一种中国大鲵趾骨切片的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种中国大鲵趾骨切片的制备方法及应用，采用大鲵趾骨第二关节作为切片材料，通过取样、硬化、脱钙、切片、染色、脱水透明，制得一种中国大鲵趾骨切片，本发明采用大鲵趾骨第二关节作为切片材料，与第一和第三关节相比，该部分长度较长，而且粗细较为均匀，易于固定和观察切面轮廓。在染色方法上面，根据以往各种染色方法步骤的特点，本研究特异性的采用了不同的步骤组合，使组织显色更清晰，增加无水乙醇浸泡和二甲苯，提高了显色的结果。
【专利说明】—种中国大鲵趾骨切片的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生态学研究领域，具体涉及一种中国大鲵趾骨切片的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]年龄鉴定是研究动物种群生态学的重要基础，动物的个体生长、种群的补充和死亡计算，都需要有精确的年龄数据。动物年龄鉴定具有较长的研究历史。骨龄学鉴定方法是基于动物骨骼切片上可数的生长线(lines of arrested growth,LAGs)进行的年龄结构分析。早在18世纪，科学家就开始利用鱼类的骨质结构鉴定鱼类年龄。利用其硬骨组织上的轮纹鉴定年龄是最为传统和常用的方法。骨质结构上年轮鉴定是基于以下理论:夏季鱼类大量摄取营养物质，生长十分迅速，而在冬季鱼类由于缺少食物，其生长速度就缓慢下来，甚至停滞。这种生长规律具体反映在骨质结构上，即春夏季鱼类生长十分迅速，在骨质上形成许多同心圈，而且呈现较为宽松状况，称为“疏带”，而到了秋冬季节，生长缓慢甚至停滞，则在骨质上形成较窄的同心圈，称为“密带”，疏带和密带结合起来构成生长带，这样，每年就形成一个生长轮带，也就是一个年龄带或者一个年轮。鉴定年轮时，以秋冬季形成的密带和翌年春夏季形成的疏带之间的分界线为年龄标志。
[0003]中国大鲵的年龄鉴定到目前还未见报道，查阅其它两栖类的年龄鉴定发现有用各年龄头体长的相关性得出鉴定年龄的形态学标准，但多是利用骨骼进行的，然而对于无尾两栖类和有尾两栖类其方法也不完全通用，结果有差异。大鲵作为一种重要的保护性经济动物，关于其生物学特征已有较多研究，但是关于其年龄鉴定仍属于空白。年龄作为种群研究的重要基础之一，它对于一个物种最长寿命、死亡率、生长特点、性成熟等种群生态研究具有重要的意义，尤其在大鲵野生种群下降，人工养殖种群迅速增加的情况下，如何准确且尽量无损伤的鉴定大鲵年龄，为大鲵种群生物学研究提供基础资料，是非常重要且有意义的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了一种中国大鲵趾骨切片的制备方法，该方法准确、稳定易于操作。比较起传统的石蜡切片方法，冷冻切片方法步骤简单，所用的时间短。
[0005]本发明的另一个目的在于提供了一种中国大鲵趾骨切片的制备方法的应用。利用本发明所述方法制得的切片，染色清晰，骨龄条带清楚，年龄判定准确。
[0006]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0007]一种中国大鲵趾骨切片的制备方法，步骤如下:
[0008](I)取样:将中国大鲵趾骨置于波恩氏液(Bouin’ s)在常温(20_25°C)中固定12h-72h。
[0009]所述的波恩氏液配方为:苦味酸75ml,无水甲醒25ml和冰醋酸3ml混合摇勻。
[0010](2)硬化:将固定的样本放在80% (V/V)的乙醇中硬化10?15h。[0011](3)脱钙:将处理好的样本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脱钙18?26h。再自来水流水冲洗2?4h去酸。最后再用30% (W/V)蔗糖浸泡5h-10h，主要是为了使组织沉降而变
得更均一。
[0012](4)切片:取趾骨第二关节用OTC组织包埋剂(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷冻包埋至完全冻结，然后放在冷冻切片机载物台上固定，将固定好的样品切成15?25 μ m的厚度，粘贴到载玻片上进行贴片固定，置于37°C烘箱内烘烤2h使其充分贴片。
[0013](5)染色:将切好的片子，用苏木精染色5min后，用0.8% (V/V)盐酸乙醇浸泡IOsec,自来水冲洗2min,再用伊红染色3min,自来水冲洗I?2min。
[0014](6)脱水透明:将染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接着无水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得一种中国大鲵趾骨切片。
