一种基于磁性微珠的样品无转移低场nmr稀有细胞快速检测方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学【技术领域】，公开了一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：(1)分别制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(3)使核磁共振造影剂与样本中的稀有细胞进行免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(4)计算弛豫时间改变量，绘制标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的含量。本发明可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液样本中的稀有细胞，且由于两次检测之间没有样品的转移过程可获得较高准确率。
【专利说明】一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检 测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细胞的检测 方法。
【背景技术】
[0002] 稀有细胞是指生物体液样本（包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等）中的一些非 典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾病的病理机制及靶向药物 开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问 题。然而稀有细胞在生物体液中的浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1 :1〇7,用传统 技术无法计数，所以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。
[0003] 由于循环稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在后续的实 验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主要有密度梯度离心法、 膜过滤法和免疫磁性分离技术。
[0004] 密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心 沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带 的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部组分分离，具有良好的分辨率。此法 的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离 具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持 颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；② 需要制备惰性梯度介质溶液。研究中经常利用密度梯度离心的原理，用ficoll液分离和纯 化人或动物外周血单个核细胞（PBMC)。
[0005] 膜过滤方法是根据某些稀有细胞体积大于外周血中粒细胞从而使稀有细胞从外 周血中分离富集出来，然后利用免疫荧光技术对稀有细胞进行鉴别诊断。该方法中，膜过滤 细胞富集过程相对容易，但是并不是所有稀有细胞体积都大于外周血中粒细胞的，很多稀 有细胞的体积和粒细胞大小差不多，甚至比粒细胞体积更小。基于以上的认识，膜过滤方法 被逐渐抛弃。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液 样本中含量较低的稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀 有细胞检测方法，包含以下步骤：
[0008] (1)样本制备
[0009] 将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度 的稀有细胞悬浮液标准样本；
[0010] 对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤 高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；
[0011] (2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测
[0012] 取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混 合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值?\ ;
[0013] 取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混 合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值Τ/ ;
[0014] (3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测
[0015] 取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4?8°C温度下孵育10?15min，使核 磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪 进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T 2 ;
[0016] 取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4?8°C温度下孵育10?15min，使核 磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪 进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T 2' ；
[0017] (4)标准曲线制作与结果得出
[0018] 计算标准样本的弛豫时间改变量Λ Τ2,所述Λ Τ2 = T2-I\，以Λ Τ2为纵坐标，以标 准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；
[0019] 计算待检样本的弛豫时间改变量AT2test，所述AT2test = Τ2' -ΤΛ AT2test不为 ο，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有 细胞的含量。
[0020] 由上述检测步骤可知：本发明利用核磁共振造影剂可以和稀有细胞结合的特性， 运用免疫磁性分离技术，在外加低磁场的作用下通过检验磁珠-细胞悬浮液中水分子的氢 原子信号来定量循环稀有细胞。
[0021] 具体来说，本发明在利用密度梯度离心等方法前期处理细胞样品后，加入偶联有 目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂（即NMR检测反应体系），采用适宜温度孵育 诱导目标稀有细胞和免疫磁性微珠结合。通过NMR检测孵育前后两次弛豫时间变化来定量 地反应体系中目标稀有细胞的数目信息。由于整个检测反应没有任何样品、试剂的加入和 转移，使得体系处于一个稳定状态，排除了两次检测中由于外来物引入导致的假阳性，使得 检测更加准确精密。本发明中所述的目标稀有细胞的最终检出评价方法基于核磁共振技术 的弛豫时间特性参数的变化，所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛 豫时间T。
