HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移试剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移试剂中的应用。具体地，提供了HtrA3免疫组化试剂、包含HtrA3免疫组化试剂的试剂盒在制备预测肺癌术后复发转移率、术后复发转移时间和/或术后生存时间的试剂或试剂盒中的应用。本发明证实了肺癌组织中HtrA3表达显著下降，HtrA3表达强阳性的肺癌患者术后复发转移率显著降低，HtrA3表达越低，术后复发转移时间越早、术后生存时间越短，表明HtrA3可作为肺癌术后复发的生物标记物，为预测NSCLC患者术后复发转移率、术后复发转移时间以及术后生存时间提供了一种切实可行的方法。
【专利说明】HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移试剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床诊断【技术领域】，具体地说，涉及HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移试剂中的应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤之一，并且其病死率在所有肿瘤中位居第一，流行病学研究表明肺癌的5年生存率不足15%。非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)占所有新发肺癌的80%?85%。手术切除是早中期可切除肺癌(即I?IIIA期)治疗效果最好的方法，也是早中期NSCLC的主要治疗手段。然而，I期NSCLC患者术后5年生存率不到70%，而IIIA期患者术后5年生存率不到20%，其原因主要是手术后的复发和转移。预测NSCLC患者术后复发转移的发生，并对高危人群加强随访密度和术后辅助化、放疗强度将有助于早期可切除NSCLC患者的术后个体化管理、降低术后复发转移率以及延长无疾病生存期和总生存期。
[0003]目前在该领域的生物标记物研究仍处于新兴阶段，尚无成熟的可用于NSCLC术后复发转移预测的指标。
[0004]HtrA3 是肺癌组织中高温条件因子A3(high temperature requirement factor A3,HtrA3)，又称妊娠相关丝氨酸蛋白酶，共有2种异构体，即HtrA3长异构体和短异构体，由位于染色体4pl6.1的基因编码而成，2种异构体均有蛋白酶活性。
[0005]目前还未见HtrA3可作为预测肺癌术后复发的生物标记物的相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供HtrA3免疫组化试剂的新用途。
[0007]本发明另一的目的是，提供包含HtrA3免疫组化试剂的试剂盒的新用途。
[0008]为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是:
HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移率、术后复发转移时间和/或术后生存时间的试剂中的应用。
[0009]所述的HtrA3免疫组化试剂包括抗原修复液、封闭液、HtrA3 一抗、HtrA3 二抗、抗体稀释液(用于稀释抗体或洗片子)和显色剂。
[0010]所述的抗原修复液是pH 6.0的枸橼酸缓冲液，所述的封闭液是10%胎牛血清，所述的HtrA3 —抗是鼠抗人HtrA3单克隆抗体，所述的抗体稀释液是磷酸缓冲盐_20%吐温溶液，所述的显色剂是DAB显色剂。
[0011]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
包含HtrA3免疫组化试剂的试剂盒在制备预测肺癌术后复发转移率、术后复发转移时间和/或术后生存时间的试剂或试剂盒中的应用。
[0012]所述的试剂盒还包含石蜡包埋的正常肺组织标本切片，用于作为阳性对照。[0013]需要说明的是，所述的HtrA3免疫组化试剂或包含HtrA3免疫组化试剂的试剂盒还可以进一步包括用于包埋组织和制作切片的试剂，例如载玻片清洁液、多聚赖氨酸(用于处理载玻片，防止脱片)、固定液、蔗糖溶液(组织脱水用)、酒精(用于梯度脱水)、二甲苯(用于透明)、石蜡(作为包埋剂)、活化剂、H2O2 (用于灭活内源性过氧化物酶)和/或封片液。所述的固定液可以是4%多聚甲醛或冷丙酮，所述的活化剂可以是EDTA或Triton X-100，所述的封片液可以是50%缓冲甘油。
