一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的pr-hplc测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法，该方法色谱条件：C18或C8反相色谱柱，柱温：37℃，检测波长248nm，流速0.8ml/min梯度洗脱，流动相A为5.0mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水溶液，洗脱液流速为0min100%A，0.5min98.5%A,10min90%A,15min67%A,20min20%A,25min0%A；对照品溶液及供试品溶液的配制；精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入反相液相色谱仪，进行反相液相色谱测定分析。该测定方法操作简单快速，无需衍生剂，且稳定性强、重现性好，能更好地对地龙注射液的有效成分及质量进行控制的反相高效液相色谱测定方法。
【专利说明】-种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测 定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及仪器分析【技术领域】，具体涉及一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸 含量的PR-HPLC测定方法。
【背景技术】
[0002] 地龙注射液，平喘止咳。用于支气管哮喘所致的咳嗽、喘息。
[0003] 早期对于地龙注射液含量测定由3部分组成，分别为氮测定法测总氮量、滴定法 测氨基氮及薄层色谱法测缬氨酸含量，但该测定方法专属性不强、且重现性不高，无法对地 龙注射液的有效成分及质量进行控制。
[0004] 黄璐敏在《中国药师》2010年第13卷第11期的"HPLC法测定地龙注射液中主要 氨基酸的含量"公开了一种建立测定地龙注射液中主要氨基酸含量的方法，该方法以6-氨 基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC)为衍生剂，与地龙注射液中的游离氨基酸柱前 定量颜色，用HPLC法测定衍生物含量。虽然丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸 在各自浓度范围内线性关系良好，平均回收率102. 6~104. 9%，RSD 0. 3、. 9%，但其需要使用 到衍生剂进行衍生测定，操作复杂。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种操作简单快速，无需衍生剂，且 其稳定性强、重现性好，能更好地对地龙注射液的有效成分及质量进行控制的反相高效液 相色谱测定方法。
[0006] 本发明提供了一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC (反相高效 液相色谱法）测定方法，包含如下步骤： 51、 色谱条件：C18或C8反相色谱柱，柱温：37°C，检测波长248nm，流速0. 8ml/min梯 度洗脱，流动相A为5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水 溶液，洗脱液流速为 Omin 100%A，0.5min 98. 5%A, IOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 对照品溶液的配制：精密称取丙氨酸对照品90. 79mg、缴氨酸对照品39. 94mg、盐 酸赖氨酸对照品32. 53mg、异亮氨酸对照品30. 87mg、亮氨酸对照品60. 28mg，另取酪氨酸 I. 3g，加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，用水定容于容量瓶，得对照品溶液； 53、 供试品溶液的配制：取地龙注射液五支，混匀，用水定容于容量瓶，得供试品溶液； 54、 测定：精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1注入反相液相色谱仪，进行反相 液相色谱测定分析。
[0007] 优选地，步骤S2具体包括：精密称取105°C干燥3h的丙氨酸对照品90. 79mg、缬 氨酸对照品39. 94mg、盐酸赖氨酸对照品32. 53mg、异亮氨酸对照品30. 87mg、亮氨酸对照品 60. 28mg，另取酪氨酸I. 3g，置于同一 IOOml量瓶中加少量0. lmol/L盐酸溶液溶解，加水稀 释至刻度，且再精密量取5ml，置IOOml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
[0008] 更优选地,步骤S3具体包括：取地龙注射液五支,混勻,精密量取5ml,置IOOml量 瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下： (1) 操作分析步骤简单快速，无需采用衍生剂进行衍生，减少试剂的使用，有利于环保 节约； (2) 专属性强，地龙注射液广地龙阴性制剂色谱在相应氨基酸对照品色谱相应位置上 无干扰； (3) 回收率高，加入氨基酸母液，丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的平均 回收率分别为 106. 7%，105. 0%，108. 7%，104. 6%，105. 4% ; (4) 重复性高、精密度好，对同一批号地龙注射液制备6份供试品溶液测定，其RSD均小 于1. 5%，对同一批号地龙注射液连续5次测定，其RSD均小于0. 7%。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属 于本发明保护的范围。
