一种快速检测维生素d的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种快速检测维生素D的试剂盒，包括检测卡和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测卡包括卡盒和设置于卡盒内的试纸条，所述试纸条包括不吸水的支撑板，所述支撑板上依次设置有样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，所述结合垫上包被有标记物标记的维生素D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜为硝酸纤维素膜，层析膜上设置有质控C线和检测T线，所述检测T线位于结合垫和质控C线之间，检测T线上包被有维生素D特异性抗体，质控C线上包被有能够与载体蛋白结合的特异性抗体。本实用新型的试剂盒使用方便，操作简单，检测速度快，容易普及到基层医疗单位使用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白。
【专利说明】一种快速检测维生素D的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物检测用试剂盒【技术领域】，具体涉及一种快速检测维生素D的试剂盒。
【背景技术】
[0002]维生素D在调节人体内钙代谢、维持肌肉骨骼和免疫系统的健康和稳定、预防部分恶性肿瘤发生有着不可或缺的作用。联合国卫生组织统计数据显示，全球大约90%人口患有维生素D不足之症。由于维生素D的分子特性(高度亲脂性)使其分离提纯难度增力口，检测条件要求高，限制了维生素D检测在临床的推广应用，也限制了我们获得更多的有关维生素D的信息。到目前为止，已经报道并被临床接受的人血清维生素D检测方法有试剂盒检测以及仪器检测两类。
[0003]一、仪器检测。I)直接检测法(Direct Detect1n Methodology)。这类方法中最著名的是液相色谱分析法(HPLC)以及后来改进了的液相色谱-质谱联用分析法(LC/MS)。2)自动分析检测仪(Automated Instrumentat1n Methodology)。仪器检测其优点是精确度高，缺点是仪器投资大，样品必须有机溶剂提取并纯化，分析人员需要经过专业培训，并且分析过程中有机溶剂消耗大，不利于环境保护。目前直接分析法多局限于研究型实验室使用。
[0004]美国的Nichols Institute Diagnostics 公司，DiaSorin 公司以及德国 RocheDiagnostics公司分别宣布其研发出血清维生素D自动检测仪器。应用此类自动分析仪，血清样品不需要任何前期处理即可直接进行检测。此类仪器检测的原理是化学荧光分析技术。其优点是仪器自动完成样品的分离，提取，检测，数据整理，结果判断等步骤。样品的检测周期约一个半小时。其缺点是自动分析仪价格尤其昂贵，限制了其的推广使用。
[0005]二、试剂盒检测，按作用原理又分为以下几种:
[0006]I)竞争性蛋白结合分析法(CPBA)
[0007]2)放射免疫分析法(RIA)
[0008]3)酶联免疫吸附法(ELISA)
[0009]目前已有的试剂盒检测分析方法基本上均使用免疫反应板，通过直接或间接酶联免疫反应检测样品中维生素D含量。在这些检测方法中，绝大多数需要进行样品的有机溶剂提取，一些方法中反应物有同位素标记，易造成环境有机溶剂以及放射性物质污染，且检测必须由专业人员在实验室通过仪器操作完成。平均检测过程在100分钟左右。
[0010]由上述分析以看出，目前已有的维生素D检测方法，无论仪器检测或酶联免疫反应板检测，其均存在着仪器设备投资高，检测人员要求高，检测过程中有机溶剂或放射性物质污染等问题，使得维生素D检测普及受到限制，这也造成临床用药缺少检验指标支持，用药带有极大的盲目性，甚至给患者身体带来更多的危害。为此，开发一种操作简便、快速、价格低、适合基层推广使用的血清维生素D检测方法是未来的发展趋势，也是临床工作者和广大患者的迫切要求。
[0011]侧向层流免疫分析技术兴起在上世纪90年代，在近10年有了长足的发展，已经被广泛应用于快速检测诊断领域。而维生素D的检测由于样品提纯过程复杂，样品不稳定，标准参照物难得等等原因，一直未能在临床广泛开展。
实用新型内容
[0012]本实用新型所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测维生素D的试剂盒。该试剂盒是基于竞争性免疫结合原理，采用侧向层析法检测维生素D浓度，使用简单、结果易于判断、检测成本低廉，适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素D检测成本、普及人体维生素D检测、减少临床盲目用药具有重要意义。该试剂盒使用方便，操作简单，检测速度快，容易普及到基层医疗单位使用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白，结果判断容易，摆脱了维生素D检测对设备、仪器以及人员的特殊要求。