[0015]以上所述的制备方法，步骤(3)中脱钙时，对于幼龄大鲵，其骨骼钙化程度较低，所以脱钙时间短，而对年龄大的样本则要增加脱钙时间，因此脱钙时间为18?26h不等，以针刺骨骼发现其软化即可。
[0016]一种中国大鲵趾骨切片的制备方法的应用，具体如下:
[0017]将制备好的切片置于显微镜下观察，依据片子上的年轮标志数目鉴定年龄。由成骨细胞的细胞核形成的“环形”代表年轮，这样的年轮标志数目代表年龄数。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0019]本发明用固定液对中国大鲵趾骨进行固定，经过预处理、脱钙等步骤，选择趾骨第二关节为材料，利用冷冻切片技术结合苏木精伊红染色对中国大鲵趾骨进行切片观察，发现有类似年轮特征，并且“年轮”与其实际年龄相符，同时利用该方法在对未知年龄的大鲵进行年龄鉴定时也得到了证实。同时，本发明所述方法是非致死的，也可用于活体的大鲵年龄鉴定。
[0020]染色时利用盐酸乙醇浸泡对组织片起分化作用。盐酸在水中电离出氢离子，能使组织片电荷发生改变，使组织片过多吸附的染料，从组织中脱离，使不应着色的颜色脱净，应着色的色彩变得更加清晰适中。
[0021]本研究采用大鲵趾骨第二关节作为切片材料，与第一和第三关节相比，该部分长度较长，而且粗细较为均匀，易于固定和观察切面轮廓。在染色方法上面，根据以往各种染色方法步骤的特点，本研究特异性的采用了不同的步骤组合，比如利用0.8% (V/V)盐酸乙醇浸泡苏木精染色后的切片，使组织显色更清晰，增加无水乙醇浸泡和二甲苯透明，都提高了显色的结果。
[0022]比较起传统的石蜡切片方法，冷冻切片方法步骤简单，所用的时间短，从包埋到切片仅需要约Ih即可，而传统方法中仅包埋到切片就需要3h ;其次，冷冻切片的方法所使用的包埋剂为OTC组织包埋剂，包埋方便且后续不需要再对其进行处理，而传统的石蜡切片要用石蜡作为包埋剂，不仅要注意石蜡融化的时间和温度，而且在包埋切片后还要再进行脱蜡的步骤；同时，相比石蜡切片，冷冻切片所需要的试剂和材料也少，而且在实验过程中，对已知和未知年龄段大鲵的分析结果都可以看到清楚的骨龄。说明该方法有很高的操作性和重复性。【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为不同年龄大鲵骨骼切片结果示意图。
[0024]其中同心圈表示的年龄环。上图为4龄大鲵的切片结果，下图为10龄大鲵的切片结果。
【具体实施方式】
[0025]本发明实施例所用实验样品，如未特别说明，均为已自然死亡的动物样本，所用试剂均为生化公司购得。
[0026]实施例1:
[0027]一种中国大鲵趾骨切片的制备方法，其步骤如下:
[0028]I材料和方法
[0029]1.1用具和试剂
[0030]手术剪、镊子、烧杯、玻片、冷冻切片机(Leica，德国)、冷冻切片包埋剂0TC(Leica，德国)，染色杯。
[0031]3%硝酸溶液，苏木精染液，伊红染液，0.8%盐酸乙醇溶液。
[0032]1.2 方法
[0033]1.2.1以大鲵趾骨第二关节为研究对象制成切片，观察大鲵年龄结果。
[0034]1.2.2取已知年龄大鲵样本利用该方法进行年龄鉴定。
[0035]具体步骤如下:
[0036](I)取样:将4龄中国大鲵趾骨样本在常温中置于波恩氏液(Bouin’s)中固定24h。波恩氏液配方为苦味酸75ml，无水甲醛25ml和冰醋酸3ml混合摇匀。
[0037](2)硬化:将固定的样本放在80% (V/V)的乙醇中硬化12h。
[0038](3)脱钙:将处理好的样本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脱钙，脱钙18h。再自来水流水冲洗3h去酸，最后再分别用30% (W/V)的蔗糖脱水5h。
[0039](4)切片:取趾骨第二关节用OTC组织包埋剂(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷冻包埋30min，在冷冻切片机上将固定好的样品切成25 μ m的厚度，后置于37°C烘箱内烘烤2h使其充分贴片。
[0040](5)染色:将切好的片子，用苏木精染色5min后，用0.8%(V/V)盐酸乙醇浸泡IOsec后，自来水冲洗2min，再用伊红染色3min，自来水冲洗Imin即可。
[0041]0.8% (V/V)盐酸乙醇配法为:1ml浓盐酸与99ml75%乙醇混匀即可。
