一种黄曲霉毒素b1、呕吐毒素二联检测卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种能同时检测饲料中各种原料及成品的黄曲霉毒素B1和呕吐毒素的二联检测卡。检测卡是由上下两块塑料壳和置于内部的胶体金试纸条组成；上方的塑料壳上设有加样孔和观察窗；下方的塑料壳有凸出的定位槽；胶体金试纸条包括底板、反应膜、样品垫、金标结合垫、吸水垫。本实用新型检测卡具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速，成本低，重复性高，适用样品范围宽且前处理简单相同等特点，能同时检测饲料中各种原料及成品的黄曲霉毒素B1和呕吐毒素，大大节约时间和操作，适合用于现场检测和大规模检测筛选。
【专利说明】-种黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于快速检测领域，具体涉及一种能同时检测饲料各种原料及成品的 黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素的二联检测卡。
【背景技术】
[0002] 霉菌毒素（Mycotoxins)是霉菌在谷物或饲料上生长繁殖过程中产生的有毒二次 代谢产物，毒素在谷物的生长过程、饲料的制造、贮存及运输过程中都可产生。据联合国粮 农组织（FA0)资料，全球每年大约有25%的农作物不同程度地受到霉菌毒素的污染，约有 2%的农作物因污染严重而失去食用价值。迄今为止已经有超过300种霉菌毒素被分离和 鉴定出来，主要包括黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT)、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON)、玉米 赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素 A(0chratoxinA，0TA)、T-2毒素（T-2toxin，T-2) 等。
[0003] 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，主要是由黄曲霉和寄生曲霉所产生 的，包括Bl、B2、G1及G2等10多种，其中以黄曲霉毒素 Bl(AFBl)最为常见，毒性最强。 AFB1会破坏猪的消化酶活性，阻碍其对基本营养物的吸收，降低饲料转化效率，造成猪体消 化机能紊乱，食欲减退、营养不良、贫血、免疫抑制、增重减缓、生长发育停滞和仔猪生产性 能下降。人体在短时间内大量摄入受黄曲霉毒素 B1污染的食品可引起急性中毒，主要是 损害肝，发生肝炎，肝硬化，肝坏死等。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构 (International Agency for Research onCancer，IARC)划定为 I 类致癌物，其中黄曲霉毒 素 B1是目前自然界中存在的最强的致癌物质。我国《饲料卫生标准》中对不同饲料中黄曲 霉毒素 B1残留限量做了规定，最低限量为10yg / kg。
[0004] 呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是镰刀菌霉的二级代谢产物，主要由禾谷镰 刀菌（Fusarium graminearum)和大刀鎌刀菌（Fusarium culmorum)产生。呕吐毒素普遍存 在于世界各地的谷物和谷物制品中，对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹 泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等。猪是对呕吐毒素最敏感的动物，饲料中〇. 3? 〇.5mg / kg的微量呕吐毒素就会引起猪拒食、生长下降以及对传染病的抵抗力下降，此外， 呕吐毒素还可在人和动物体内蓄积，具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。有 资料显示，呕吐毒素与人类的食物中毒性白细胞缺乏症（ΑΤΑ)有关，该疾病死亡率较高，曾 在前苏联、中国及北美等国家和地区出现过爆发。1998年，国际癌症研究机构（IARC)公布 的评价报告中，呕吐毒素被列为三类致癌物。我国《配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许 量》中规定猪配合饲料、犊牛配合饲料、泌乳期动物配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量 为lmg / kg,牛配合饲料和家禽配合饲料中含量不超过5mg / kg。
[0005] 黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素的常规检测方法对仪器设备、环境、操作技能等有很高的 要求，而且检测周期较长、价格昂贵，严重制约着我国饲料产业的发展。胶体金免疫层析技 术是80年代以来飞速发展起来的一种快速检测方法，由于其具有简便快速、操作简单、特 异性强、不需要额外设备等优点，目前已广泛应用于临床医学、食品安全、环境监测等领域。
[0006] 现有技术中有单独对黄曲霉素 B1和呕吐毒素进行检测的快速检测卡，但需要分 别对黄曲霉素 B1和呕吐毒素进行检测，操作重复、费时，浪费人力物力。
[0007] 中国专利申请201210473923. X公开了一种同时检测小麦及其制品中黄曲霉毒 素 B1、赭曲霉毒素 A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮的快速检测卡，但该检测卡只适用于小麦及 其制品的检测，适用范围不宽，实用性不强，不能完全满足饲料生产企业对各种原料（如 玉米及其制品、小麦及其制品、碎米、米糠等）及成品的质控，且对于呕吐毒素的检测限是 500yg / kg，不能完全满足饲料生产企业对于呕吐毒素的质控要求。因此急需一种既能同 时检测黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素、又能满足检测下限要求，适用范围宽的检测工具。 实用新型内容