[0013]为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案是:一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，包括检测卡和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测卡包括卡盒和设置于卡盒内的试纸条，所述试纸条包括不吸水的支撑板，所述支撑板上依次设置有样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，所述结合垫上包被有标记物标记的维生素D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜为硝酸纤维素膜，层析膜上设置有质控C线和检测T线，所述检测T线位于结合垫和质控C线之间，检测T线上包被有维生素D特异性抗体，质控C线上包被有能够与载体蛋白结合的特异性抗体；所述卡盒包括相互扣合在一起的面板和底板，所述面板上且位于层析膜的上方设置有用于观察质控C线和检测T线的观察窗，所述面板上且位于样品垫的上方设置有试剂孔和加样孔，且加样孔位于试剂孔和观察窗之间。
[0014]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，还包括防潮袋，以及用于盛装检测卡、试剂瓶和防潮袋的铝塑袋。
[0015]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述观察窗上设置有用于分隔质控C线和检测T线的横隔条。
[0016]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述面板上且位于吸收垫的上方设置有若干个排气孔。
[0017]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述标记物为胶体金颗粒。
[0018]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体为BSA免疫球蛋白。
[0019]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体分别为鼠抗鸡卵清白蛋白或兔抗鸡卵清白蛋白。
[0020]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述维生素D为25-羟基维生素D。
[0021]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述维生素D特异性抗体为鼠抗维生素D单克隆抗体，维生素D特异性抗体的包被量为2 μ L，包被浓度为0.25mg/mL?5mg/mL。
[0022]上述的一种快速检测维生素D的试剂盒，所述能够与载体蛋白结合的特异性抗体的包被量为2 μ L,包被浓度为0.lmg/mL?1.0mg/mL。
[0023]本实用新型与现有技术相比具有以下优点:
[0024]1、本实用新型的快速检测维生素D的试剂盒结构简单，设计合理，是基于竞争性免疫结合原理，采用侧向层析法检测维生素D浓度，其使用简单、结果易于判断、检测成本低廉，适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素D检测成本、普及人体维生素D检测、减少临床盲目用药具有重要意义。
[0025]2、本实用新型的试剂盒使用方便，操作简单，检测速度快，容易普及到基层医疗单位使用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白。
[0026]3、本实用新型的试剂盒结果判断容易，用符号表示，摆脱了维生素D检测对设备、仪器以及人员的特殊要求。
[0027]下面结合附图和实施例，对本实用新型的技术方案作进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本实用新型试纸条的结构示意图。
[0029]图2为本实用新型检测卡的结构示意图。
[0030]图3为图2的俯视图。
[0031]附图标记说明:
[0032]I一支撑板；2—样品垫；3—结合垫；
[0033]4一层析膜；5—检测T线；6—质控C线；
[0034]7—吸水垫；8—面板； 9一底板；
[0035]10一试剂孔；11 一加样孔；12—观察窗；
