一种生脉注射液中麦冬皂苷d和麦冬皂苷d′的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′的检测方法，该方法包括前处理步骤：将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。根据本发明的检测方法，能很好的分离麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′的色谱峰以及相邻色谱峰，能更准确的测定麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′的含量，提高了生脉注射液的有效性和可控性。
【专利说明】一种生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药有效成分的测定方法，尤其涉及生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D,含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]生脉注射液为淡黄色至淡黄棕色的澄明液体，其主要功能为:益气养阴，复脉固脱。生脉注射液用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短、四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者。生脉注射液静注射能迅速全面地改善失血休克动物的血流动力学参数，促进休克状态好转，其作用强度明显强于补充生理盐水组，与甘露醇组无显著差异，但在抗休克作用维持时间上又明显长于甘露醇组；其抗休克作用有一定的量效相关性。生脉注射液足量静脉注射能显著延缓中毒性休克动物的血压下降，对内毒素攻击后的动物死亡也有明显延缓作用。生脉注射液能明显降低痢疾杆菌感染所致动物的死亡率。
[0003]麦冬具有滋阴生津，润肺清心等功效，是临床上治疗心血管疾病的重要组成药物，麦冬的主要成分为留体皂苷、多糖和高异黄酮类化合物。麦冬总皂苷主要含麦冬皂苷A、B、C、D及麦冬皂苷B'、C'、D'，其中麦冬皂苷A、B、C、D苷元为鲁斯考皂苷元，麦冬皂苷B'、C'、D'苷元为薯蓣皂苷元。药理研究表明:麦冬总皂苷具有抗心肌缺血损伤和抗心率失常作用。在川麦冬中总皂苷主要含麦冬皂苷D，麦冬皂苷D主要药理作用有:显著抑制静脉血栓的模型大鼠早期外周血中性粒细胞活化和粘附，减轻血栓重量，降低血清sICAM-1含量，降低炎症反应，抑制血栓形成，稳定线粒体膜电位，减少钙离子流失，增加细胞活力，对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)有一定的保护作用。
[0004]麦冬作为生脉注射液主要药物之一，如何对麦冬阜苷D和D'进行定量检测,进一步提高生脉注射液的有效性与可控性，是很多药学工作者一直希望解决的问题。
【发明内容】
[0005]为此，本发明提出了一种能够解决上述问题或者部分解决上述问题的生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di的检测方法。
[0006]根据本发明的一方面，提供了一种生脉注射液中麦冬阜苷D和麦冬阜苷D'的检测方法，该方法包括前处理步骤:
[0007]将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；
[0008]合并有机相，将有机相蒸干得到固体；
[0009]将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。
[0010]可选地，根据本发明的检测方法，其中所述有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
[0011]可选地，根据本发明的检测方法，其中所述正丁醇为水饱和正丁醇。
[0012]可选地，根据本发明的检测方法，其中，在萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:1?1:4。[0013]可选地，根据本发明的检测方法，其中，在萃取时萃取次数为2?5次。
[0014]可选地，根据本发明的检测方法，该方法进一步包括固相萃取步骤:
[0015]将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；
[0016]上样后用水冲洗,然后用45-65%的甲醇或乙腈水溶液冲洗；
[0017]收集甲醇或乙腈的水溶液，蒸干得到固体；
[0018]将固体用甲醇或乙腈转移定容。
[0019]可选地，根据本发明的检测方法，其中，上样和洗脱流速小于等于1.0ml/min。
[0020]可选地，根据本发明的检测方法，其中，上样后用10-30毫升水进行冲洗，用25-45毫升甲醇或乙腈水溶液冲洗。
[0021]可选地，根据本发明的检测方法，该方法进一步包括高效液相检测步骤:
[0022]将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为45:55?55:45。
[0023]可选地，根据本发明的检测方法，其中高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0024]根据本发明的检测方法，在生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D，的色谱峰与相邻色谱峰能够得到很好的分离，麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的含量能够更准确的测定，提高了生脉注射液的有效性和可控性。本发明技术方案还具有:准备工作简单、使用设备较少、成本低廉，测定结果准确性高、精密度强的优点。
[0025]经本发明方法测定过麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'含量的生脉注射液可以保证在临床医学上的量化使用，医生可以准确把握对患者使用生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的量，并对不同患者调整生脉注射液的用量。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其它优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附图中:
[0027]图1示出了根据本发明一种实施方式的检测方法流程图；
[0028]图2示出了麦冬皂苷D和麦冬皂苷IV对照品HPLC色谱图；
[0029]图3示出了生脉注射液浓缩后直接进样的HPLC色谱图；
[0030]图4示出了生脉注射液用水饱和正丁醇萃取浓缩后HPLC色谱图；
[0031]图5示出了不含麦冬的样品(阴性)用水饱和正丁醇萃取浓缩后HPLC色谱图；
[0032]图6示出了不含麦冬的样品(阴性)的HPLC色谱图
[0033]图7示出了生脉注射液HPLC色谱图
【具体实施方式】
[0034]本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。
