草乌中准噶尔乌头碱的hplc-elsd含量测定方法
【专利摘要】本发明首次从草乌中分离得到准噶尔乌头碱、准噶尔乌头胺、多根乌头碱,并在此的基础上，提供了一种利用HPLC-ELSD法测定草乌中准噶尔乌头碱的含量的方法，色谱条件和检测条件为流动相：乙腈-0.1％三乙胺溶液的体积比为(40-50)：(50-60)；柱温：20-30℃；流速：0.5-1.50mL·min-1；进样量：10-30μL；ELSD检测器的漂移管温度：90-98℃；气体压力：2.00-3.00bar；撞击器呈关闭状态，本发明为完善草乌的质量标准以及车前子的开发利用提供了新的科学依据。
【专利说明】草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用HPLC-ELSD法测定草乌中准噶尔乌头碱的含量的方法，属于 生物医药领域。
【背景技术】
[0002]草乌（Aconiti kusnezoffii Radix)为毛茛科植物北乌头（Aconitum kusnezoffii Reichb.)的千燥块根，民间药用历史悠久，常用于治疗风湿、麻痹、寒疝、疼痛等症状。
[0003] 草乌的主要生物活性成分为二萜类生物碱，它们既是药材中主要的药效成分，同 时又是毒性很强的成分，用药不当易造成中毒现象。因此，为保证用药安全，有必要弄清草 乌中所有生物碱类成分的种类并通过含量测定严格控制药材中此类生物碱成分的含量。到 目前为止人们针对草乌中的乌头碱、次乌头碱和新乌头碱建立了含量测定方法。但还没有 关于草乌中准噶尔乌头碱含量的研究。本发明提供了一种利用HPLC-ELSD法测定草乌中准 噶尔乌头碱的含量的方法，不仅能完善草乌药材质量标准，还能为草乌的安全用药及开发 利用提供科学依据。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种利用HPLC-ELSD法测定草 乌中准噶尔乌头碱的含量的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0006] 草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，其色谱条件和检测条件、供试 品溶液的制备和对照品溶液的制备如下：
[0007] 色谱条件和检测条件：
[0008] 流动相：乙腈-ο. 1 %三乙胺溶液的体积比为（40-50) :(50-60)
[0009] 柱温：20-30 °C
[0010] 流速：0. 5-1. 50mL · min-1
[0011] 进样量：10-30 μ L
[0012] ELSD检测器的漂移管温度：90-981
[0013] 气体压力：2· 00-3. OObar
[0014] 撞击器呈关闭状态；
[0015] 供试品溶液的制备
[0016]精密称取草乌粉末适量，以氨水浸湿，氯仿加热回流提取1_3次，每次加入氨水料 液比（g/ml)为1: (0· 5_2)、氯仿料液比（g/ml)为1: (6_8),提取时间均为〇· 5_2· 0h，过滤， 合并滤液，减压回收溶剂，再用乙腈重新溶解至容量瓶中，定容，摇匀，过滤，取续滤液作为 供试品溶液；
[0017] 对照品溶液的制备
[0018]精密称取化合物准噶尔乌头碱，用乙腈溶解至容量瓶中，定容，摇勻，得 1· 0-2. Omg · mL_1的对照品溶液，冷藏备用。
[0019] 进一步地，草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，色谱条件和检测条 件：
[0020] 流动相：乙腈-0. 1 %三乙胺溶液的体积比为40 :60
[0021] 柱温：25°C
[0022] 流速：1. OmL · mirT1 [0023]进样量：20yL
[0024] ELSD检测器的漂移管温度：96°C
[0025] 气体压力：2· 5〇bar
[0026] 撞击器呈关闭状态。
[0027] 更进一步地，草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，供试品溶液的制 备：
