环节中的任何缺陷均可导致丙酮酸和乳酸从循环中清除障碍，产生乳酸血症。乳酸血症主要是由丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶复合物功能缺陷引起的，其中TOHC缺陷是引起乳酸血症最常见的遗传原因，同时TOHC功能缺陷也是导致线粒体能量代谢障碍最常见的原因之一，是早发性退行性神经变性病的最常见病因。因脑内的乙酰辅酶A几乎都来源于丙酮酸，所以TOHC的缺乏常导致脑组织和多种神经系统受损。其临床表现可分成三个等级，I级:病人出生后早期即患有严重的乳酸血症，I3DHC活性极低，男性患儿多于胚胎时期发病，导致流产、死胎、先天性纹状体发育不全、缺氧缺血性脑病，常于新生儿早期死于乳酸酸中毒。II级:乳酸血症较I级轻，出生时正常，智力运动及体格发育落后，患儿多于婴儿期死亡，少数存活到十几岁。III级:患者乳酸血症较轻，PDHC残存活性多闻于20 。
[0005]I3DHC缺陷可发生于其成员各组分中的任何一种，即E1、E2、E3、E3BP和TOP。El缺陷最为常见，由Ela基因突变引起，目前已经发现的近80种引起乳酸血症的TOHC的突变，其中大部分发生在El a亚基上，其基因为TOHAl，该基因定位于Xp22.1?22.2，属X(性)染色体遗传，因其在中枢神经系统中起重要作用，女性杂合子虽仅有一个TOHAl等位基因突变，仍可有代谢缺陷表现，因此本症应归类为X(性)染色体显性遗传。多数I3DHAl基因缺陷为新的突变，而并非由父母亲携带遗传。E2和E3BP缺陷少见，可引起严重精神运动障碍。E3缺乏不仅影响TOHC活性，亦导致a-酮戊二酸和支链酮酸脱氢酶复合体缺陷，E3定位于染色体7q31?q32。E3BP缺乏患者在神经病理检查中最常见的表现是Leigh综合征，胼胝体变薄或缺失、基底节对称性坏死性病变，同时E3BP缺乏的病人TOHC酶的残存活性相对较高。
[0006]对于线粒体疾病的治疗，目前还没有令人满意的方法。对于TOHC缺陷患者，生酮饮食、硫辛酸、二氯醋酸、左旋肉碱、辅酶QlO有一定疗效。因此早诊断早治疗对患者病情的缓解和生活改善都是十分必要的。
[0007]因丙酮酸脱氢酶复合物缺陷引起的线粒体疾病主要涉及神经系统损坏与众多其他因素引起的线粒体脑病难以在症状上进行明显区分，同时TOHC包含的基因数目众多，因此直接进行基因检测无论从经济还是周期上都是代价较高的，而酶学则可以较好的解决这个问题，可以通过酶学检测整体丙酮酸脱氢酶复合物的活力来判断该复合体功能是否正常，而且病情严重程度往往与酶活力残留的比例密切相关，因此判断患者线粒体相关酶的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。临床上通过对疑似线粒体病的患者进行相关酶活力检测，可以实现早诊断、早治疗，对线粒体病预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测线粒体相关酶活力是辅助确诊该病的最佳手段。但因女性携带者存在莱昂化的影响，因此如果从临床症状上严重怀疑是TOHC功能异常的情况下，如果女性酶学检测结果无异常，可通过检测I3DHAl基因进行验证。
[0008]目前己有报道的丙酮酸脱氢酶复合物活性测定方法几乎都是二十世纪五六十年代发展起来的。根据使用的手段可分为放射性同位素标记法和分光光度法。同位素标记法主要用于粗酶液，是基于14C丙酮酸经过El (PDH)的催化作用转化为CO2，可以通过测定14C标记的CO2生成量来测定El酶的活性。分光光度法有测定丙酮酸脱氢酶复合体活性的还原型辅酶I法、碘硝基四唑紫法，测定丙酮酸脱氢酶复合体中El酶活力的2，6-二氯吲哚酚法和铁氰化钾法、MTT法等。同位素标记法是采用动态的测量，没有分光光度法便利，同时它还用到一种相对不稳定的放射性物质，易造成环境污染。但常用的几种分光光度法中均存在很多不足之处，如铁氰化钾法的灵敏度极低；2，6-二氯吲哚酚法灵敏度较高，但易受到疏基保护剂的影响。测定还原型辅酶I (NADH)形成速率的标准分光光度法常被用于纯化的丙酮酸脱氢酶复合体活性的测定，这种方法由于易受到丙酮酸脱氢酶复合体反应产物的副反馈抑制而受到限制，且试剂价格昂贵。总之分光光度法具有的检测灵敏度较低，准确度差，对样品的需求量大等缺点，与荧光法检测酶活具有蛋白用量少，检测灵敏度高，特异性高，准确度高等优点形成了鲜明的对比，因此尽快开发出用荧光法检测roHC酶活力的方法是刻不容缓的。