[0022] 优选地，本发明的检测方法中，步骤（2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性 纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠，且所述的顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠优选为抗 EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体 中的一种或几种。
[0023] 由于磁性微珠很小只有50nm(目前市面上商业化的同类磁珠多为μ m级），对细胞 的功能和活性都不会产生影响，完全满足于稀有细胞检测需求（活细胞且细胞不会受损）。 上述的免疫磁珠将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，从而快速 地实现从混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞的目的，所得稀有细胞可用于计数或其他 方面研究应用。
[0024] 优选地，本发明的检测方法中，所述步骤（2)中，在加入偶联有目标稀有细胞特异 表达抗体的核磁共振造影剂之前，还包括下述步骤：加入偶联有抗CD45的核磁共振造影剂 将非目标细胞进行磁性标记，通过外加磁场方式将上述标记的非目标细胞除去。
[0025] 本发明中免疫磁珠富集方法，除上述
【发明内容】
中步骤（2)所描述的直接加入偶联 有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造影剂与稀有细胞发生靶向 免疫（抗原抗体反应）富集（阳性富集）外，亦可采用阴性+阳性双富集的方法达到目标细 胞磁性富集的目的。具体操作方法即为：在加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁 共振造影剂之前，先利用偶联有抗⑶45的核磁共振造影剂（磁性微珠）将非目标细胞（主 要为上皮细胞中含量较多的白细胞等）进行磁性标记，通过外加磁场方式将白细胞从含有 目标稀有细胞的细胞群混合物中去除掉（阴性标记非目标细胞）；然后，上述获得细胞亚群 混合物，根据亚群标志物选择适宜的偶联有目标细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂（磁 性微珠）进行免疫反应富集，从而获得标记有目标细胞的核磁共振造影剂（阳性标记目标 细胞）。通过上述阴性+阳性双富集的操作方法，可达到排出干扰因素、更精确可靠地实现 目标细胞磁性富集的目的。
[0026] 优选地，本发明的检测方法中，所述步骤（2)中，核磁共振造影剂加入量优选为： 每200个目标稀有细胞中加入1微升核磁共振造影剂。此比例的核磁共振造影剂不但可以 最优化地获得稀有细胞，还能够减少由于核磁共振造影剂加入过多导致的背景增强，影响 检测效果。
[0027] 优选地，本发明的检测方法中，所述步骤（2)和步骤（3)中，控制低场核磁共振分 析仪的磁场强度为20?25MHz，磁体温度为30?35°C，重复时间3?5s。更优选地，控制 低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为20. 18MHz，磁体温度优选为35°C，重复时间优选为 5s〇
[0028] 对上述核磁共振体系磁场强度、磁体温度和重复时间的控制，可使检测更加准确， 可控性更强，且利于平行实验的比较和质控。
[0029] 优选地，本发明的检测方法中，所述步骤（4)中，计算标准样本的弛豫时间改变量 Λ T2和待检样本的弛豫时间改变量△ T2test时，分别取多次测量弛豫时间的平均值进行计 算，从而能使本发明的检测结果更为准确可靠。
[0030] 由上述的论述可知，本发明通过将核磁共振造影剂（如超顺免疫微磁珠）富集和 低场核磁共振仪检测相结合，将稀有细胞的分离和鉴定有机整合在一起，从而快速实现从 混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞。在本发明中利用免疫磁性微珠选择和分离来高度 富集和浓缩体液样品中存在的任何稀有细胞，将所捕获的细胞可检测地标以稀有细胞特异 性表达抗体，且被超顺磁性微珠所包被，以使得能对所捕获的稀有细胞进行鉴别和计数以 及与污染性非靶细胞明确地在核磁共振仪上做区分。由于具有在每7. 5ml体液中可检测到 微量稀有细胞的极强敏感性，是一种具有极强敏感性和特异性的广谱的分离方案。更重要 的，本发明的检测方法由于两次检测弛豫时间之间没有样品的转移过程而避免了假阳性， 该方法可以客观有效地对目标稀有细胞进行检测和定量，相比于传统检测方法，该方法具 有快速、便捷检测的优势，可以用于大规模样本的快速检测。
[0031] 现有的对于稀有细胞的检测方法均涉及到免疫荧光技术，需通过荧光显微镜镜检 来对体液中循环稀有细胞的个数进行定量，普遍具有操作复杂、灵敏性低、检验时间长、价 格高、对操作人员要求高，不易重复的弊端（如i *FISH检测方法成熟的操作人员单次仅能 同时操作6个样本，整个过程耗时2天）。与现有技术相比，本发明将偶联有特异表达抗体 的核磁共振造影剂富集稀有目标细胞技术与具有快速和高灵敏度检测技术的低场核磁共 振仪相结合，从而实现了快速、高效而高灵敏地检测外周血中稀有细胞的目的，具有如下优 点：（1)可使目标稀有细胞直接从生物体液中分离出来，具有简便、快速的特点；（2)和离 心、过滤等方法相比，稀有细胞在磁性分离时受到的剪切力小，可避免细胞的失活；(3)具 有很高的选择性；(4)外加磁场不会对原料液中的离子和带电溶质的运动产生影响；（5)仪 器设备简单，操作费用低。（6)本发明属同一反应体系的两次NMR检测，期间无样品转移从 而避免了外来物质引入导致的假阳性，进一步提高了检测的准确率及便捷性。可适应大规 模高通量检测。本发明的方法可以实现大规模样本的稀有细胞快速检测，无论对于产业化 还是客户体验上都无疑具有重要的意义。该方法为首次被提出，目前未见相关报道，且该方 法适用于对生物体液样本中的各种稀有细胞（包括所有的循环稀有上皮细胞）的检测、鉴 定和定量分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1是本发明的稀有细胞检测方法的流程图；
[0033] 图2是实施例1中以标准样本的弛豫时间改变量Λ T2为纵坐标、以标准样本中的 目标稀有细胞含量为横坐标所制成的标准曲线。
【具体实施方式】
[0034] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。
[0035] 实施例1
[0036] (1)样本制备
[0037] 待检样本制备：
[0038] 1. 1从乳腺癌模型鼠处获得抗凝血样（?10ml)，所述样品包含怀疑含有目标稀 有细胞的混合细胞群。采集的标本应在当天处理！室温避光保持时间不应超过24小时；
[0039] 1.2 Ficoll密度梯度离心法获取候选混合细胞群
[0040] 1)加入适量细胞分层液（Ficoll溶液配制而成）至无菌离心管A底部，然后将上 述抗凝血测试样以PBS液作适当稀释后（2:1)，沿管壁轻轻加在分层液上面，使两者形成一 个清晰的界面。
[0041] 2) 400 Xg水平离心30min (离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以保证形成清 晰的界面）。
[0042] 3)离心后管内最终可见三层液体，上层为黄色液体，中间层为透明液体，底层为 棕红色沉积红细胞（红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集 成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单 个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状），吸取该层细胞递经洗涤高心重悬 (300Xg lOmin洗涤两次）于B管中而获得可用于下一步免疫微磁珠富集的细胞悬浮液样 本。
[0043] 标准样本制备：
