基于纳米金聚散淬灭罗丹明b荧光的银离子检测方法
【专利摘要】一种利用银离子特异性DNA调节纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光检测银的方法，通过将银离子特异性DNA和纳米金混合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在570mn波长处的荧光信号的变化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测。本发明不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，可用于检测饮用水中的银含量是否超标。
【专利说明】基于纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光的银离子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种水质安全【技术领域】的方法，具体是一种利用银离子特异性 DNA调节纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光检测银的方法。
【背景技术】
[0002] 随着现代化工业的发展，银在汽车工业、电子工业、制药业和成像工业等方面有诸 多应用，由此引起的银离子污染也越来越严重。尽管银离子是一种非生物累积性毒素，但其 进入人体会抑制含巯基类酶的活性，与胺类、咪唑类以及含羧基的多种代谢物结合，取代骨 骼中羟磷灰石内诸如钙离子、铜离子等必须金属离子，导致人体银中毒，引发头疼、皮肤刺 激、胃疼、器官水肿甚至是死亡。鉴于此，世界卫生组织（WHO)和美国环保署（EPA)将饮用 水中银离子的最高允许值定为50ppb (约460nM)。因此，建立高灵敏度、高选择性的银离子 检测方法具有重要的现实意义。
[0003] 传统的银离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体 质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中 需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实 时原位检测的需要。新型的银离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术，其中功 能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。
[0004] 最常见的用于银检测的功能核酸是银离子特异性DNA，其检测银的原理是其DNA 链中富含胞嘧啶C，银离子可以特异性地与之作用，形成类似发卡结构的C - Ag+ - C碱基错 配。通过将DNA捕获银离子形成C - Ag+ - C碱基错配的过程转化成比色、散射、化学发光和 荧光等信号而达到检测银离子目的。
[0005] 在诸多信号表达方法中，荧光法因其简便、快速和灵敏等优点而占大多数，但荧光 法检测银离子存在的问题是银离子属于所谓的"沉默离子（silent ions)"，即其本身具有 一定淬灭荧光的能力。因而现有的荧光法检测银离子的报道中，"on - off "类型，S卩加入银 离子后荧光变弱居多。相比"on - off"类型，人们普遍认为"off - on"类型更值得研发推 广，因而开发基于银离子特异性DNA的"off - on"类型荧光法检测银离子很有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明针对性克服现有利用功能核酸检测银离子的荧光方法大多属于"on - off " 类型，涉及复杂的反应等缺陷，提出一种基于纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光的银离子检测 方法，利用银离子特异性DNA(名为Ag - CC)、纳米金以及罗丹明B(简称RB)荧光法进行检 测，不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，可用于检测饮用水中的银含 量是否超标。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将银离子特异性DNA和纳米金混 合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在570nm波长处的荧光信号的变 化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测。
[0008] 步骤1)制备由银离子特异性DNA组成的检测体系混合液：在2mL刻度离心管中， 加入7. 5 μ L浓度为1 μ Μ的Ag - CC母液，补加去超纯水至170 μ L，充分混匀后再将离心管 置于25°C条件下备用。
[0009] 所述的银离子特异性DNA为Ag - CC，其序列如Seq ID No. 1所示。
[0010] 步骤2)制备已知银浓度的检测体系：取若干支包含按步骤1)方法制备的检测 体系混合液的离心管，分别加入10 μ L不同的银离子浓度标准液作为绘制标准曲线用的 标准溶液以及加入10 μ L超纯水作为空白对照液，使得整个检测体系中的银含量维持在 1500ppb以下，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，加入250 μ L纳米金， 充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，加入30μ L,2M的NaN03以及40μ L, 100 μ Μ的RB，25°C条件下避光孵育lOmin后，留作以下测定用。
[0011] 步骤3)分别取500 μ L步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，置于石 英荧光用比色皿中，用荧光光度计进行扫描测定信号并绘制标准曲线。
[0012] 步骤4)制备样品检测体系：取10yL待测水样，加入到步骤1)方法制备的检测体 系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，加入250 μ L纳米金并 补加超纯水使得混合液总体积为430 μ L ;经充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育 lOmin后，加入30 μ L，2M的NaN03以及40 μ L，100 μ Μ的RB，25°C条件下避光孵育lOmin后， 用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲线得到银离子含量。
[0013] 所述的扫描所采用的激发光狭缝为l〇nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为 520nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。
[0014] 所述的测定信号是指：银和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和匕，计算增强 的荧光强度AFiF-h;以不同的银离子浓度（C Ag)与对应的增强的荧光强度AF作图，绘 制标准曲线。
[0015] 所述的绘制标准曲线是指：以银离子浓度（CAg)作横轴，对应的增强的荧光强度 AF作纵轴，用Origin pro 8. 0软件拟合得到DoseResp拟合曲线，曲线方程为：
【权利要求】
1. 一种基于纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光的银离子检测方法，其特征在于，通过将 银离子特异性DNA和纳米金混合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在 570nm波长处的荧光信号的变化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测； 所述的银离子特异性DNA为Ag - CC，其序列如Seq ID No. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法具体包括以下步骤： 步骤1)制备由银离子特异性DNA组成的检测体系混合液； 步骤2)制备已知银浓度的检测体系： 步骤3)分别取步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，用荧光光度计进行扫 描测定信号并绘制标准曲线； 步骤4)制备样品检测体系，用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲线 得到银离子含量。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤1具体是指：在2mL刻度离心管 中，加入7. 5 μ L浓度为1 μ Μ的Ag -CC母液，补加去超纯水至170 μ L，充分混匀后再将离心 管置于25°C条件下备用。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤2具体是指：取若干支包含按步 骤1)方法制备的检测体系混合液的离心管，分别加入10 μ L不同的银离子浓度标准液作为 绘制标准曲线用的标准溶液以及加入1〇μ L超纯水作为空白对照液，使得整个检测体系中 的银含量维持在1500ppb以下，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，力口 入250 μ L纳米金，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，加入30 μ L，2M的 NaN03以及40μ L，ΙΟΟμΜ的RB，25°C条件下避光孵育lOmin后，留作以下测定用。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤4具体是指：取10 μ L待测水样， 加入到步骤1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵 育lOmin后，加入250 μ L纳米金并补加超纯水使得混合液总体积为430 μ L ;经充分混匀后 再将离心管置于25°C条件下孵育lOmin后，加入30 μ L, 2Μ的NaN03以及40 μ L, 100 μ Μ的 RB，25°C条件下避光孵育lOmin后用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲 线得到银离子含量。
6. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征是，所述的扫描所采用的激发光狭缝为 l〇nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为520nm条件下扫描，获得其突光信号光谱。
7. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征是，所述的测定信号是指：银和空白对照液 的荧光光谱信号分别为F和己，计算增强的荧光强度AF = F -匕；以不同的银离子浓度CAg 与对应的增强的荧光强度AF作图，绘制标准曲线。
8. 根据权利要求2或4或5所述的方法，其特征是，所述的绘制标准曲线是指：以银 离子浓度CAg作横轴，对应的增强的荧光强度Λ F作纵轴，用Origin pro 8. 0软件拟合得 到DoseResp拟合曲线，曲线方程为：
其中：A1 = - 90. 86, A2 = 3945. 64, LOG xQ = 718. 46, p = 0· 00227。
【文档编号】G01N21/64GK104215618SQ201410487008
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】周培, 詹深山, 徐涵楚, 詹学佳, 王鲁梅, 吕晶 申请人:上海交通大学