[0009]理想的PDHC酶活力检测标本是选用疾病受累明显的组织，例如脑和肌肉组织，以获得足量的线粒体蛋白，但是这些组织很难取材，目前多选用骨骼肌或皮肤成纤维细胞。而皮肤或骨骼肌活检均为创伤性检查，患儿及家长较难接受，正常值收集困难，临床推行皮肤或骨骼肌组织的酶活力测定难度很大。相对而言，外周血的取材要容易而且创伤很小，但是，由于外周血淋巴细胞中线粒体含量较少，提取线粒体及分离线粒体蛋白难度很大。已有报道中检测roHC酶活力的标本多是采用肌肉等组织进行提纯roHC，然后对TOHC纯酶复合物进行酶活力的检测，对于一般的粗酶液则检测的灵敏度很低，且在粗酶液中roHC的酶活检测干扰性很大，因此要确定其结果的准确性是方法建立时的首要考虑因素。
[0010]基于这些技术背景和临床诊断的现实需求，我们一直在努力研究建立新的荧光法，以期更加灵敏的准确的检测样本中的线粒体丙酮酸脱氢酶复合物的活性，并已取得了重要成果:我们建立了一种荧光法检测外周血roHC酶活力的方法，实现了测试的灵敏度的极大提高，降低了对测试样本的量的需求，还大大地提高了测试的准确度，为线粒体病临床及病因诊断进一步奠定坚实的技术基础，必将产生更好的社会效益。
【发明内容】
[0011]本发明解决的技术问题是:提供一种快速、特异、准确可靠的丙酮酸脱氢酶复合物(Pyruvate dehydrogenase complex, PDH complex, PDHC)的酶活力的突光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定丙酮酸脱氢酶复合物酶活力的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。
[0012]本发明提供的是一种创新的丙酮酸脱氢酶复合物酶活力的检测方法和检测试剂，丙酮酸脱氢酶复合物就是F1DH complex,英文名称为Pyruvate dehydrogenase complex,也经常简称为roHC。本发明的摘要，权利要求书和说明书中用到上述名称的任何一个都是相同意思的表达。
[0013]为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下:
[0014]本发明提供的是一种荧光法检测丙酮酸脱氢酶复合物(roHC)的酶活力。这种丙酮酸脱氢酶复合物(roHC)酶活力测定方法的原理如下:丙酮酸脱氢酶复合物的三个主要酶即丙酮酸脱氢酶(El)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)能够有序的催化丙酮酸转化成乙酰辅酶A，其中El可以在TPP和Mg2+的参与下催化丙酮酸脱羧生成C02和羟乙基-TPP，羟乙基-TPP在硫辛酸的参与下由E2催化生成乙酰辅酶A，E3使被还原的硫辛酸重新氧化，将氢传递给辅基FAD，生成FADH2。最后，FADH2再使NAD+还原形成NADH (见图1所示)。由于TOHC催化底物反应的速率与最终产物NADH的生成量成正比，因此根据各酶组份的催化活性的特点，利用丙酮酸作为底物，检测最终产物NADH的生成即可检测整体丙酮酸脱氢酶复合物的酶活力。NADH在特定的激发波长下可以发射荧光，且其反应的速率与产物产生的荧光强度成正比，通过检测荧光值的变化就可以计算待测样本中的丙酮酸脱氢酶复合物酶活力。
[0015]NADH同时还在特定的波长下具有特异的光吸收，因此也可检测在特定波长下的NADH的吸光值的变化来计算出I3DHC的酶活力，显然这种可见光的检测方法不如前述的荧光法那么灵敏，稳定，特异和准确。
[0016]上述反应原理也可以用以下反应方程式来简单表示:
[0017]NAD++丙酮酸+辅酶A — NADH+乙酰辅酶A+C02+H+
[0018]本发明权利要求书2提供的是一种TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:它是根据本发明的权利要求书I所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于roHC酶活力的分析和检测。
[0019]本发明提供的如权利要求书2-3所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:其主要成分还可以包括丙酮酸或丙酮酸盐、辅酶A和NAD+，其中丙酮酸或丙酮酸盐是TOHC的天然底物，这种检测试剂主要用于roHC酶活力的分析和检测。
[0020]本发明提供的如权利要求书2-4所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括特异添加成分，这种特异试剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制干扰roHC酶活力的试剂或分子。roHC的总酶活力可以通过加入干扰酶的抑制剂得到的酶活力来检测。roHC的特异性酶活力可以通过计算roHC总活力与roHC的非特异活性(加入一定浓度的roHC特异抑制剂后得到的酶活力)的差值得到。这种检测试剂主要用于roHC的酶活力的分析和检测。这种特异试剂包括但不限于以下实例:鱼藤酮、安密妥、安密妥钠盐、草氨酸盐。roHC的特异抑制剂包括但不限于以下实例:甲基乙酰基膦酸钠盐、alpha-(取代苯氧乙酰氧基)烃基膦酸酯、O-甲基a _(2，4-二氯苯氧基乙酰氧基)甲基膦酸酯单钠盐、烷基酰基膦酸酯(盐)或次膦酸酯(盐)等。
