枳壳中两种黄酮的质量检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种中药枳壳中5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮的质量检测方法，属于生物医药领域，所述质量检测方法为高效液相色谱法，色谱条件和检测条件如下：流动相：甲醇-水，体积比为(45—60)：(40—55)；流速：0.5-1.5mL·min-1；柱温：25.0℃；进样量：10-30μL；检测波长：200—400nm，本发明主要的贡献是建立了枳壳药材中甜橙素即5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮(E)和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮(I)的HPLC含量测定方法，为完善枳壳药材的质量标准以及枳壳的开发利用提供了新的科学依据。
【专利说明】枳壳中两种黄酮的质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及枳壳中5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基 黄酮的质量检测方法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 积壳（Aurantii Fructus)为芸香科柑橘属植物酸橙（Citrus aurantium L.)及 其栽培变种的干燥未成熟果实。枳壳气清香，味苦、微酸，用于治疗食积不化，脏器下垂等症 状，具有理气宽中、行滞消胀等功效，是一种用途广泛的中药材，已被多版中国药典收载。
[0003] 枳壳中的化学成分主要由黄酮、生物碱、香豆素及挥发油等类化合物组成。
[0004] 尽管国内外学者广泛的研究了枳壳的化学成分及其药理作用，但是仍存在尚不明 确的化学成分，枳壳药材的质量标准还有待完善，枳壳的医药用途还有待进一步开发利用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，在对枳壳化学成分进行深入研究的 基础上提供一种能够快速检测枳壳中化学成分含量的RP-HPLC法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] 枳壳中两种黄酮的质量检测方法，所述质量检测方法为高效液相色谱法，色谱条 件和检测条件如下：
[0008] 流动相：甲醇-水，体积比为（45-60) : (40-55)
[0009] 流速：0· 5-1. 5mL · mirf1
[0010] 柱温：25.0 °C
[0011] 进样量：10-30 μ L
[0012] 检测波长：200- 400nm ;
[0013] 供试品溶液的制备：精密称取枳壳药材粉末（50-100目筛）适量，以甲醇作为提取 溶剂，溶剂用量为药材质量的10倍（g/ml)，回流提取2-4次，提取时间均为0. 5-1. 5h，将提 取液合并，过滤，浓缩至干，用色谱甲醇溶解并定容至指定体积，过微孔滤膜，取续滤液作为 供试品溶液；
[0014] 对照品溶液的制备：精密称取对照品5,6, 7, 3' ，4'-五甲氧基黄酮和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮适量，置于容量瓶中，用色谱甲醇定容配制成浓度均为 0· 10-0. 30mg · ml/1的混合对照品溶液。
[0015] 进一步地，上述的质量检测方法，色谱条件和检测条件如下：
[0016] 色谱仪：Agilentl200HPLC，二极管阵列检测器
[0017] 色谱柱：Acchrom Unitary C18Column (4. 6 X 250mm，5 μ m)
[0018] 流动相：甲醇-7jC，体积比为52 :48
[0019] 流速：1. OmL · mirT1
[0020] 柱温：25. 0°C
[0021] 进样量：20 μ L
[0022] 检测波长：310nm。
[0023] 更进一步地，上述的质量检测方法中，
[0024] 供试品溶液的制备：精密称取枳壳药材粉末（80目筛）适量，以甲醇作为提取溶 齐U，溶剂用量为药材质量的1〇倍（g/ml)，回流提取3次，提取时间分别为1. 5h、1. 0h、0. 5h， 将提取液合并，过滤，浓缩至干，用色谱甲醇溶解并定容至指定体积，过〇. 22 μ m微孔滤膜， 取续滤液作为供试品溶液。
[0025] 更进一步地，上述的质量检测方法中，