[0035]本发明提供了一种生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di的检测方法，首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂优选正丁醇或乙酸乙酯；正丁醇进一步优选水饱和正丁醇，萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比优选1:1?1: 4，更进一步地优选1: 2，萃取次数优选2?5次，更进一步地优选4次。其中所述水饱和正丁醇是通过将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为1:1)，振摇混匀后放置过夜或超声处理lOmin，得到的混合液进行分层后，上层为水饱和的正丁醇溶液，用于药物有效成分提取时增加了正丁醇的溶解度，适用于深度萃取。
[0036]在前处理步骤结束后进入固相萃取步骤S1200:将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；上样后用水冲洗,然后用45-65%的甲醇或乙腈水溶液冲洗；收集甲醇或乙腈的水溶液，蒸干得到固体；将固体用甲醇或乙腈转移定容。其中在上样和洗脱时其流速小于等于1.0ml/min,优选0.5ml/min ;上样后优选用10-30毫升水进行冲洗,进一步优选用20毫升水冲洗；上样后用25-45毫升甲醇或乙腈水溶液冲洗；其中ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱，由于他有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。
[0037]最后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为55:45?45:55，优选52:48 ;高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0038]在通常的高效液相分析中，麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'不易得到分离度好的色谱图，不能准确测定其含量。采用本发明的方法使大部分干扰测定的物质被有效除去，提高了测定的准确性。
[0039]根据本发明检测方法涉及的工艺参数众多，因此根据本发明的权利要求可以设计出不同的实施例来检测麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di。具体的实施例仅作为对本发明具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明保护范围的限制。下面将以本发明提供的冬皂苷D和麦冬皂苷Di的检测方法为实施例对本发明进行进一步描述。
[0040]实施例1
[0041]根据本发明的生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di的检测方法，首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂为正丁醇，萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:1，萃取次数为2次。之后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为45:55，高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0042]实施例2
[0043]根据图1不出的本发明一种实施方式的生脉注射液中麦冬阜苷D和麦冬阜苷D'的检测方法，首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂为乙酸乙酯，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:4，萃取次数为5次。在前处理步骤结束后进入固相萃取步骤S1200:将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；上样后用水冲洗，然后用45%的甲醇水溶液冲洗；收集甲醇的水溶液，蒸干得到固体；将固体用甲醇转移定容。其中在上样和洗脱时其流速为1.0ml/min;上样后用IO毫升水进行冲洗，用45%的甲醇溶液25毫升。最后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为55:45 ;高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0044]实施例3
[0045]本发明提供了一种生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的检测方法，首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂为水饱和正丁醇，萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:2，萃取次数为4次。其中所述水饱和正丁醇是通过将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为1:1)，振摇混匀后放置过夜或超声处理lOmin，得到的混合液进行分层后，上层为水饱和的正丁醇溶液，用于药物有效成分提取时增加了正丁醇的溶解度，适用于深度萃取。在前处理步骤结束后进入固相萃取步骤S1200:将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；上样后用水冲洗,然后用60%的乙腈水溶液冲洗；收集乙腈的水溶液，蒸干得到固体；将固体用水溶解，乙腈转移定容。其中在上样和洗脱时其流速为0.5ml/min ;上样后用20毫升水进行冲洗，用45毫升60%的乙腈水溶液进行冲洗。最后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为50:50 ;高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0046]实施例4
[0047]本发明提供了一种生脉注射液中麦冬阜苷D和麦冬阜苷D'的检测方法,首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂为水饱和正丁醇，萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:3，萃取次数为3次。其中所述水饱和正丁醇是通过将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为1:1)，振摇混匀后放置过夜或超声处理lOmin，得到的混合液进行分层后，上层为水饱和的正丁醇溶液，用于药物有效成分提取时增加了正丁醇的溶解度，适用于深度萃取。在前处理步骤结束后进入固相萃取步骤S1200:将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；上样后用水冲洗，然后用50%的乙腈水溶液冲洗；收集乙腈的水溶液，蒸干得到固体；将固体用乙腈转移定容。其中在上样和洗脱时其流速为0.8ml/min ;上样后用25毫升水进行冲洗。最后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为52:48 ;高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0048]实施例5