[0011] 仪器与试药 仪器：Waters e2695 高效液相色谱仪，Waters 2489UV/Visible 检测器，Empowe 3 工 作站；瑞士 METTLER AE-240电子天平。色谱柱：Waters Symmetry C18或C8反相色谱柱， 5 μ m，4. 6X 150mm (优选 C18 反相色谱柱：No :WAT045905, No :WAT054448) 试药：地龙注射液(博罗先锋药业有限公司生产批号060501等20批);地龙注射液广地 龙阴性制剂（自制）；丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸对照品（中国药品生物 制品检定所，624-200104);乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
[0012] 实施例1地龙注射液氨基酸含量测定 测定地龙注射液中五种氨基酸的含量，五种氨基酸分别为丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸。
[0013] 测定步骤为： 51、 色谱条件：C18反相色谱柱，柱温：37°C，检测波长248nm，流速0.8ml/min梯度洗 脱，流动相A为5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水溶 液，洗脱液流速为 Omin 100%A，0.5min 98. 5%A, IOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 对照品溶液的配制：精密称取105°C干燥3h的丙氨酸对照品90. 79mg、缬氨酸对照 品39. 94mg、盐酸赖氨酸对照品32. 53mg、异亮氨酸对照品30. 87mg、亮氨酸对照品60. 28mg, 另取酪氨酸I. 3g，置于同一 IOOml量瓶中加少量0. lmol/L盐酸溶液溶解，加水稀释至刻度， 且再精密量取5ml，置IOOrnl量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液； 53、 供试品溶液的配制：取地龙注射液五支，混匀，精密量取5ml，置IOOrnl量瓶中，加水 稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液； S4、测定：精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1注入反相液相色谱仪，进行反相 液相色谱测定分析。
[0014] 取批号060501等20批进行地龙注射液中五种氨基酸含量的测定，测定结果见表 Io
[0015] 表1地龙注射液的五种氨基酸含量测定结果
【权利要求】
1. 一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法，其特征在于，包 含如下步骤： 51、 色谱条件：C18或C8反相色谱柱，柱温：37°C，检测波长248nm，流速0. 8ml/min梯 度洗脱，流动相A为5. Ommol/L七氟丁酸的0. 7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水 溶液，洗脱液流速为 Omin 100%A，0.5min 98.5%A, lOmin 90%A，15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A ； 52、 对照品溶液的配制：精密称取丙氨酸对照品90. 79mg、缴氨酸对照品39. 94mg、盐 酸赖氨酸对照品32. 53mg、异亮氨酸对照品30. 87mg、亮氨酸对照品60. 28mg，另取酪氨酸 1. 3g，加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，用水定容于容量瓶，得对照品溶液； 53、 供试品溶液的配制：取地龙注射液五支，混匀，用水定容于容量瓶，得供试品溶液； 54、 测定：精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 yl注入反相液相色谱仪，进行反相 液相色谱测定分析。
2. 根据权利要求1所述同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方 法，其特征在于，步骤S2具体包括：精密称取105°C干燥3h的丙氨酸对照品90. 79mg、缬氨 酸对照品39. 94mg、盐酸赖氨酸对照品32. 53mg、异亮氨酸对照品30. 87mg、亮氨酸对照品 60. 28mg，另取酪氨酸1. 3g，置于同一 100ml量瓶中加少量0. lmol/L盐酸溶液溶解，加水稀 释至刻度，且再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
3. 根据权利要求1所述同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法， 其特征在于，步骤S3具体包括：取地龙注射液五支，混匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中， 加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
【文档编号】G01N30/02GK104391053SQ201410592686
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】任宏, 李冠儒, 谢作君 申请人:广东新峰药业股份有限公司