一种蜜环菌浓缩液的质量控制方法
【专利摘要】本发明涉及一种蜜环菌浓缩液的质量控制方法，包括性状检查、化学类成分鉴别、密度、pH值、水中不溶物、微生物限度，以及肽含量测定，同时采用更高浓缩状态进行储藏运输，该方法经复核验证能够从多方面评价蜜环菌浓缩液的质量。
【专利说明】一种蜜环菌浓缩液的质量控制方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及蜜环菌浓缩液的质量控制方法。
【背景技术】：
[0002] 蜜环菌浓缩液为白蘑科真菌蜜环菌Armillariamellea(Vahl.exFr)Quel.人工 液体发酵的培养液，经浓缩滤过的液体。近年来经大量的研究实验证明，蜜环菌的菌丝体和 发酵液都具有与天麻相似的药理作用和临床疗效（郭顺星，等.蜜环菌的化学成分及应用 研究[J].微生物学通报，1996. 23 (4):239.)。药理研究表明，蜜环菌浓缩液主要具有镇静 催眠、抗惊厥、保护心脑血管、改善眩晕综合症、增强免疫等作用。蜜环菌浓缩液为中成药脑 心舒口服液中主要原料，其为白蘑科真菌蜜环菌Armillariamellea(Vahl.exFr)Quel.人 工液体发酵的培养液，经浓缩滤过的液体，在市场上可以买到，在《中药大辞典》榛磨项下有 具体描述，比如如下的生产方法：
[0003] 1、菌种培养
[0004] 1. 1、母种（试管种）培养
[0005]取蜜环菌Armillariamellea(Vahl.exFr.)Quel.保藏菌株，用PDA培养基（马 铃薯200g煮熟过滤，蔗糖20g，硫酸镁0. 75g，磷酸二氢钾0. 75g，琼脂20g，配置1000ml)培 养。灭菌条件：110°C，0. 1MP，灭菌30分钟。培养温度26-28°C，培养周期7-10天。
[0006] 1. 2、摇床扩大培养（液体菌种培养）
[0007] 取培养好的母种（试管种），转接于三角瓶液体摇床培养，培养基为PDA培养基不 加琼脂，500ml三角瓶装量250-300ml。接种（母种）后于摇床上llOn/m振荡培养。灭菌 条件：110°C，0. 1MP，灭菌30分钟。培养温度26-28°C，培养周期3-4天。
[0008] 1. 3、种子罐培养
[0009] 培养好的三角瓶液体菌种转接于种子罐进行发酵培养，培养基同液体菌种培养 基。灭菌条件：110°c，0. 1MP，2小时。培养温度26-28°C，培养周期4-6天。
[0010] 1.4、发酵
[0011] 培养基：麦麸200g，玉米粉10g，蔗糖20g，酵母粉10g，水lOOOg。将60%体积的 培养基置发酵罐中，灭菌，将种子罐菌种转接于发酵罐内进行发酵培养，待发酵液变为紫褐 色，由稠变稀，部分菌丝开始自溶，菌丝颗粒变碎，pH值降至5. 2 -5. 6,罐内亮度开始减弱， 即可出罐。灭菌条件：121°C，0. 1MP，2小时。培养温度26-28°C，培养周期6-7天。
[0012] 2、滤过
[0013] 培养好的发酵液，板框压滤。
[0014] 3、浓缩
[0015] 将上述滤液置真空减压浓缩罐内，减压浓缩至相对密度1. 18 (20°C)。
[0016] 但蜜环菌浓缩液作为药物使用目前尚无法定标准。
[0017] 蜜环菌浓缩液属于成分复杂的复合成分原料，其检测方法的准确性，精密性，方便 性是非常重要的，为此，本发明人进行了大量的研究，最终发现一种有效的蜜环菌浓缩液的 检测方法。
【发明内容】
：
[0018] 本发明的目的在于提供蜜环菌浓缩液的质量控制方法，以解决目前没有标准的状 况。
[0019] 为此，本发明提供一种有效的蜜环菌浓缩液的检测方法，所述方法包括以下步 骤：
[0020] 蜜环菌浓缩液性状的观察，蜜环菌浓缩液的鉴别，蜜环菌浓缩液的检查，对蜜环菌 浓缩液含有的成分进行含量测定，因此，本发明的方法主要的步骤是：
[0021] 蜜环菌浓缩液性状的观察，步骤是：
[0022] 本品为棕黄至棕褐色澄清液体，味微酸、苦、微甜。
[0023] 蜜环菌浓缩液的鉴别，步骤是：
[0024] 鉴别1 :取本品数滴于滤纸上，喷以茚三酮试液，烘干后显蓝紫色或紫红色斑点。
[0025] 鉴别2 :取本品约I.0ml，加水10ml，摇匀，取2ml，加5%α-萘酚乙醇液数滴，摇 匀，沿壁加入浓硫酸lml，在两液面交界处显紫红色环。
[0026] 鉴别3:取本品约15ml，置分液漏斗中，加乙醚分两次萃取，合并萃取液，挥干。残 渣加乙醇Iml使溶解，做为供试品溶液。取5-羟甲基糖醛对照品适量，制成lmg/ml的对照 品溶液，以上两溶液各IOul分别点于同一硅胶GF254板上，以石油醚（60-90°C)_乙酸乙 酯-氯仿（2 :2 :1)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视。供试品色谱中，在与对照 品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。
[0027] 蜜环菌浓缩液的检查，步骤是：
[0028] 缩液的检查，步骤是：