[0021]本发明提供的如权利要求书2-5所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括稳定剂。所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂(detergent)及防腐剂，它的存在可以稳定I3DHC的物化性质，利于I3DHC的酶活力的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例:Triton χ-100、Tween20、NP40、Brij-35、NaN3。
[0022]本发明提供的如权利要求书2-5所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于其主要成分还可以包括缓冲试剂。所述缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0—9.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定PDHC的催化反应的PH值，并可以稳定TOHC的物化性质，从而利于TOHC的酶活力的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例:
[0023]乙酸钠/ 乙酸:ρΗ2.6-5.8
[0024]柠檬酸/柠檬酸钠:ρΗ3.0-6.6
[0025]磷酸氢盐/柠檬酸(盐):ρΗ2.2-8.0
[0026]磷酸盐:ρΗ4.9-8.2
[0027]柠檬酸/氢氧化钠/盐酸:ρΗ2.2-6.5
[0028]MES:pH5.5-6.7
[0029]MOPS:pH6.5-7.9
[0030]HEPES:pH6.8-8.2
[0031]Tris-盐酸:ρΗ7.1-8.9
[0032]硼酸-硼砂缓冲液:ρΗ7.4-9.0[0033]如权利要求书7所述，本发明还提供了一种检测TOHC酶活力的试剂，其特征在于:它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括:
[0034]
缓冲液10^10()0mmoI/L
pH 范围5.0—9.0
Il 定 il0.01*?-10%
丙酮酸0.05—5mmol/L
_ M A0.05— I Omg/mL
TPP0.TO5—5mmd/L
NAD'0?5—20mmo1/L
特-1式剂5— 10()mmol/L
[0035]这种检测试剂主要用于roHC的酶活力分析和检测。
[0036]实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双剂还是三剂，如下成分关系的本发明roHC检测试剂较为理想:
[0037]
缓冲液25 —100mmol/L
pH 范 I刘6.5—~8.5
稳记剂0.0丨一0,05%
W _ 酸O, 1-2mmol/L
辅_ A0.5—5mg/mL
TPP0.01—5mmol/L
NAD'2—lOmmd/L
特)f 试剂20~80mmol/L
[0038]
[0039]本发明的TOHC酶活力检测试剂可以配成如下双剂试剂:
[0040]试剂I
[0041]缓冲液，稳定剂，辅酶A，TPP, NAD
[0042]试剂2
[0043]特异试剂、丙酮酸钠
[0044]试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。
[0045]也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂:
[0046]试剂I
[0047]缓冲液，稳定剂，辅酶A，TPP, NAD+
[0048]试剂2
[0049]缓冲液，稳定剂，丙酮酸钠[0050]试剂3
[0051]特异试剂
[0052]试剂可以是制成干粉，溶解后使用；或是配成液体试剂，可以直接使用。
[0053]本发明提供的如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析和检测各种待测样本中的roHC的酶活力，特别是检测人体各种体液、组织或细胞样本中roHC的酶活力。这些被检测的样本包括但不限于脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞，提取的线粒体、提取的各种纯度的roHC样品等。
