一种检测雌三醇的试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测雌三醇的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测雌三醇的胶体金试纸条，其特别适用于鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉等动物源性食品中雌三醇残留的检测。

背景技术：

雌三醇是体内雌二醇的代谢物，为主要存在于尿中的一种天然雌激素。然而，在养殖业经常存在滥用抗生素和激素等现象，导致动物源性食品中残留一定量的雌三醇激素，食用后可能导致人类与激素相关性疾病容易发生，如乳腺、卵巢、前列腺肿瘤、内分泌相关的肿瘤、出生缺陷和生育缺陷等，还会对婴儿和青少年的生长发育造成严重影响。

基于以上原因，我们设计了一种用胶体金免疫层析技术检测鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉等动物源性食品中雌三醇的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的雌三醇残留检测试纸条。

本发明所提供的检测雌三醇残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物。

所述雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物是由雌三醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述雌三醇单克隆抗体是以雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由雌三醇单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备喷涂有雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质 控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)半抗原制备：将雌三醇与氯乙酸反应得到雌三醇半抗原；

2)将雌三醇半抗原与载体蛋白偶联，得到雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到雌三醇单克隆杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将步骤3)制备的雌三醇单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物；

7)将雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

8)将雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉中雌三醇残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明的雌三醇快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的雌三醇在流动过程中，与结合物释放垫上的雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有雌三醇残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当雌三醇在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)内各出现一条红色条带；如果雌三醇在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与雌三醇全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图2所示。

阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)显色深或显色一致，判为阴性。

阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)显色浅或不显色，判为阳性。

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测雌三醇残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为试纸条检测结果判定图。

图3为雌三醇半抗原合成图。

图4为雌三醇半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1雌三醇检测试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备喷涂有雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有雌三醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、雌三醇半抗原的制备

取雌三醇1.0g加乙腈溶解，加碳酸钾0.62g，加氯乙酸0.47g，60℃搅拌6h。检测，原料基本反应完全，停止反应，旋蒸，加水，乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节PH值到6，乙酸乙酯萃取，分去水相，无水硫酸钠干燥，蒸干，加二氯甲烷/石油醚1∶1，重结晶得到半抗原 产物。合成路线如图3。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，¹H NMR(CDCl₃，300MHZ)δ：11.0(s，1H，COOH)，6.78(d，2H，ArH)，6.44(d，1H，ArH)，4.66(s，2H，-CH2-)，3.58(s，2H，OH)，3.22(m，2H，-CH-)，2.90(m，2H，-CH2)，1.68-1.88(m，10H，-CH2-)，1.04(s，3H，-CH3)，图谱中化学位移δ＝11的为羧基氢，4.66为间隔臂上亚甲基氢，除原料特有氢外，这些氢的共振吸收峰的存在说明间隔臂偶联成功，即说明半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取15mg半抗原，溶解于1mL DMF中，得到溶液(1)；取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入(1)中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

3、包被原的制备

取15mg半抗原，溶解于1mL DMF中，得到溶液(1)；取30mg EDC和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入(1)中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取OVA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

4、雌三醇单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入雌三醇单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温-80 0.05％～0.2％(质量分数)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

8、反应膜的制备

将雌三醇半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将雌三醇半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中 浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中雌三醇残留的检测

1、样品的前处理

取已去脂肪的组织样本于均质器中均质1min(10000rpm)，或用剪刀剪碎；称取2.0±0.05g均浆好的组织样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml样本提取液，震荡摇匀；在加入1ml样本稀释液于聚苯乙烯离心管中，震荡摇匀。

2、用试纸条进行检测

用一次性吸管吸取待检样本溶液垂直滴加2～3滴于加样孔中，液体流动时开始计时，反应5～10min，根据示意图判定结果，其他时间判定无效。

3、分析检测结果

阴性(-)：T线显色比C线显色深或显色一致，表示样品中雌三醇浓度低于检测限，如图2(a)、(b)。

阳性(+)：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样品中雌三醇浓度等于或高于检测限，如图2(c)、(d)。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2(e)、(f)。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉样本，在其中分别添加雌三醇至终浓度为5、10、20μg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉样本时，当其中雌三醇添加浓度为5μg/kg时，呈阴性；当其中雌三醇添加浓度为10、20μg/kg时，呈阳性，表明本试纸条对鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉中雌三醇的检测限为10μg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知雌三醇含量大于10μg/kg的鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉阳性样本各20份(编号1-20)和含量小于10μg/kg的鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉阴性样本各20份(编号21-40)，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1-4。

表1检测鱼肉样本结果

表2检测鸡肉样本结果

表3检测虾肉样本结果

表4检测猪肉样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测雌三醇的试纸条可以对鱼肉、鸡肉、虾肉、猪肉中雌三醇残留进行快速检测。

3、特异性试验

用雌三醇试纸条检测1000μg/kg苯甲酸雌二醇、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、泰乐菌素等药物。结果显示，试纸条均呈阴性。说明本试纸条对1000μg/kg苯甲酸雌二醇、替米考星、磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、泰乐菌素等药物无交叉反应，特异性良好。