[0029] 相对密度：具体操作均符合《中国药典》通则项下相关要求，本品的相对密度应为 1. 030 ?1. 035(20?)，
[0030]pH值：具体操作符合《中国药典》2010年版一部附录WG，pH值应为4. 0?5. 5，
[0031] 水中不溶物：精密量取本品10ml，置恒重的离心管中，以4000rpm的转速离心15 分钟后，弃去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中国药典》201年版一部附录），减失重 量大于0. 5%，不得过3. 0%，微生物限度：照中国药典2010年版一部附录XIIIC检查，应符 合规定。
[0032] 对蜜环菌浓缩液含有的成分进行含量测定，步骤是：
[0033] 以牛血清白蛋白为对照，测定样品中肽的含量。测定方法为：
[0034] 对照品溶液制备：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0.3mg的溶液，即得。
[0035]标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.01111(0号管）、0.11111、0.21111、0.41111、 0. 6ml、0. 8ml、I. 0ml，分别置具塞试管中，各加水至I. 0ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇匀，室 温放置10分钟后，加入福林试液（1 - 16)4. 0ml，（福林试液（1 - 16)S卩：取福林试液储备 液Iml加水至16ml制成的溶液，其中所述福林试液储备液配制方法如下：取钨酸钠10g、 钥酸钠2. 5g，加水70ml、85 %磷酸5ml与盐酸10ml，置200ml烧瓶中，缓缓加热回流10小 时，放冷，再加硫酸锂15g、水5ml和溴滴定液1滴煮沸约15分钟，至溴除尽，放冷至室温， 加水使成l〇〇ml。滤过,滤液作为贮备液。置棕色瓶中，于冰箱中保存），摇匀，于55°C水浴 中保温5分钟，取出，放冷至室温。以O管为空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录V A)，在650nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0036]测定法：精密称取本品1. 0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得稀 释液，精密量取稀释液I. 〇ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林 试液（取储备液1 - 16,储备液制法同前）4. 0ml，摇匀，于55°C水浴中保温5分钟，取出， 放冷至室温，以0管为空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录VA)，在650nm波长处 测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中含牛血清白蛋白的重量，计算，即得。
[0037] 本品含肽以牛血清白蛋白计，不得少于0. 2%。
[0038] 本发明进一步提供一种蜜环菌浓缩液的质量控制方法，即对蜜环菌浓缩液的质量 进行检测，制定质量标准，并使用本发明方法进行检测。上述的一种蜜环菌浓缩液的质量 控制方法，其特征在于，鉴别的多糖、氨基酸、5_羟甲基糠醛的方法可以采取液相、薄层、理 化反应方法。上述的一种蜜环菌浓缩液的质量控制方法，其特征在于，待检样品取样量为 2. 5g〇
[0039] 本发明蜜环菌浓缩液的测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
[0040] 1、性状：根据长期生产样品的外观、色泽、气味的实际情况，性状规定为"本品为棕 黄至棕褐色澄清液体，味微酸、苦、微甜"。
[0041] 2、鉴别项，主要包括3个鉴别内容，其中，
[0042] 鉴别（1)取本品数滴于滤纸上，喷以茚三酮试液，烘干后显蓝紫色或紫红色斑点。 此鉴别为氨基酸的化学反应，茚三酮反应。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形 成C02、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同 另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
[0043] 鉴别⑵取本品约I. 0ml，加水10ml，摇匀，取2ml，加5%α-萘酚乙醇液数滴，摇 匀，沿壁加入浓硫酸lml，在两液面交界处显紫红色环。此鉴别为多糖的化学反应鉴别。它 的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α-萘酚作用，形成红紫色 复合物。由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。此反应就 是糖的Molisch(莫立许）反应（α-萘酚反应）。此方法是鉴定糖类最常用的颜色反应。