[0028]精密称取草乌粉末3. 〇g，以氨水浸湿，氯仿加热回流提取2次，每次加入氨水 3. OmL、氯仿20mL，提取时间分别为1. 5h、l. 0h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，再用乙腈重 新溶解至10mL容量瓶中，定容，摇匀，过0· 22 μ m微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。 [0029] 更进一步地，草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，对照品溶液的制 备：
[0030] 精密称取化合物准噶尔乌头碱75mg，纯度为99. 5%，用乙腈溶解至50mL容量瓶 中，定容，摇匀，得1. 5mg · ml/1的对照品溶液，置于4°C冷藏备用。
[0031]本发明所用到的对照品准噶尔乌头碱为自制，纯度为99. 5%，准噶尔乌头碱的制 备方法如下：
[0032] (1)提取
[0033]取干燥的草乌，以氯仿-氨水溶液（20:1)为流动相渗漉提取，将提取液浓缩，用 0· 5%的HC1酸化至pH = 1?2,氯仿萃取4次，将水层合并、浓缩，再用〇· 5%的NaOH碱化 至pH = 11?12,氯仿萃取4次，取氯仿层合并、浓缩，得粗提取物。
[0034] (2)分离
[0035]将粗提取物进行硅胶柱层析，以洗脱剂1?5为流动相梯度洗脱，TCL检验,合并组 分相同的流份，回收溶剂，得到三个部分，通过检测TCL其中第一部分含有准噶尔乌头碱， 第二部分含有准噶尔乌头胺，第三部分含有新乌头碱。
[0036] (3)纯化
[0037]将步骤（2)所得三个部分分别反复纯化，最后纯化得到8个化合物，分别是准噶尔 乌头碱、准噶尔乌头胺、化合物塔拉乌头胺、多根乌头碱、3_脱氧乌头碱、乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱。步骤（3)中的采用的纯化方法为娃胶柱层析和/或重结晶。
[0038] I在上述研究的基础上本发明建立了草乌中准噶尔乌头碱的HpLC_ELSD(高效液相 色谱-蒸发激光散射检测器）含量测定方法，测得河北安国产草乌中准噶尔乌头碱的平均 含9238mg .g-1，吉林磐石产草乌中准噶尔乌头碱的平均含量为丨· 319mg ，云南大 理产草乌中准噶尔乌头碱的平均含量为丨_ 768mg · g-i，安徽亳州产草乌中准噶尔乌头碱的 平均含量为1. 635mg .g1。不同产地的草乌药材中准噶尔乌头碱的含量有所差别，但除个别 样品含量低于1. Omg，g-1外（可能存在取样不均等误差因素），其余均在丨.〇mg (〇. 1% ) 以上，属于含量较高的生物碱类成分（2010版药典测得草乌中乌头碱、次乌头碱和新乌头 碱的总量为0. 10%?〇. 50% )。因此，将准噶尔乌头碱的含量测定指标纳入草乌质量标准 之中有利于草乌药材的质量控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0040] 图1是本发明的实施例方式中对照品的色谱图；
[0041] 图2是本发明的实施例方式中药材的色谱图；
[0042] 图3是本发明的实施例方式中不同溶剂的提取结果对比；
[0043] 图4是本发明的实施例方式中加 氨水与不加氨水的提取结果对比；
[0044] 图5是本发明的实施例方式中提取方法不同时的提取结果的对比；
[0045] 图6是本发明的实施方式中提取次数不同时的提取结果的对比；
[0046]图7是本发明的实施方式中提取溶剂体积不同时的提取结果的对比。
[0047] 图8是本发明的实施例1中的线性关系曲线。
【具体实施方式】
[0048]以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0049] 一、草乌化学成分的提取及分离
[0050] 1、实验原料与试剂材料
[0051] 实验原料
[0052] 本实验提取及分离用草乌药材购自河北安国。
[0053] 试剂材料
[0054] 本实验所用试剂均为分析纯，包括石油醚、丙酮、二乙胺、氨水等。石油醚和二乙 胺购自天津天泰精细化学品有限公司；丙酮、乙酸乙酯、氯仿和氨水购自北京化工厂。TLC silica gel60F254 和 TLC silica gel60RP-18F254S 购自 Merck,柱层析娃胶（200-300 目） 购自青岛海洋化工厂。
[0055] 2、化学成分的提取和分离
[0056](一）提取