[0008] 本实用新型的目的在于提供一种检出限符合要求，省时省力，一次性检测黄曲霉 毒素 B1、呕吐毒素两种毒素的二联检测卡。
[0009] 为实现上述目的，本实用新型的技术方案是，一种黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检 测卡，所述二联检测卡由上下两块塑料壳和置于内部的胶体金试纸条组成，胶体金试纸条 由样品垫（1)、金标结合垫（2)、反应膜（3)、底板（4)、吸水垫（5)组成；上塑料壳设有加样 孔（10)和观察窗（11);下塑料壳设有凸出的用以固定胶体金试纸条的定位槽；
[0010] 所述金标结合垫、反应膜、吸水垫以水平方向顺序相接并固定在底板上方，所述金 标结合垫、反应膜、吸水垫的相邻部分各有1-2_的重叠区域，所述金标结合垫上粘有样品 垫，所述底板下方粘有吸水垫2 ;
[0011] 所述反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次设有检测线1、检测线2和质控线，检测 线1上包被有能与抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体特异性结合的黄曲霉毒素 B1人工抗原，检 测线2上包被有能与抗呕吐毒素单克隆抗体特异性结合的呕吐毒素人工抗原，质控线上包 被有能与抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体和抗呕吐毒素单克隆抗体结合的抗抗体；
[0012] 所述金标结合垫上包被有胶体金标记的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体和抗呕吐毒 素单克隆抗体。
[0013] 所述底板为聚氯乙烯材质，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫和金标结合 垫为玻璃纤维膜，所述吸水垫为滤纸。
[0014] 所述的检测线1、检测线2和质控线相互平行并且与样品流动方向垂直，检测线1 和检测线2相距3. 5mm，检测线2和质控线相距5mm。检测线1和检测线2相距较近，而与 质控线相距较远，避免了可能对质控线造成的污染和干扰。检测线1和检测线2之间的距 离又避免了所检测的两种毒素之间的相互干扰。
[0015] 所述黄曲霉毒素 B1人工抗原为黄曲霉毒素 B1与牛血清白蛋白的偶联物，所述呕 吐毒素人工抗原为呕吐毒素与牛血清白蛋白的偶联物，所述抗抗体为羊抗鼠 IgG。
[0016] 本实用新型的原理可表述为：胶体金标记的单克隆抗体能与检测线上相应的人工 抗原和质控线上的抗抗体结合，使胶体金颗粒聚集在检测线和质控线上，呈现肉眼可见的 红色条带；若样品溶液中含有黄曲霉毒素 B1或呕吐毒素，则其会与相应的胶体金标记的单 克隆抗体结合，从而阻碍了胶体金标记的单克隆抗体结合到相应检测线上，使相应检测线 上的红色条带变浅；如果溶液中的黄曲霉毒素 B1或呕吐毒素含量超过了检测卡的检出限， 则相应检测线将不显色，结果为阳性；反之，如果溶液中的黄曲霉毒素 B1或呕吐毒素含量 未超过检测卡的检出限，则相应检测线将出现红色条带，结果为阳性。
[0017] 因此，与现有技术相比，本实用新型检测卡具有如下有益效果：
[0018] (1)多残留检测。本实用新型检测卡具有两条检测线，能够同时检测饲料中的黄曲 霉毒素 B1和呕吐毒素残留。
[0019] (2)灵敏度高。本实用新型检测卡的黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素检出限分别为 5yg / kg和200yg / kg，在饲料检测达到了较优水平，适用于各类企业及检测机构。
[0020] (3)操作简单快捷。本实用新型检测卡前处理简单，结果判定容易，仅需一次样品 处理和一次滴板即可完成对饲料样品中黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素残留的检测，整个检测 过程可在20分钟内完成，大大缩短检样时间；并且检测实施过程不依赖任何实验设备，普 通人员均可操作，不需专业培训。
[0021] (4)成本低，易推广。本实用新型检测卡生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉， 投资少，收效快。
[0022] (5)实用性强。本实用新型检测卡能适用于各种饲料，如玉米及其制品、小麦及其 制品、碎米、米糠及各种成品的准确性检测。
[0023] 本实用新型提供了一种能够同时检测黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素的检测卡，其检 出限分别为5yg / kg和200yg / kg,仅需一次样品处理和一次滴板即可完成对饲料样品 中黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素残留的检测，简单方便，省时省力，大大缩短检样时间，适合用 于现场监控和基层大规模筛选检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本实用新型检测卡中胶体金试纸条的侧面结构示意图。其中1为样品垫，2 为金标结合垫，3为反应膜,4为底板,5为吸水垫,7为检测线1,8为检测线2,9为质控线。