[0036]13一横隔条；14一排气孔。
【具体实施方式】
[0037]如图1、图2和图3所示，本实施例的快速检测维生素D的试剂盒，包括检测卡和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测卡包括卡盒和设置于卡盒内的试纸条，所述试纸条包括不吸水的支撑板1，所述支撑板I上依次设置有样品垫2、结合垫3、层析膜4和吸收垫7，所述结合垫3上包被有标记物标记的维生素D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜4为硝酸纤维素膜，层析膜4上设置有质控C线6和检测T线5，所述检测T线5位于结合垫3和质控C线6之间，检测T线5上包被有维生素D特异性抗体，质控C线6上包被有能够与载体蛋白结合的特异性抗体；所述卡盒包括相互扣合在一起的面板8和底板9，所述面板8上且位于层析膜4的上方设置有用于观察质控C线6和检测T线5的观察窗12，所述面板8上且位于样品垫2的上方设置有试剂孔10和加样孔11，且加样孔11位于试剂孔10和观察窗12之间。
[0038]本实施例中，还包括防潮袋，以及用于盛装检测卡、试剂瓶和防潮袋的铝塑袋。
[0039]本实施例中，所述观察窗12上设置有用于分隔质控C线6和检测T线5的横隔条13。
[0040]本实施例中，所述面板8上且位于吸收垫7的上方设置有若干个排气孔14。
[0041 ] 本实施例中，所述标记物为胶体金颗粒。
[0042]本实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体为BSA免疫球蛋白。
[0043]本实施例中，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体分别为鼠抗鸡卵清白蛋白或兔抗鸡卵清白蛋白。
[0044]本实施例中,所述维生素D为25-轻基维生素D。
[0045]本实施例中，所述维生素D特异性抗体为鼠抗维生素D单克隆抗体，维生素D特异性抗体的包被量为2 μ L,包被浓度为0.25mg/mL?5mg/mL。
[0046]本实施例中，所述能够与载体蛋白结合的特异性抗体的包被量为2 μ L，包被浓度为 0.lmg/mL ?1.0mg/mLo
[0047]本实用新型的试剂盒的使用方法为:
[0048]将约20 μ L待检测的人血样品加入加样孔11中，然后将150 μ L检测试剂逐滴加入试剂孔10中，10分钟?15分钟后观察结果；所述检测试剂为含有蔗糖、Tween-20,PEG20000和硫柳汞的四硼酸钠溶液，检测试剂中四硼酸钠的浓度为2mM?20mM，每10mL检测试剂中含有 0.5g ?1g蔗糖，0.1mL ?ImL Tween-20,0.5g ?5g PEG20000 和 0.0lg ?
0.1g硫柳萊。
[0049]结果判断:无效:试纸条无质控C线出现；阴性:试纸条质控C线出现但无检测T线；阳性:试纸条检测T线伴同有质控C线出现。
[0050]采用本实用新型的试剂盒对标准浓度样品进行检测:
[0051]标准浓度样品制备:制备25-羟基维生素D与BSA的偶联物；HPLC检测偶联物中25-轻基维生素D的浓度；通过离心浓缩(Millipore Amicon centrifugal filter)得到标准样品，并使用BSA浓度为lmg/mL的PBS溶液稀释标准样品，得到维生素D浓度分别为:Ong/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、60ng/mL 和 80ng/mL 的标准浓度样品，其中Ong/mL样品为BSA浓度lmg/mL的PBS溶液。
[0052]按照本实用新型试剂盒的使用方法检测上述标准浓度样品，结果见表I。
[0053]表I标准维生素D浓度(维生素D蛋白偶联物)
[0054]
维生素D浓度(ng/mL) |检测线T|质控线C
O++
10 + +
20 + +
25++
30-+
35-+
40-+
60 - +
80 - +
[0055]表I结果显示:1)样品维生素D:0、10、20和25ng/mL T线和C线均呈阳性；2) T线在样品维生素D浓度大于等于30ng/mL时消失。本实验结果经过不同批次间重复检验。
[0056]采用本实用新型的试剂盒对人血清维生素D浓度检测:
[0057](I)人全血样品5例，经25-羟基维生素D酶联免疫试剂盒(英国IDS公司)检测人全血样品中25-羟基维生素D的浓度；
[0058](2)取各样品20yL，按照本实用新型试剂盒的使用方法检测人全血样品中的25-羟基维生素D，结果见表2。
[0059]表2传统酶联免疫试剂盒检测与本实用新型试剂盒检测结果对比
[0060]
25-羟基，生素D酶联免疫试剂盒(IDS)维生素D检测试纸条样品号码25_,基，,素D维生素D浓度试纸条检测结果维生素D浓度_ (nmol/L) _