[0057]取干燥的草乌10kg，粉碎，以氯仿-氨水溶液（20:1)为流动相渗漉提取，将提取液 浓缩，用〇· 5%的HC1酸化至pH = 1?2,氯仿萃取4次，将水层合并、浓缩，再用0. 5%的 NaOH碱化至pH = 11?I2,氯仿萃取4次，取氯仿层合并、浓缩，得粗提取物310g。
[0058](二）分离及纯化
[0059]将粗提取物（310g)进行硅胶柱层析，以洗脱剂1?5为流动相梯度洗脱，薄层色 谱（TLC)检测，合并相同组分，减压回收溶剂，得到三个部分，通过检测τ(χ其中第一部分含 有准噶尔乌头碱，第二部分含有准噶尔乌头胺，第三部分含有新乌头碱。
[ooeo]将第一部分（40g)进行硅胶柱层析，以洗脱剂7?10为流动相梯度洗脱，TLC 检测，合并相同组分，减压回收溶剂，得到A(10g)、B(5g)两个部分。再将A部分进行硅 胶柱层析，以8、9、10为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，析出白 色粉末即为化合物cw-1 (2. 0g);将母液浓缩，进行硅胶柱层析，得到白色粉末即为化合物 Cw_6(860mg)。将B部分进行硅胶柱层析，以8、9、10为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相 同组分，减压回收溶剂，白色沉淀用石油醚和丙酮的混合溶液结晶、重结晶，得到无 色块状 结晶即为化合物cw-3(1. 0g)。将第二部分（35g)进行硅胶柱层析，以洗脱剂6?9为流动 相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，得到C(9.4g)、D(3.0g)两个部分。再 将C部分进行硅胶柱层析，以 6、8、9为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收 溶剂，得到化合物cw-7(白色粉末，560mg)和C-l(5.2g)部分。再将C-1部分进行硅胶柱层 析，以洗脱剂6、8、9为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，白色沉淀 用石油醚和丙酮的混合溶液结晶、重结晶，得到无色粒状结晶即为化合物 cw-5(200mg)。将 D部分进行硅胶柱层析，以洗脱剂6、8、9、10为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减 压回收溶剂，白色沉淀用石油醚和丙酮的混合溶液结晶、重结晶，得到无色块状结晶即为化 合物cw-2(550mg)。将第三部分（42g)进行硅胶柱层析，以洗脱剂6、8、9、11为流动相梯度 洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，得到E(17g)部分。再将E部分进行硅胶柱 层析，以洗脱剂7?10为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，得到化 合物cw-8 (白色粉末，4. 0g)和E-1 (5. 0g)部分。再将E-1部分进行硅胶柱层析，以洗脱剂 7?10为流动相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压回收溶剂，白色沉淀用石油醚和丙 酮的混合溶液结晶、重结晶，得到无色粒状结晶即为化合物cw-4(70mg)。
[0061] 二、化学成分的结构鉴定
[0062] 化合物cw-Ι的结构鉴定
[0063] 化合物(^-1为白色粉末，1114.195.5?196.51：，易溶于氯仿、丙酮，微溶于乙腈， 碘化铋钾反应呈阳性。
[0064] IR(KBr)光谱^δΟΟαιΓ1处强吸收峰的出现说明该化学结构中含羟基，1700CHT1处 强强吸收峰的出现说明该结构中含羰基，l65〇cm_1处吸收峰的出现说明该结构中含双键。 [0065] ESI-MS:m/z358. 3[M+H]+，提示该化合物的分子量为 357. 3。