[0025] 图2为本实用新型检测卡俯视图，其中10为加样孔，11为观察窗。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本 实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型的内容之后， 本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本实用新型 所限定的范围。
[0027] 如图1和图2所示的一种黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡，检测卡包括上下 两块塑料壳和置于内部的胶体金试纸条，上方的塑料壳上设有加样孔（10)和观察窗（11)， 下方的塑料壳有凸出的定位槽；胶体金试纸条包括底板（4)、反应膜（3)、样品垫（1)、金标 结合垫（2)、吸水垫（5)，反应膜（3)上设有检测线1(7)、检测线2 (8)和质控线（9);样品垫 (1)对应上方塑料壳上加样孔（10)，反应膜（3)对应上方塑料壳上观察窗（11);为保证样 品溶液流动的顺利进行，金标结合垫（2)叠压于反应膜（3)近样品垫（1)端，样品垫（1)叠 压于金标结合垫（2)上，吸水垫（5)叠压于反应膜（3)远样品垫（1)端。
[0028] 从包装袋中取出检测卡，吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始 计时；结果应在5?8min读取，其他时间判读无效。观察时，检测卡水平放置于观察者正 面。
[0029] 结果判读：
[0030] 阴性㈠ ：检测线T1线有显色，表明样品中黄曲霉毒素 B1残留含量低于5ppb或 不含黄曲霉毒素 B1残留；检测线T2线有显色，表明样品中呕吐毒素残留含量低于200ppb 或不含呕吐毒素残留；
[0031] 阳性（+):检测线T1线无显色，表明样品中黄曲霉毒素 B1残留含量高于5ppb;检 测线T2线无显色，表明样品中呕吐毒素残留含量高于200ppb ;
[0032] 无效：未出现C线，可能是操作不当或检测卡已失效。应再次阅读说明书，并用新 的检测卡重新测试。
[0033] 本实用新型能够同时检测黄曲霉毒素 B1和呕吐毒素两种毒素，其检出限分别为 5yg / kg和200yg / kg,仅需一次样品处理和一次滴板即可完成对饲料样品中黄曲霉毒 素 B1和呕吐毒素残留的检测，简单方便，省时省力，大大缩短检样时间，适合用于现场监控 和基层大规模筛选检测。
[〇〇34] 以上为对本实用新型实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领 域专业技术人员能够实现或使用本实用新型。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技 术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本实用新型的精神或 范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本实用新型将不会被限制于本文所示的这些实 施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1. 一种黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡，其特征在于，所述二联检测卡由上下两 块塑料壳和置于内部的胶体金试纸条组成，胶体金试纸条由样品垫（1)、金标结合垫（2)、 反应膜（3)、底板（4)、吸水垫（5)组成；上塑料壳设有加样孔（10)和观察窗（11);下塑料 壳设有凸出的用以固定胶体金试纸条的定位槽； 所述金标结合垫、反应膜、吸水垫以水平方向顺序相接并固定在底板上方，所述金标结 合垫、反应膜、吸水垫的相邻部分各有l_2mm的重叠区域，所述金标结合垫上粘有样品垫； 所述反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次设有检测线1(7)、检测线2(8)和质控线 (9)，检测线1上包被有能与抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体特异性结合的黄曲霉毒素 B1人工 抗原，检测线2上包被有能与抗呕吐毒素单克隆抗体特异性结合的呕吐毒素人工抗原，质 控线上包被有能与抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体和抗呕吐毒素单克隆抗体结合的抗抗体； 所述金标结合垫上包被有胶体金标记的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体和抗呕吐毒素单 克隆抗体。
2. 如权利要求1所述的黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡，其特征在于，所述的检 测线1、检测线2和质控线相互平行并且与样品流动方向垂直，检测线1和检测线2相距 3. 5mm，检测线2和质控线相距5mm。
3. 如权利要求1所述的黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡，其特征在于，所述底板为 聚氯乙烯材质，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫和金标结合垫为玻璃纤维膜，所述 吸水垫为滤纸。
4. 如权利要求1所述的黄曲霉毒素 B1、呕吐毒素二联检测卡，其特征在于，所述黄曲霉 毒素 B1人工抗原为黄曲霉毒素 B1与牛血清白蛋白的偶联物，所述呕吐毒素人工抗原为呕 吐毒素与牛血清白蛋白的偶联物，所述抗抗体为羊抗鼠 IgG。
【文档编号】G01N33/577GK203838157SQ201420082102
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】洪平, 邬本成, 尹玉秀 申请人:安佑生物科技集团有限公司