[0044] 将纯培养目标稀有细胞，以PBS进行不同梯度稀释（0, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 10 7celΙ/ml)，从而获得系列浓度的目标稀有细胞悬浮液标准样本；
[0045] (2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测
[0046] 将偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的超顺磁免疫磁珠（以20〇Cell/lul磁珠的 比例）加入处理好的标准样本细胞体系中（溶于一定体积的缓冲液中），充分混合均匀（手 动混匀）后立即用低场核磁共振分析仪测定核磁共振的弛豫时间T1 ;
[0047] 取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的超顺磁免疫磁珠，混 合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T/。
[0048] (3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测与结果得出
[0049] 取上述加入超顺磁免疫磁珠的标准样本，4?8°C低温孵育15min，使超顺磁免疫 磁珠与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪测定核磁 共振的弛豫时间T 2 ;
[0050] 取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4?8°C低温下孵育15min，使超顺磁 免疫磁珠与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行 弛豫时间测定，得弛豫时间值T 2'。所述I\&T2'需分别测量三遍并取平均值。
[0051] 计算标准样本的弛豫时间改变量ΛΤ2,所述ΛΤ2 = T2-I\，以弛豫时间改变量 (ΔΤ2)为纵坐标，以标准样本中目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线。
[0052] 上述步骤中使用低场核磁共振分析仪（1. 5T)进行核磁共振检测弛豫时间的仪器 参数如下：磁场强度20. 18MHz，磁体温度35°C，重复时间5s，每次数据测量3次后取平均 值。
[0053] 计算待检样本的弛豫时间改变量Λ T2test，所述Λ T2test = T2' -T/，Λ T2test不为 ο，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有 细胞的含量。
[0054] 系列标准样本中循环稀有细胞定量和鉴定结果统计表：
[0055]
【权利要求】
1. 一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法，其特征在于，包 含以下步骤： (1) 样本制备 将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度的稀 有细胞悬浮液标准样本； 对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤高心 重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本； (2) 亲和富集前核磁共振弛豫时间检测 取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均 匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值?\ ; 取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均 匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值Τ/ ; (3) 亲和富集后核磁共振弛豫时间检测 取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4?8°C温度下孵育10?15min，使核磁共 振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行 弛豫时间测定，得弛豫时间值T2 ; 取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4?8°C温度下孵育10?15min，使核磁共 振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行 弛豫时间测定，得弛豫时间值T2' ； (4) 标准曲线制作与结果得出 计算标准样本的弛豫时间改变量ΔΤ2,所述ΔΤ2 = ?^-?^，以ΔΤ2为纵坐标，以标准样 本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线； 计算待检样本的弛豫时间改变量AT2test，所述AT2test = T2' -T/，AT2test不为0,则 表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有细胞 的含量。
2. 根据权利要求1所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，步骤（2)中所使用的核磁共振造影剂优选为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性 纳米磁珠。
3. 根据权利要求2所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述顺磁性或超顺磁性纳米磁珠优选为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免 疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。
4. 根据权利要求1所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述步骤（2)中，在加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造 影剂之前，还包括下述步骤：加入偶联有抗CD45的核磁共振造影剂将非目标细胞进行磁性 标记，通过外加磁场方式将上述标记的非目标细胞除去。
5. 根据权利要求1所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述步骤（2)中，核磁共振造影剂加入量优选为：每200个目标稀有细胞中 加入1微升核磁共振造影剂。
6. 根据权利要求1所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述步骤（2)和步骤（3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20? 25MHz，磁体温度为30?35°C，重复时间3?5s。
7. 根据权利要求6所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述步骤（2)和步骤（3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为 20. 18MHz，磁体温度优选为35°C，重复时间优选为5s。
8. 根据权利要求1所述的基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方 法，其特征在于，所述步骤（4)中，计算标准样本的弛豫时间改变量ΛΤ2和待检样本的弛豫 时间改变量ΛΤΙμ时，分别取多次测量弛豫时间的平均值进行计算。
【文档编号】G01N24/08GK104155325SQ201410338660
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】张祥林 申请人:张祥林