[0066] 13C-NMR(CDC13, 125MHz)谱共给出22个碳信号，结合DEPT谱可知，化合物cw-Ι有 2 个甲基信号（δ c, ppm:26. 09、13· 62)，8 个亚甲基信号（δ c，ppm: 111. 45、57. 42、50. 95、 38. 16、37· 34、32· 19、31· 66、23· 21)，7 个次甲基信号（δ。，ppm:77. 32、70· 37、66· 03、53· 80、 49. 19、43· 52、35· 22) ,5 个季碳信号（δ c，ppm:210. 03、151· 01、52· 41、50· 00、34· 11)，其中 δ c210. 03ppm处季碳信号为羰基碳信号，δ。151· 01、111· 45ppm处季碳、亚甲基信号分别为 端烯的两个碳信号。
[0067] iH-NMRCCDClw 500MHz)谱：δΗ(ρρπι)〇· 771(3H, s)为甲基的质子信号， SH1.072(3H，t，J = 7.5Hz)为氮乙基上甲基的质子信号，δΗ2.491(2Η，πι)为氮乙基上亚甲 基的质子信号，S A S49 (1Η，s)、4· 365 (1Η，d，J = 8. 0Hz)分别为两个连羟基次甲基碳上的 质子信号，SH5.201、5.293(各lH，s)为端烯的两个质子信号。
[0068] 根据以上13C_NMR和1H-NMR彳目号特征与分布规律，初步推断化合物 cw-1为C2。 二萜生物碱类化合物，经与文献对照，确定化合物cw-1为准噶尔乌头碱（又名宋果灵， S〇ng〇rine，C22H31N03)。经文献检索可知该化合物为首次从草乌中分离得到。其化学结构式 如下所示：
[0069]
【权利要求】
1. 草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，其特征在于， 色谱条件和检测条件： 流动相：乙腈-0. 1%三乙胺水溶液的体积比为（40-50) :(50-60) 柱温：20-30°C 流速：〇· 5_L 50mL · min-1 进样量：10-30 μ L ELSD检测器的漂移管温度：90-98°C 气体压力：2. 00-3. OObar 撞击器呈关闭状态； 供试品溶液的制备： 精密称取草乌粉末适量，以氨水浸湿，氯仿加热回流提取1-3次，每次加入氨水料液比 (g/ml)为1:(0. 5-2)、氯仿料液比（g/ml)为1:(6-8)，提取时间均为0.5-2. 0h，过滤，合并 滤液，减压回收溶剂，用乙腈重新溶解至容量瓶中，定容，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品 溶液； 对照品溶液的制备： 精密称取准噶尔乌头碱，用乙腈溶解至容量瓶中，定容，摇匀，得1. 0-2. Omg · ml/1的对 照品溶液。
2. 如权利要求1所述的草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，其特征在于， 色谱条件和检测条件： 流动相：乙腈-0. 1 %三乙胺溶液的体积比为40 :60 柱温：25°C 流速：1. OmL · min-1 进样量：20 μ L ELSD检测器的漂移管温度：96°C 气体压力：2. 50bar 撞击器呈关闭状态。
3. 如权利要求1或2所述的草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，其特征 在于，供试品溶液的制备： 精密称取草乌粉末3. 0g，以氨水浸湿，氯仿加热回流提取2次，每次加入氨水3. OmL、 氯仿20mL，提取时间分别为1. 5h、l. 0h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，用乙腈重新溶解至 10mL容量瓶中，定容，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
4. 如权利要求1或2所述的草乌中准噶尔乌头碱的HPLC-ELSD含量测定方法，其特征 在于，对照品溶液的制备： 精密称取化合物准噶尔乌头碱75mg，纯度为99. 5 %，用乙腈溶解至50mL容量瓶中，定 容，摇勻，得1. 5mg · ml/1的对照品溶液，置于4°C冷藏备用。
【文档编号】G01N30/88GK104297401SQ201410348232
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】李绪文, 金永日, 彭劭, 陈妍心, 臧慧明, 杨洁, 李兰杰 申请人:吉林大学