[0014]本发明优点在于:
本发明对手术治疗后的广IIIA期NSCLC患者肺癌手术标本中HtrA3做免疫组化检测，然后分析阳性细胞百分比和细胞染色强度并进行打分，再以二者分数的乘积作为总分数，将肺癌组织样本归为阴性(_)、弱阳性(+ )或强阳性(++)，最终研究了 HtrA3表达量与术后复发转移率、术后复发转移时间以及术后生存时间的关系。结果提示肺癌组织HtrA3表达显著下降，HtrA3表达强阳性的肺癌患者术后复发转移率显著降低，HtrA3表达越低，术后复发转移时间越早、术后生存时间越短。本发明提供了证实了 HtrA3可作为肺癌术后复发的生物标记物，为预测NSCLC患者术后复发转移率、术后复发转移时间以及术后生存时间提供了一种切实可行的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]附图1是正常肺组织(Normal)和肺癌组织(Cancer)的HtrA3表达。该图从Normal组选取了 12例，Cancer组选取了 78例作为示范。
[0016]附图2是HtrA3的表达和肺癌术后复发转移时间。DFS:无疾病生存；*p〈0.001。
[0017]附图3是HtrA3的表达和肺癌术后生存曲线分析。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0019]实施例1
本发明的技术路线是:(I)获取肺癌患者手术标本，石蜡包埋，切片；(2)免疫组化方法检测肺癌组织HtrA3表达；(3)显微镜下半定量分析；(4)判定肺癌组织HtrA3表达的临床意义。
[0020]一、方法
对1018例接受手术治疗的ΙΙΙΑ期NSCLC患者进行分析，根据肺癌治疗指南术后无需放疗和化疗的患者共546例，对546例手术标本按照下述方法进行HtrA3检测。按照指南推荐的方案随访5年，记录复发转移及生存情况，分析手术切除的肺癌组织HtrA3的表达和临床转归之间的关系。
[0021]1、采用免疫组化的方法检测肺癌手术标本中HtrA3的表达水平
HtrA3共有2种异构体，即HtrA3长异构体和短异构体，由位于染色体4pl6.1的基因编码而成。由于2种异构体均有生物学功能，因此用于本方法的HtrA3抗体可以同时检出长异构体和短异构体。
[0022]操作步骤:
(O按照常规方法制备手术切除肺癌组织的标本切片:手术切除肺癌组织经常规处理后透蜡2~3次，每次15~30min。之后放入纸盒，将熔蜡倒入盒内，用冷水使熔蜡迅速冷却凝固，30min后取出制成石蜡包埋的肺癌组织块备测。用加热的蜡铲将石蜡包埋的肺癌组织块固着在旋转式切片机上的金属小盘上，并使组织块朝外，用加热刀片将固着的石蜡包埋组织块四周修平，使上下两面修成平行面。摇动切片机转轮，进行切片，将切片投入到48°C的温水浴中，使切片自然展平，然后用涂有5%明胶水溶液的载玻片捞取切片，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥；
(2)枸橼酸缓冲液(pH6.0)处理15分钟；
(3)10%胎牛血清处理20分钟去除非特异性抗体结合；
(4)加上1:200的单克隆鼠抗人HtrA3抗体，室温作用I小时。以不加抗体的空白溶液作为阴性对照；
(5)磷酸缓冲盐-20%吐温溶液洗去抗体溶液；
(6)二抗(Poly-HRP anti mouse IgG (Polink-2 plus Kit,购于 Golden BridenInternational, Inc USA)作用 15 分钟；
(7)加上DAB显色剂染色染色15分钟，并以苏木为对比色；
(8)显微镜下阅片:在400倍放大情况下，每个标本随机抽取15个视野，计算HtrA3阳性的细胞百分比。应用Image J软件，每张切片按照横轴和纵轴分为25个区域，每个区域截取左上角的5个细胞，读取染色灰度，取25个区域的平均读数为该样本的染色强度数值。由两位病理学医生 独立读片判定分数，取平均分为最终结果。
[0023]2、免疫组化结果的判定
(O定性:无HtrA3染色为阴性，有染色为阳性。
[0024](2)半定量:
①阳性细胞百分比的记分如下:无阳性细胞为O分，1%~10%阳性为I分，11%~50%为2分，51%~80%为3分，81%~100%为4分。