[0026] 对照品溶液的制备：精密称取对照品5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮2. 64mg和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮2.54mg，置于同一个10mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容配 制成浓度分别为〇. 26mg · ml/1和0. 25mg · ml/1的混合对照品溶液。
[0027] 本发明所用到的对照品5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮和5, 7, 8, 3'，4'-五 甲氧基黄酮均为自制，其中，5,6,7,3' ，4'-五甲氧基黄酮的纯度为98.7%， 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮的纯度为97.9%。5,6,7,3'，4'-五甲氧基黄酮和 5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黄酮的制备方法如下：
[0028] (1)提取
[0029] 取干燥的枳壳药材，粉碎，采用加热回流的方式提取，提取溶剂为乙醇，提取2-4 次，然后合并提取液，过滤，减压浓缩，得到粗提取物；
[0030] (2)分离
[0031] 将粗提取物，用流动相1作为洗脱液进行硅胶柱层析分离，TCL检验流份，收集合 并组分相同的流份，回收溶剂，得到2个部分，其中第二部分含较大量的5, 6, 7, 3'，4'-五 甲氧基黄酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黄酮；
[0032] (3)纯化
[0033] 将步骤（2)所得2个部分分别反复纯化，得到10个化合物，分别是A为柠檬苦 素、B为β-谷甾醇、C为川陈皮素即5,6,7,8,3'，4'-六甲氧基黄酮、D为诺米林、E为 甜橙素即5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮、F为柚皮素即5, 7, 4'-三羟基二氢黄酮、G为 5,7,8,4'-四甲氧基黄酮、Η为3,5,7,8,3'，4'-六甲氧基黄酮、I为5,7,8,3'，4'-五 甲氧基黄酮、J为胡萝卜苷。
[0034] 步骤（1)中，作为提取溶剂的乙醇的体积分数为60% -90%，提取三次的提取溶剂 体积用量均为药材质量的20-30倍（g/ml)，提取时间均为0. 5-2h ;其中，优选地，作为提取 溶剂的乙醇的体积分数为80%，提取三次的提取溶剂体积用量分别为药材质量的10倍、8 倍、8倍（g/ml)，提取时间分别为1. 5h、l. Oh、l. Oh。
[0035] 步骤（3)中的纯化方法选自下列方法中的一种或几种：用流动相1进行硅胶层析 分离、用流动相2作为洗脱液进行0DS柱层析分离、用流动相3进行0DS柱层析分离、用流 动相4进行0DS柱层析分离、用流动相5作为洗脱液进行0DS柱层析分离、用流动相6作为 洗脱液进行硅胶柱层析分离、用流动相8作为洗脱液通过制备色谱仪进行分离、用流动相9 为洗脱液通过制备型高效液相色谱仪进行分离或用甲醇重结晶。
[0036] 上述步骤⑵和⑶中，流动相1是体积比为1 :15的乙酸乙酯-石油醚、流动相 2是体积比为1 :3的水-甲醇、流动相3是体积比为1. 5 :1的水-丙酮、流动相4是体积比 为1. 5 :1的水-甲醇、流动相5是体积比为2 :1的水-丙酮、流动相6是体积比为1. 5 :1二 氯甲烷的-石油醚、流动相8是82%的甲醇-水、流动相9是62%的甲醇-水。
[0037] 本发明利用波谱学手段，结合理化性质并查阅相关文献，共分离鉴定了 10个单体 化合物，其中诺米林即（D)、3, 5, 7, 8, 3'，4'-六甲氧基黄酮（H)和5, 7, 8, 3'，4'-五 甲氧基黄酮（I)是首次从枳壳中分离得到；本发明主要的贡献是建立了枳壳药材中甜橙素 即5,6,7,3'，4'-五甲氧基黄酮（E)和5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮⑴的HPLC含 量测定方法，为完善枳壳药材的质量标准以及枳壳的开发利用提供了新的科学依据。通过 本发明的检测方法，测得枳壳中化合物5,6,7,3'，4'-五甲氧基黄酮（E)的平均含量为 0.161^1_ 1，化合物5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮（1)的平均含量为0.02411^1_1。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0039] 图1是枳壳药材的HPLC图（I )和对照品化合物E和I的HPLC图（II );