1132正常? 1:正常
295正常=正常
C ^+
393正常τ|_正常
C钱+
465 不足不足______T 线+__
C残 +
543 不足不足______T 线 +__
[0061]从表2可以看出，传统酶联检测试剂盒检测的正常浓度范围(75nmol/L?150nmol/L)的样品在试纸条检测中检测T线不显色，而低于正常浓度范围的样品其试纸条检测T线显色。
[0062]本实用新型试剂盒的非特异性结合实验
[0063]配制不同浓度的BSA的PBS溶液，浓度范围由lmg/mL至20mg/mL，取20 μ L各浓度的BSA溶液作为样品加入加样孔中，按试剂盒的使用方法检测抗原抗体与一般蛋白分子的非特异性结合反应。检测结果显示不同浓度的BSA溶液均不能使本实用新型的试剂盒的检测T线消失。证明本实用新型的试剂盒与普通蛋白分子无非特异性结合反应。
[0064]本实用新型试剂盒的特异性结合实验
[0065]选取已知浓度的维生素D血清样品，分别加入维生素D蛋白偶联物(强化)或Img/mL BSA溶液(稀释)，然后应用本实用新型试剂盒观察检测T线变化。检测结果如表3所
/Jn ο
[0066]表3已知浓度维生素D血清样品稀释或强化后试纸条检测结果
[0067]
样品25-羟基维生素D浓度I维生素D实际浓度~Fl (Cl
17ng/mL17ng/mL++
17ng/mL 稀释(50% v/v)8.5ng/mL++
17ng/mL 强化25ng/mL++
17ng/mL 强化35ng/mL-+
38ng/mL38ng/mL-+
38ng/mL 稀释(50% v/v)19ng/mL++
38ng/mL 稀释(66% v/v)25ng/mL++
38ng/mL 稀释(80% v/v)30ng/mL-+
[0068]从表3可以看出，试纸条检测结果中检测T线的变化与样品中维生素D浓度的变化有关，与其他蛋白浓度变化没有明显关系。
[0069]本实用新型试剂盒的稳定性实验
[0070]将本实用新型的试剂盒干燥密封后，置于37°C培养箱7天，然后取出，平衡至室温；同一生产批号的试剂盒干燥密封后，保存在4°C，于试验前取出，平衡至室温；然后比较两个试剂盒免疫分析实验结果。结果显示37°C储存一周对本试剂盒检测结果无影响。
[0071]以上所述，仅是本实用新型的较佳实施例，并非对本实用新型做任何限制，凡是根据实用新型技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本实用新型技术方案的保护范围内。
【权利要求】
1.一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，包括检测卡和装有检测试剂的试剂瓶，所述检测卡包括卡盒和设置于卡盒内的试纸条，所述试纸条包括不吸水的支撑板(I)，所述支撑板(I)上依次设置有样品垫(2)、结合垫(3)、层析膜(4)和吸收垫(7)，所述结合垫(3)上包被有标记物标记的维生素D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜(4)为硝酸纤维素膜，层析膜(4)上设置有质控C线(6)和检测T线(5)，所述检测T线(5)位于结合垫(3)和质控C线(6)之间，检测T线(5)上包被有维生素D特异性抗体，质控C线(6)上包被有能够与载体蛋白结合的特异性抗体；所述卡盒包括相互扣合在一起的面板(8)和底板(9)，所述面板(8)上且位于层析膜(4)的上方设置有用于观察质控C线(6)和检测T线(5)的观察窗(12)，所述面板(8)上且位于样品垫(2)的上方设置有试剂孔(10)和加样孔(11)，且加样孔(11)位于试剂孔(10)和观察窗(12)之间。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，还包括防潮袋，以及用于盛装检测卡、试剂瓶和防潮袋的铝塑袋。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，所述观察窗(12)上设置有用于分隔质控C线(6)和检测T线(5)的横隔条(13)。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，所述面板(8)上且位于吸收垫(7)的上方设置有若干个排气孔(14)。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测维生素D的试剂盒，其特征在于，所述标记物为胶体金颗粒。
【文档编号】G01N33/558GK204008660SQ201420359643
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】韩雅君 申请人:韩雅君