[0044] 鉴别⑶取本品约15ml，置分液漏斗中，加乙醚分两次萃取，合并萃取液，挥干。残 渣加乙醇Iml使溶解，做为供试品溶液。取5-羟甲基糖醛对照品适量，制成lmg/ml的对照 品溶液，以上两溶液各IOul分别点于同一硅胶GF254板上，以石油醚（60-90°C)_乙酸乙 酯-氯仿（2:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视。供试品色谱中，在与对照 品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。
[0045] 3、检查项，主要包括：相对密度、pH值、水中不溶物、微生物限度等实验。具体操作 均应符合《中国药典》通则项下相关要求。
[0046] 相对密度：本品的相对密度（中国药典2010年版一部，附录WA)，应为L030? I. 035(20〇C) 〇
[0047] 表1近3年样品相对密度检验结果
[0048]
【权利要求】
1. 一种蜜环菌浓缩液的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：蜜环菌浓缩 液性状的观察，蜜环菌浓缩液的鉴别，蜜环菌浓缩液的检查，对蜜环菌浓缩液含有的成分进 行含量测定。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，蜜环菌浓缩液性状的观察，步 骤是：本品为棕黄至棕褐色澄清液体，味微酸、苦、微甜。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，蜜环菌浓缩液的鉴别，步骤是： 鉴别1 :取本品数滴于滤纸上，喷以茚三酮试液，烘干后显蓝紫色或紫红色斑点， 鉴别2 :取本品约I. Oml，加水10ml，摇匀，取2ml，加5% a -萘酚乙醇液数滴，摇匀，沿 壁加入浓硫酸Iml,在两液面交界处显紫红色环， 鉴别3 :取本品约15ml，置分液漏斗中，加乙醚分两次萃取，合并萃取液，挥干，残渣加 乙醇Iml使溶解，做为供试品溶液，取5-羟甲基糖醛对照品适量，制成lmg/ml的对照品溶 液，以上两溶液各IOul分别点于同一硅胶GF254板上，以石油醚（60-90°C )_乙酸乙酯-氯 仿（2 :2 :1)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱 相应的位置上显相同颜色的斑点。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，蜜环菌浓缩液的检查，步骤是： 相对密度：具体操作均符合《中国药典》通则项下相关要求，本品的相对密度应为 1. 030 ?1. 035(201：)， pH值：具体操作符合《中国药典》2010年版一部附录W G，pH值应为4. 0?5. 5， 水中不溶物：精密量取本品l〇ml，置恒重的离心管中，以4000rpm的转速离心15分钟 后，弃去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中国药典》201年版一部附录），减失重量大 于0. 5%，不得过3. 0%，微生物限度：照中国药典2010年版一部附录XIII C检查，应符合规 定。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，对蜜环菌浓缩液含有的成分进 行含量测定，步骤是： 对照品溶液制备：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0. 3mg的溶液，即得， 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0. Oml (0号管）、0. lml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、 0. 8ml、I. 0ml，分别置具塞试管中，各加水至I. 0ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇匀，室温放置 10分钟后，加入福林试液（取储备液1 - 16) 4. 0ml，摇匀，于55°C水浴中保温5分钟，取出， 放冷至室温，以0管为空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录V A)，在650nm波长处测 定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线， 测定法：精密称取本品1.0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得稀释 液，精密量取稀释液I. 