[0054]本发明提供的如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力检测方法和试剂，其特征在于，它可以用于分析、检测和诊断待测样本中的roHC的酶活力异常导致的各种疾病，特别是由roHC的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与roHC的酶活力相关的疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]图1:丙酮酸脱氢酶复合物的催化反应原理。El:丙酮酸脱氢酶；E2:二氢硫辛酸乙酰转移酶；E3:二氢硫辛酸脱氢酶；LipS2:硫辛酸；LipS2H2:二氢硫辛酸；Acyl-lipoate:乙酰硫辛酰胺；CoASH:辅酶A ；Acetyl-CoA:乙酰辅酶A ；FAD:黄素腺嘌呤二核苷酸；FADH2:还原性黄素腺嘌呤二核苷酸；NAD+:氧化型辅酶I ;NADH:还原型辅酶I ;Pyruvate:丙酮酸；TPP:硫胺素焦磷酸；Acyl-TPP:羟乙基-TPP ；C02:二氧化碳
[0056]图2:猪心肌线粒体丙酮酸脱氢酶复合物纯酶的酶动力学测定结果(猪心肌线粒体丙酮酸脱氢酶复合物纯酶的酶动力学曲线)。总活性检测:曲线线性方程为:y =1.972x+15.069，R2 = 0.999。非特异性活性检测:检测体系中加入了浓度为0.5mg/mL的PDHC特异性抑制剂乙酰基膦酸酯。曲线线性方程为:y = 0.075x+40.69，R2 = 0.904。
[0057]图3:猪骨骼肌线粒体丙酮酸脱氢酶复合物的酶动力学测定结果(猪骨骼肌线粒体丙酮酸脱氢酶复合物的酶动力学曲线)。总活性检测:曲线线性方程为:y =
1.196x+31.861, R2 = 0.999 ;非特异性活性检测(去除NAD+):曲线线性方程为:y =
0.0524x+18.304, R2 = 0.952 ;非特异性活性检测(去除辅酶A):曲线线性方程为:y=0.0519x+41.45, R2 = 0.995 ;非特异性活性检测(去除TPP):曲线线性方程为:y =
0.1065x+39.787，R2 = 0.971 ;非特异性活性检测(去除丙酮酸钠):曲线线性方程为:y =
0.171x+39.806，R2 = 0.991。
[0058]图4:人血白细胞线粒体丙酮酸脱氢酶复合物酶活力测定结果。图中所示结果为扣除空白对照的荧光值。
【具体实施方式】
[0059]为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权利要求书具体限定。
[0060]实施例一人血液白细胞中的线粒体提取
[0061]取人外周全血5ml，加入20ml裂解液(0.1mM EDTA)，处理15min以破碎红细胞，3000rpm离心lOmin，弃上清，收集沉淀即是白细胞，以生理盐水洗涤白细胞两次，3500rpm离心5min,弃上清，收集白细胞沉淀。向沉淀加入5ml细胞悬浮液(0.25M Sucrose, 5mMHEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4)悬浮细胞，玻璃匀浆器匀浆20次，匀浆液经1000g离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清于1000Og离心10分钟，弃上清，收集沉淀即为线粒体，线粒体可在-80°C条件下保存。
[0062]实施例二猪骨骼肌线粒体的提取
[0063]称取已剪除脂肪组织的猪骨骼肌750g，加入2.25L的0.25M(内含0.01M, pH8磷酸缓冲液)的蔗糖溶液，分三次捣碎75秒，捣碎前加入适量6N KOH保持pH7.2-7.4，KD-70离心机以2600-2800rpm离心10分钟,用四层纱布过滤后,弃沉淀。上清在Beckman J2-21以1200rpm离心25分钟，所得沉淀即为线粒体，线粒体可在_80°C条件下保存。
[0064]实施例三线粒体丙酮酸脱氢酶复合物粗酶液的制备
[0065]将实施例一和实施例二制得的线粒体以悬浮介质(内含0.25MSucrose, 5mMHEPES, 0.5mM EGTA, pH7.4)悬起，然后超声，超声10s，间歇10s，共超声10次处理，然后BCA法定蛋白浓度为lug/ul，该悬浮液即为含有丙酮酸脱氢酶复合物的粗酶液，定好浓度后放于4°C环境中待用。
[0066]实施例四猪心肌线粒体丙酮酸脱氢酶复合物纯酶的活性测定(酶动力学法)
[0067]本实施例的线粒体I3DHC检测试剂为双剂试剂，包括
[0068]
【权利要求】
