猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法。方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件：色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液组成的梯度洗脱液；柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm；(4)测定：高效液相色谱法的特征图谱。
【专利说明】猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱 的猴头菌丝体质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌 丝体质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 药用真菌是指能治疗疾病，具有药用价值的一类真菌，即在菌丝体、子实体、菌核 或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖及糖蛋白、甙类、生物碱、留醇类、蒽醌 类、黄酮类等多类物质，对人体有保健作用，对疾病有预防抑制或治疗作用的真菌。真菌作 为药用在我国已有2000多年的历史，早在《神农本草经》中就记载了茯苓、猪苓等真菌药 物，《本草纲目》中也收载了 20多种生物药用菌，目前我国传统作为药用及试验证实具有药 效的真菌已超过400种，主要集中在担菌亚门和子囊菌亚门。然而日常广泛应用于临床的 却仅有20余种，《中国药典》2010年版明确收录了 7种，这说明对生物药用菌的研究还很不 完善，开发空间较大。现有的研究主要集中于灵芝、虫草等少数几个品种，并且主要针对真 菌多糖作为剂型的研究及开发应用。
[0003] 随着生物科学的发展，真菌、粘菌、地衣等已从植物界中分离出来，单独成立菌物 界。除目前久负盛名的灵芝、茯苓、虫草、槐耳种类外，该界入选中药的品种还较少，但其中 高等真菌数千种，今后无疑将会出现更多此类菌物药，潜力巨大，将会大大丰富中药宝库。 此外，以药用真菌为主体的菌物药，除传统应用子实体外，现代已发展到采用液体（深层） 发酵（应用菌球与发酵液）、固体发酵（应用菌质）等生产工艺。固体发酵产生的普通菌质 其主要药用部位仍只是它所含的菌丝体及其次生物质，但值得注意的是药用菌子实体除可 自身入药外，还可用以进行中药生物工程研究，以研制新药。而发酵工程，尤其是我国特有 的固体发酵工程，它存在的时间已有2000多年历史，通过长时间的固体发酵，产生了生物 代谢产物包括生物酶类物质，其生成的药用菌质比液体发酵药效好。但固体发酵存在缺陷， 容易杂菌污染，现固体发酵技术研究是国内研究热点，主要研究的方向是无菌培养、二次培 养、杂菌抑制、中药材作为营养基实施双向固体发酵技术，突破固体发酵技术的瓶颈，实现 生物药用菌的大规模产业化。
[0004] 猴头菌是一种猴头菌科蘑菇（真菌），在中药用于治疗胃肠道疾病已经有2000年 的历史了，含有的一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透 过血脑屏障修复受损神经组织，猴头菌还有抗溃疡，抗炎，和抗微生物，免疫调节，提高肝功 能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、改善备注循环等作用，包含 猴头菌的医用制剂在中国已广泛使用。
[0005] 猴头菌菌丝体的活性物质中最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的 研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶 血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖 备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《湖 南省中药材标准》2009年版，122-123页记载了猴头菌培养物，本发明所述的猴头菌丝体是 该标准记载的猴头菌培养物。
[0006] 《湖南省中药材标准》2009年版现有质量标准中，仅有显微鉴别、薄层鉴别（5种氨 基酸）、浸出物及含量测定，含量测定只检测多糖及总氮，不能控制产品质量，不能保证产品 疗效。
[0007] 中药品种包括药用菌丝体的鉴定和真伪鉴别常规的方法是根据药材的生药学特 征和理化特性进行，但对外观性状、组织构造以及有机化学成分、理化鉴别相似的品种如 药用真菌一类药材的鉴别、用常规方法就难以区别清楚。从现有的猴头菌内在质量控制现 状来看，还存在很多问题需逐步解决。其中，最突出的问题之一就是整体化学特征的表征。 因此建立准确有效的猴头菌丝体特征图谱，对于长期以来，缺乏系统的整理和归类，导致 猴头菌丝体商品混乱，同名异物、同物异名的现象屡有发生，甚至出现有以假充真，以次 充好的情况具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供猴头菌丝体特征图谱的构建方法，该方法 构建的猴头菌丝体特征图谱可以防伪，因此可应用于鉴别猴头菌丝体。
[0009] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0010] 所述猴头菌丝体特征图谱的构建方法包括如下步骤：
[0011] ⑴参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每ImL含0.02-0. IOmg麦角甾 醇的参照物溶液；
[0012] (2)供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每ImL含0. 02-0. IOg 供试品的供试品溶液；
[0013] (3)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液 相色谱仪，测定，记录35- 40min的色谱图，即得猴头菌丝体特征图谱；
[0014] 所述高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相 A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1%冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式（见表1):
[0015] 表 1
[0016]
【权利要求】
1. 一种猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每ImL含0. 02-0. IOmg麦角甾醇的 参照物溶液； (2) 供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每ImL含0. 02 - 0. IOg供 试品的供试品溶液； (3) 高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色 谱仪，测定，记录35- 40min的色谱图，得猴头菌丝体特征图谱； 其中，步骤（3)所述的高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合 硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1 %冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式： 时间（min) 流动相A (% ) 流动相B (% ) 0 ?20 90 - 100 10 - 0 20 ?35 100 0 柱温为30-40°C ;流速为0. 8-I. 2ml/min ;检测波长为250-260nm，理论板数按麦角 甾醇峰计算> 5000 ; 对多批次猴头菌丝体建立特征图谱，通过分析比较，确定出4个共有特征峰，以与麦 角甾醇参照物对应的峰为参照峰，4个特征峰的相对保留时间分别为：0. 48、0. 81、1. 00和 1. 14,偏差为±10%以内，其中相对保留时间为1.00的峰是与麦角甾醇参照物对应的峰； 特征峰相对峰宽为30,阈值为50,最小相对峰面积为1000,最小相对峰高为100 ;这些共有 特征峰构成了猴头菌丝体的特征，作为猴头菌丝体的标准特征图谱。
2. -种猴头菌丝体的质量检测方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每ImL含0. 02-0. IOmg麦角甾醇的 参照物溶液； (2) 供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每ImL含0. 02 - 0. IOg供 试品的供试品溶液； (3) 高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色 谱仪，测定，记录35- 40min的色谱图，即得猴头菌丝体特征图谱； 所述高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为 甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1 %冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式： 时间（min 流动相A (% 流动相B (% ) 0 ?2 90 - 10 10 - 0 20 ?3 10 0 柱温为30-40°C ;流速为0. 8-I. 2ml/min ;检测波长为250-260nm，理论板数按麦角 甾醇峰计算> 5000 ; (4) 将猴头菌丝体特征图谱与猴头菌丝体标准特征图谱相比对，鉴别猴头菌丝体有效 成分以及判别猴头菌丝体的真伪。
【文档编号】G01N30/02GK104316603SQ201410275434
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】何述金, 周代俊, 常耀台 申请人:湖南新汇制药股份有限公司