[0040] 图2是化合物5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮（E)的紫外谱图；
[0041] 图3是化合物5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黄酮（I)的紫外谱图；
[0042] 图4是两种化合物在不同溶剂中的峰值；
[0043] 图5是不同提取方法时两种化合物的峰值；
[0044] 图6是不同溶剂体积时两种化合物的峰值；
[0045] 图7是两种对照品化合物的线性关系曲线。
【具体实施方式】
[0046] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0047] -、枳壳中化学成分的提取、分离和纯化
[0048] 1、药材与试剂
[0049] 药材
[0050] 化学成分的提取、分离和纯化用药材购于河北安国。
[0051] 试剂
[0052] 乙酸乙酯、石油醚、乙醇、氯仿、二氯甲烷、甲醇、丙酮、无水乙醇，以上试剂均购于 北京化工厂，均为分析纯；色谱甲醇购于Sigma-Aldrich公司。
[0053] 薄层层析展开剂
[0054] 正相薄层层析的展开剂一般为：氯仿-甲醇（15 :1)、石油醚-乙酸乙酯（5 :1);
[0055] 反相薄层层析的展开剂一般为：丙酮-水（3:1)、甲醇-水（5:1)。
[0056] 显色剂
[0057] 5%硫酸-乙醇溶液（105°C加热显色）
[0058] 2、化学成分的提取和分离
[0059] (一）提取
[0060] 取20. 0kg干燥的枳壳药材，粉碎，采用加热回流的方式提取，提取溶剂为80%乙 醇，溶剂的用量分别为药材质量的10倍，8倍，8倍，提取三次，提取时间分别为1. 5h、l. Oh、 1. 〇h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得到粗提取物3. 0kg。
[0061](二）分离、纯化
[0062] 将3. 0kg粗提取物，用流动相1作为洗脱液进行硅胶柱层析分离。TCL检验流份， 收集合并组分相同的流份，回收溶剂，得到第一部分和第二部分，其中第二部分通过TCL检 测含有较大量的5, 6, 7, 3'，4'-五甲氧基黄酮和5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黄酮。
[0063] (1)第一部分的分离
[0064] 将第一部分用流动相1作为洗脱液进行硅胶柱层析分离，将最先得到的含有大量 一个相同流份的部分收集，然后用流动相2作为洗脱液进行0DS柱层析分离，得到化合物 B(900mg)。将最后得到的同时含有大量两个相同流份的部分收集，然后用流动相1进行硅 胶层析分离，得到两个部分，然后再分别用流动相3,流动相4进行0DS柱层析分离，分别得 到化合物 A (298mg)，D (30mg)。
[0065] (2)第二部分的分离
[0066] 将第二部分用流动相1作为洗脱液进行硅胶柱层析分离，按照从色谱柱中流出的 先后顺序，收集得到LfL77个的部分，这7个部分分别含有大量相同的流份。将U用流动 相3作为洗脱液进行0DS柱层析分离，得到化合物C(85mg)。将L 3用流动相5作为洗脱液 进行0DS柱层析分离，得到化合物E (370mg)。将L4用流动相6作为洗脱液进行硅胶柱层析 分离，然后再用流动相7作为洗脱液进行0DS柱层析分离得到化合物F(l. 0g)。将L5用流 动相8作为洗脱液，用制备色谱仪进行分离，得到G(151mg)和H(18mg)两个化合物。将L 6 用流动相9作为洗脱液，用制备型高效液相色谱仪进行分离，得到化合物I (83mg)。将L7用 甲醇等试剂重结晶，得到化合物J(l. 〇g)。
[0067] 二、化学成分的结构鉴定
[0068] 化合物A的结构分析
[0069] 化合物A是白色粉末，易溶于氯仿等有机溶剂，熔点为：297. 5?298. 5°C。Molish 反应呈现阴性，表明该化合物分子中不含糖。
[0070] ESI-MS :m/z471. 2[M+H]+，提示该化合物的分子量是 470. 2。