[0042](6)脱水透明:将染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接着无水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得4龄大鲷的趾骨切片。
[0043]实施例2:
[0044]—种中国大鲵趾骨切片的制备方法，其步骤如下:
[0045]I材料和方法
[0046]1.1用具和试剂
[0047]手术剪、镊子、烧杯、玻片、冷冻切片机(Leica，德国)、冷冻切片包埋剂0TC(Leica，德国)，染色杯。
[0048]3%硝酸溶液，苏木精染液，伊红染液，0.8%盐酸乙醇溶液。
[0049]1.2 方法
[0050]1.2.1以大鲵趾骨为研究对象制成切片,观察大鲵年龄结果。
[0051]1.2.2取未知年龄大鲵样本利用该方法进行年龄鉴定。
[0052]具体步骤如下:
[0053](I)取样:将未知年龄大鲵趾骨在常温中置于波恩氏液(Bouin’s)中固定72h。
[0054]波恩氏液配方为:苦味酸75ml，无水甲醛25ml和冰醋酸3ml混合摇匀。
[0055](2)硬化:将固定的样本放在80% (V/V)的乙醇中硬化12h。
[0056](3)脱钙:将处理好的样本放在3% (W/V)的硝酸溶液中脱钙，脱钙26h。再自来水再自来水流水冲洗3h去酸，最后再分别用30% (W/V)的蔗糖脱水5h。
[0057](4)切片:取趾骨第二关节用OTC组织包埋剂(opt1-mum cutting temperaturecompound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)冷冻包埋30min，在冷冻切片机上将固定好的样品切成15 μ m的厚度，后置于37°C烘箱内烘烤2h使其充分贴片。
[0058](5)染色:将切好的片子，用苏木精染色5min后，用0.8%(V/V)盐酸乙醇浸泡IOsec后，自来水冲洗2min，再用伊红染色3min，自来水冲洗Imin即可。
[0059](6)脱水透明:将染色的片子依次在50% (V/V)和85% (V/V)的酒精中浸泡lOsec，然后在95% (V/V)的乙醇浸泡3min,接着无水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得大鲷的趾骨切片。
[0060]实施例3:
[0061]一种中国大鲵趾骨切片的制备方法的应用，其步骤如下:
[0062]将实施例1和2中制备好的切片置于显微镜下观察，依据片子上的年轮标志数目鉴定年龄。
[0063]从图1中可以看出，利用本发明所述方法可以明显看出在大鲵骨骼中存在一组同心圈，同心圈呈由苏木精染色后显示的蓝黑色，轮廓明显但会存在不完全闭合现象，圈内相间部分呈现由伊红和苏木精共同显示的深蓝粉色。同心圈清晰可辨，也就是所谓的“骨龄”。利用本发明所述方法鉴定出已知年龄的骨龄与实际相同为4龄；而未知年龄的大鲵骨龄为10龄。
【权利要求】
1.一种中国大鲵趾骨切片的制备方法，步骤如下: (1)取样:将中国大鲵趾骨置于波恩氏液在常温中固定12h?72h； (2)硬化:将固定的样本放在80%的乙醇中硬化IOh?15h； (3)脱钙:将处理好的样本放在3%的硝酸溶液中脱钙18?26h，再自来水流水冲洗2?4h去酸,最后再用30%鹿糖浸泡5?IOh ； (4)切片:取趾骨第二关节用OTC组织包埋剂冷冻包埋至完全冻结，然后放在冷冻切片机载物台上固定，将固定好的样品切成15?25Mm的厚度，粘贴到载玻片上进行贴片固定，置于37 °C烘箱内烘烤2h使其充分贴片； (5)染色:将切好的片子，用苏木精染色5min后，用0.8%盐酸乙醇浸泡lOsec，自来水冲洗2min，再用伊红染色3min，自来水冲洗f 2min ； (6)脱水透明:将染色的片子依次在50%和85%的酒精中浸泡lOsec，然后在95%的乙醇浸泡3min,接着无水乙醇浸泡3min, 二甲苯3min,既得一种中国大鲷趾骨切片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述波恩氏液配方为:苦味酸75ml，无水甲醒25ml和冰醋酸3ml混合摇勻。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，脱钙时间的确定是以针刺骨骼发现其软化即可。
4.权利要求1所述制备方法制得的切片在鉴定大鲵年龄中的应用。
【文档编号】G01N1/30GK103884560SQ201410141842
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】孟彦, 刘小召, 肖汉兵, 田海峰, 胡乔木 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所