[0025]②细胞染色强度的记分如下:假设阴性对照的读数为0，正常滋养细胞(高表达HtrA3的细胞，为本方法的阳性对照)的读数为100，如染色强度读数在0_10记为“无染色O分”，在11-40记为“弱染色阳性I分”，在41-70记为“中等染色阳性2分”，在71-100记为“强染色阳性3分”。
[0026]③再以阳性细胞百分比分数与细胞染色强度分数的乘积进行评分，共0-12分。经上述步骤计算得到为O分的定为阴性，记为(_);1-5分的定为弱阳性，表达为(+ );6分及以上的为强阳性，记为(++)。
[0027]二、结果
对546例接受手术治疗且无需再放疗和化疗的I~ΙΙΙΑ期NSCLC患者的肺癌手术标本中HtrA3做免疫组化检测，统计了 HtrA3表达量与术后5年期间复发转移率、术后复发转移时间、术后生存时间的关系。若随访满5年未出现复发转移者，术后复发转移时间记为60个月；仍存活者，术后生存时间记为60个月。结果如下:
(I)和癌旁正常肺组织相比，肺癌组织HtrA3表达显著降低，HtrA3表达强阳性的肺癌患者术后复发转移率显著降低。
[0028]正常肺组织100%阳性，且均为(++)。546例肺癌手术标本中，(_) 280例，(+ )224例，(++) 42例，表明肺癌组织HtrA3表达显著降低(13分半定量法1.436±0.238 vs8.25±1.36，ρ〈0.0001，图1)。
[0029]HtrA3表达为(++)的患者术后5年复发转移率为0，( + )为31.25%，(-)为30.43%，表明HtrA3为高表达的肺癌患者术后复发转移率显著低于无表达和低表达患者(p=0.0313)。
[0030](2 ) HtrA3表达越低,术后复发转移时间越早。
[0031]对术后复发转移时间统计发现，HtrA3表达越低，复发转移时间越早,其半定量表达值和术后复发转移的时间呈正相关(P=0.0139 )。
[0032]HtrA3 (++)患者平均术后复发转移时间为60.00个月(即在5年随访期内未见复发)，(+ )患者平均为44.66 ±17.75个月，(_)患者则更早，平均为40.43 ±17.36个月，三组间比较p〈0.001 (图2)。
[0033](3 ) HtrA3表达越低,术后生存时间越短。
[0034]对术后生存时间统计发现，HtrA3的半定量表达值和术后生存时间呈正相关(ρ=0.0014)。
[0035]HtrA3(++)的肺癌患者术后生存期平均为60.00个月(即在5年随访期内均存活)，(+ )的患者平均为48.44± 15.50个月，而(-)患者平均为44.40± 13.56个月，三组间比较p〈0.001。图3为不同HtrA3表达水平患者的生存曲线。
[0036]实施例2
采集临床接受手术治疗后，且切缘阴性，根据肺癌治疗指南术后无需放疗和化疗的患者10例，根据实施例1的方法制备肺癌组织切片，进行HtrA3免疫组化检测，最终判定(_)患者6例，(+ )患者3例，(++)患者I例。统计各患者的术后复发转移情况:(++)患者未见复发转移，(+ )患者有I例复发转移，(-)患者有2例复发转移。统计各患者术后复发转移时间以及术后生存时间，结果均在实施例1统计的对应的时间象限内。以上结果表明本发明的方法可准确有效地用于临床诊断。
[0037]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.HtrA3免疫组化试剂在制备预测肺癌术后复发转移率、术后复发转移时间和/或术后生存时间的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的HtrA3免疫组化试剂包括抗原修复液、封闭液、HtrA3 一抗、HtrA3 二抗、抗体稀释液和显色剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液，所述的封闭液是10%胎牛血清，所述的HtrA3 —抗是鼠抗人HtrA3单克隆抗体，所述的抗体稀释液是磷酸缓冲盐-20%吐温溶液，所述的显色剂是DAB显色剂。
4.包含HtrA3免疫组化试剂的试剂盒在制备预测肺癌术后复发转移率、术后复发转移时间和/或术后生存时间的试剂或试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包含石蜡包埋的正常肺组织标本切片。
【文档编号】G01N33/577GK104007263SQ201410216210
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】张静, 冯明祥, 瞿介明, 谭黎杰, 王群, 张新 申请人:复旦大学附属中山医院