[0049]本发明提供了一种生脉注射液中麦冬阜苷D和麦冬阜苷D'的检测方法,首先进入前处理步骤SllOO:将生脉注射液用有机溶剂进行萃取；合并有机相，将有机相蒸干得到固体；将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。其中有机溶剂为水饱和正丁醇，萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为1:3，萃取次数为5次。其中所述水饱和正丁醇是通过将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为1:1)，振摇混匀后放置过夜或超声处理lOmin，得到的混合液进行分层后，上层为水饱和的正丁醇溶液，用于药物有效成分提取时增加了正丁醇的溶解度，适用于深度萃取。在前处理步骤结束后进入固相萃取步骤S1200:将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱；上样后用水冲洗，然后用50%的甲醇水溶液冲洗；收集甲醇的水溶液，蒸干得到固体；将固体用甲醇转移定容。其中在上样和洗脱时其流速为0.5ml/min ;上样后用28毫升水进行冲洗,用40毫升50%的甲醇水溶液冲洗。最后进入高效液相检测步骤S1300:将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为50:50 ;高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
[0050]根据本发明实施例1-5,在生脉注射液中麦冬阜苷D和麦冬阜苷D'的色谱峰与相邻色谱峰能得到很好的分离，麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的含量能够更准确的测定，提高了生脉注射液的有效性和可控性。本发明技术方案还具有:准备工作简单、使用设备较少、成本低廉，测定结果准确性高、精密度强的优点。经本发明方法测定过麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'含量的生脉注射液可以保证在临床医学上的量化使用，医生可以准确把握对患者使用生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的量，并对不同患者调整生脉注射液的用量。
[0051] 申请人:对本发明方法的效果和可行性进行了系统的研究和论证。
[0052]1.为验证本发明检测方法的准确性，结合供试品溶液最佳的测定方法对测试方法和效果进行如下描述:
[0053]1.1试剂、仪器和药品
[0054]Agilentl260型高效液相色谱仪；配置四元泵；自动进样器；检测器(AltechELSD2000ES);柱温箱；生脉注射液(大理药业股份有限公司提供)；麦冬皂苷D对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，批号:SM0521KA13，纯度98.2% );麦冬皂苷IV对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，批号:WJ0719KB13，纯度99.4% ) ；0DS小柱(VARIAN，BONDELUT C18);甲醇(分析纯，天津化学试剂二厂)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；注射用水。
[0055]1.2色谱条件
[0056]Ultimate XB-C18 色谱柱(4.6mmX250mm ;5_Micron);柱温 30 °C,流速 1.0ml/11^11，进样量2(^1 ;检测器:检测器(Altech ELSD2000ES)，气体流量2.5L/min，漂逸管温度(900C );流动相，水:乙腈50:50。
[0057]1.3对照品溶液的制备
[0058]分别精密称取麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度为麦冬皂苷D19.8 μ g/ml，麦冬皂苷D' 20.2 μ g/ml对照品溶液。
[0059]I.4本发明供试品溶液的制备
[0060]精密量取生脉注射液16ml置于分液漏斗中，加水饱和正丁醇萃取4次，每次32ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，得到的固体加水溶解，上处理好的ODS小柱，控制上样和洗脱过程流速为0.5ml/分钟，先用20ml水冲洗，再用50%甲醇水溶液30ml冲洗，收集50%甲醇水溶液，水浴蒸干，残渣用甲醇转移至Iml容量瓶，定容至刻度，摇匀即得。
[0061]1.5对比供试品溶液的制备
[0062](I)精密量取生脉注射液16ml，水浴蒸干，固体用甲醇转移至Iml容量瓶，定容至刻度，摇匀即得。
[0063](2)精密量取生脉注射液16ml置于分液漏斗中，加水饱和正丁醇萃取4次，每次32ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇转移至Iml容量瓶，定容至刻度，摇匀即得。
[0064]1.6测定法[0065]分别精密吸取对照品溶液10 μ 1、20 μ I与供试品20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0066]1.7 结果
[0067]见表1和2，生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'含量测定峰面积、分离度及对称因子。
[0068]表1生脉注射液中麦冬皂苷D含量测定峰面积、分离度及对称因子
[0069]
【权利要求】
1.一种生脉注射液中麦冬皂苷D和麦冬皂苷Di的检测方法，该方法包括前处理步骤(SllOO): 将生脉注射液用有机溶剂进行萃取； 合并有机相，将有机相蒸干得到固体； 将蒸干后的固体加少量水至固体完全溶解为止。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述正丁醇为水饱和正丁醇。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在萃取时，生脉注射液与有机溶剂的体积比为 1:1 ?1:4。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，在萃取时萃取次数为2?5次。
6.根据权利要求1所述的检测方法，该方法进一步包括固相萃取步骤(S1200): 将蒸干后的固体加水完全溶解后的液体，上处理好的ODS柱； 上样后用水冲洗，然后用45-65%的甲醇或乙腈水溶液冲洗； 收集甲醇或乙腈的水溶液，蒸干得到固体； 将固体用甲醇或乙腈转移定容。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，上样和洗脱流速小于等于l.0ml/min。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其中，上样后用10-30毫升水进行冲洗，用25-45毫升甲醇或乙腈水溶液冲洗。
9.根据权利要求6所述的检测方法，该方法进一步包括高效液相检测步骤(S1300):将定容溶液在高效液相色谱仪中进行检测，流动相为水:乙腈，比例为45:55-55:45。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中高效液相检测时的色谱柱为反相柱，检测器为蒸发光散射检测器。
【文档编号】G01N30/89GK103926365SQ201410181650
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】黄照昌 申请人:大理药业股份有限公司