1.一种丙酮酸脱氢酶复合物(PDH complex，roHC)活性测定方法，其特征在于它的原理如下: 丙酮酸脱氢酶复合物的三个主要酶即丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)能够有序的将丙酮酸催化脱羧生成产物C02、乙酰辅酶A和NADH。
2.由于TOHC催化底物反应的速率与最终产物NADH的生成量成正比，因此根据各酶组份的催化活性的特点，利用丙酮酸作为底物，检测最终产物NADH的生成即可检测整体丙酮酸脱氢酶复合物的酶活力。
3.NADH在特定的激发波长下可以发射荧光，且其反应的速率与产物产生的荧光强度成正比，通过检测荧光值的变化就可以计算待测样本中的丙酮酸脱氢酶复合物酶活力。
4.一种丙酮酸脱氢酶复合物活性检测试剂，其特征在于:它是根据权利要求书I所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于TOHC整体酶活力的分析和检测。
5.如权利要求书2所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:其主要成分包括如权利要求书I所述的丙酮酸、辅酶A、NAD+，这种检测试剂主要用于TOHC酶活力的分析和检测。
6.如权利要求书2-3所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:其主要成分还可以包括辅因子TPP、Mg2+，这种检测试剂主要用于TOHC酶活力的分析和检测。
7.如权利要求书2-4所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:其成分中还可以包括特异试剂，这种试剂是在酶学上普遍被接受的各种能够表现TOHC特异酶活力的试剂或分子。
8.如权利要求书2-5所述的TOHC酶活力检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的PH值缓冲或稳定5.0 — 9.0的范围中的试剂。
9.一种丙酮酸脱氢酶复合物酶活力检测试剂，其特征在于:它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括: 如权利要求书6所述的缓冲液10— 1000mmol/LpH 范围5.0—9.0 如权利要求书6所述的稳定剂0.01% —10% 丙丽酸0.05一Smmol /I, 辅酶 A0.05—10mg/mL TPP0.005—5mmol/L NAD+0.5—20mmol/L 如权利要求书5所述的特异试剂5—100mmol/L 这种检测试剂主要用于TOHC酶活力分析和检测。
10.根据权利要求7所述TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、辅酶A、TPP、NAD+、特异性试剂组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶A、TPP、NAD+组成；试剂2，由特异试剂、丙酮酸组成。
11.根据权利要求7所述TOHC酶活力检测试剂，其特征在于:由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、辅酶A、TPP、NAD+、特异试剂组成组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶A、TPP、NAD+组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸组成；试剂3，由特异试剂组成。
12.如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中TOHC的酶活力。
13.如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中的TOHC酶活力。
14.如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析和检测未提取纯化和提取的各种纯度的TOHC的酶活力。
15.如权利要求书1-9所述的TOHC酶活力测定的方法和酶活性检测的试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与TOHC酶活力异常导致的各种疾病，特别是由TOHC酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。
【文档编号】G01N21/64GK103913440SQ201410110565
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】郝淑静, 刘卫德, 齐晓丽, 刘晓敏 申请人:北京和信非凡生物技术有限公司