〇ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇勻，室温放置10分钟后，加入福林试 液（取储备液1 - 16) 4. Oml，摇匀，于55°C水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温，以0管为 空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录V A)，在650nm波长处测定吸收度，从标准曲线 上读出供试品溶液中含牛血清白蛋白的重量，计算，即得。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，鉴别的多糖、氨基酸、5-羟甲基 糠醛的方法可以采取液相、薄层、理化反应方法。
7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，待检样品取样量为2. 5g。
8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中， 蜜环菌浓缩液性状的观察，步骤是：本品为棕黄至棕褐色澄清液体，味微酸、苦、微甜； 其中，蜜环菌浓缩液的鉴别，步骤是： 鉴别1:取本品数滴于滤纸上，喷以茚三酮试液，烘干后显蓝紫色或紫红色斑点， 鉴别2 :取本品约1.0ml，加水10ml，摇匀，取2ml，加5% a-萘酚乙醇液数滴，摇匀，沿 壁加入浓硫酸Iml,在两液面交界处显紫红色环， 鉴别3 :取本品约15ml，置分液漏斗中，加乙醚分两次萃取，合并萃取液，挥干，残渣加 乙醇Iml使溶解，做为供试品溶液，取5-羟甲基糖醛对照品适量，制成lmg/ml的对照品溶 液，以上两溶液各IOul分别点于同一硅胶GF254板上，以石油醚（60-90°C )_乙酸乙酯-氯 仿（2 :2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱 相应的位置上显相同颜色的斑点； 其中，蜜环菌浓缩液的检查，步骤是： 相对密度：具体操作均符合《中国药典》通则项下相关要求，本品的相对密度应为 1. 030 ?1. 035(201：)， pH值：具体操作符合《中国药典》2010年版一部附录W G，pH值应为4. 0?5. 5， 水中不溶物：精密量取本品l〇ml，置恒重的离心管中，以4000rpm的转速离心15分钟 后，弃去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中国药典》201年版一部附录），减失重量大 于0. 5%，不得过3. 0%，微生物限度：照中国药典2010年版一部附录XIII C检查，应符合规 定； 其中，对蜜环菌浓缩液含有的成分进行含量测定，步骤是： 对照品溶液制备：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0. 3mg的溶液，即得， 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0. Oml (0号管）、0. lml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、 0. 8ml、l. 0ml，分别置具塞试管中，各加水至I. 0ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇匀，室温放置 10分钟后，加入福林试液（取储备液1 - 16) 4. 0ml，摇匀，于55°C水浴中保温5分钟，取出， 放冷至室温，以0管为空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录V A)，在650nm波长处测 定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线， 测定法：精密称取本品约1. 0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得稀释 液，精密量取稀释液I. 〇ml，再加碱性铜试液I. 0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林试 液（取储备液1 - 16) 4. Oml，摇匀，于55°C水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温，以0管为 空白，照分光光度法（《中国药典》一部附录V A)，在650nm波长处测定吸收度，从标准曲线 上读出供试品溶液中含牛血清白蛋白的重量，计算，即得。
【文档编号】G01N33/68GK104316699SQ201410502761
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】周美娟, 胡浩武, 杜育华, 袁桂平, 梅玲华, 耿炤, 姜伟 申请人:江西汇仁药业有限公司, 上海中创医药科技有限公司