[0071] 化合物A的13C NMR(CDC13,150MHz)谱共给出26个碳信号，结合DEPT谱可知， 分子中含有4个甲基信号（分别是δ C30. 15, 21. 37, 20. 68,17.61) ;5个亚甲基信号（分 别是 SC65.34,36.38,35.65,30.81，18.90) ;8 个次甲基信号（分别是 SC143.22，14L 11， 109·66,79·14,77·79,60·53,53·85,48·10);其余 9 个为季碳信号（分别是 SC206.09， 169. 08,166. 60,119. 98,80. 29,65. 69,51. 32,45. 93,37. 94) 〇
[0072] 1H NMR(CDC13,600MHz)谱中 δΗ1· 296 (3H，s)，l. 181 (3H，s)，l. 181 (3H，s)， 1. 077 (3H，s) 4组质子信号的存在可进一步证实分子中含有4个甲基。亚甲基信号δ C65. 34 可能与氧相连。在次甲基信号中，SC79. 14, 77. 79, 53. 85可能分别是与氧或者羰基相连的 碳信号。在季碳信号中，SC206. 09是羰基碳信号，δ C169. 08,166. 60可能是酯基上的羰 基碳信号，3 080.29,65.69可能是与氧相连的碳信号，6 045.93可能是与羰基相连的碳信 号。
[0073] 低场端δ C143. 22,141. 11，119. 98,109. 66可能是双键碳信号，结合DEPT谱可知， δ C119. 98是季碳信号，其余均为次甲基信号，由此提示分子中可能含有呋喃环。1H NMR谱 中δ Η7· 417 (1H，s)，7· 402 (1H，s)，6· 343 (1H，s) 3组质子信号的出现，进一步证实分子中含 有呋喃环。
[0074] 根据以上13C NMR和1H NMR信号的分析，初步推断化合物A为柠檬苦素类化合物， 经与文献对照，确认该化合物是朽1檬苦素（Limonin，C 26H3CI08)，结构式如下：
[0075]
【权利要求】
1. 枳壳中两种黄酮的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法为高效液相色谱 法，色谱条件和检测条件如下： 流动相：甲醇-水，体积比为（45-60) : (40-55) 流速：〇· 5-L 5mL · min-1 柱温：25. 0°C 进样量：10-30 μ L 检测波长：200- 400nm ; 供试品溶液的制备：精密称取50-100目枳壳药材粉末适量，以甲醇作为提取溶剂，溶 剂用量为药材质量的10倍（g/ml)，回流提取2-4次，提取时间均为0. 5-1. 5h，将提取液合 并，过滤，浓缩至干，用色谱甲醇溶解并定容至指定体积，过微孔滤膜，取续滤液作为供试品 溶液； 对照品溶液的制备：精密称取对照品5, 6, 7, 3 '，4 '-五甲氧基黄酮和 5,7,8,3'，4'-五甲氧基黄酮适量，置于容量瓶中，用色谱甲醇定容配制成浓度均为 0· 10-0. 30mg · ml/1的混合对照品溶液。
2. 如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，色谱条件和检测条件如下： 色谱仪：Agilentl200HPLC，二极管阵列检测器 色谱柱：Acchrom Unitary C18Column (4.6 X 250mm，5 μ m) 流动相：甲醇-7jC，体积比为52 :48 流速：1. OmL · min-1 柱温：25. 0°C 进样量：20 μ L 检测波长：310nm。
3. 如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于： 供试品溶液的制备：精密称取80目枳壳药材粉末适量，以甲醇作为提取溶剂，溶剂用 量为药材质量的10倍（g/ml)，回流提取3次，提取时间分别为1. 5h、l. 0h、0. 5h，将提取液 合并，过滤，浓缩至干，用色谱甲醇溶解并定容至指定体积，过0. 22 μ m微孔滤膜，取续滤液 作为供试品溶液。
4. 如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于： 对照品溶液的制备：精密称取对照品5,6,7,3'，4'-五甲氧基黄酮2.64mg和 5, 7, 8, 3'，4'-五甲氧基黄酮2. 54mg，置于同一个10mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容配 制成浓度分别为〇. 26mg · ml/1和0. 25mg · ml/1的混合对照品溶液。
【文档编号】G01N30/88GK104280497SQ201410348362
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】金永日, 李绪文, 李敏, 杨洁, 李兰杰, 臧慧明, 陈妍心 申请人:吉林大学