柱前衍生化法和发酵乳制品中组胺的检测方法与流程

技术特征：

1.一种柱前衍生化法，其特征在于其包括下述步骤：

(1)将待测样品进行预处理：待测样品在浓度为0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液中混合反应20～45分钟后，1000～2500G离心8～15分钟，取上清液，再用所述高氯酸水溶液配制成浓度为50～250g/L的预处理后的待测样品；其中，所述待测样品为发酵乳制品；

(2)将预处理后的待测样品中加入内标溶液后，在衍生化条件下进行衍生化反应后，除去衍生化反应过程中的丙酮，再用溶剂萃取，取萃取相，即得柱前衍生化反应后的待测样品；

其中，所述溶剂为能溶解组胺但不溶于水的有机溶剂；所述预处理后的待测样品和内标溶液的体积比为30:1～70:1；

所述的衍生化条件为在pH值在8-12的取值范围内，通过对以下2次7项回归方程取值获得：

Y＝29.92+2.62X₁+1.48X₂+1.52X₃-2.19X₂X₃-3.39X₁²-2.64X₂²

其中，Y为组胺含量，单位mg/kg；X₁为丹磺酰氯溶液中丹磺酰氯的浓度，丹磺酰氯溶液中的溶剂为丙酮，取值范围为1.0-10.0g/L；X₂为衍生化反应温度，取值范围为40-60℃；X₃为衍生化反应时间，取值范围为15-60分钟。

2.如权利要求1所述的柱前衍生化法，其特征在于，步骤(1)中，所述高氯酸水溶液的浓度为0.55～0.65mol/L；

步骤(1)中，所述混合反应的时间为25～35分钟；

步骤(1)中，所述离心的条件为1800～2200G，8～12分钟。

3.如权利要求1所述的柱前衍生化法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理后的待测样品的浓度为100～250g/L，较佳地为100～200g/L；

步骤(1)中，所述发酵乳制品选自为干酪、发酵乳和发酵稀奶油中的一种或多种，较佳地选自干酪和/或发酵乳；

步骤(1)中，所述的混合反应的操作为通过恒温震荡器进行震荡；

步骤(1)中，在预处理过程中使用高氯酸水溶液进行多次混合反应， 较佳地使用高氯酸水溶液进行3次混合反应。

4.如权利要求1所述的柱前衍生化法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理过程按下述步骤进行：将4～6g的所述待测样品在15～50mL、0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液中混匀，震荡20～45min后，1000～2500G离心8～15min，取上清液，采用0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液稀释至50mL即可；较佳地按下述步骤进行：将5g所述待测样品溶于15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液，振荡30min后，2000G离心10min，取上清液，采用0.6mol/L的高氯酸水溶液将滤液稀释至50mL即可。

5.如权利要求1所述的柱前衍生化法，其特征在于，步骤(2)中，所述内标溶液为浓度为100mg/L的1,7-庚二胺的盐酸标准溶液；所述内标溶液较佳地通过下述步骤制的：①称取1,7-庚二胺标准品溶于0.1mol/L盐酸中，配制成1000mg/L的母液；②使用0.1mol/L盐酸将所述母液稀释成100mg/L的标准溶液即可。

6.如权利要求1所述的柱前衍生化法，其特征在于，步骤(2)中，所述丙酮通过35～45℃的氮气吹除去，较佳地通过40℃的氮气吹除去；

步骤(2)中，所述溶剂为正戊烷、己烷和正庚烷中的一种或多种；

步骤(2)中，所述预处理后的待测样品和所述溶剂的体积比为1:10～1:4；

步骤(2)中，所述X₁取值范围为7.08～7.48g/L，所述pH值的取值为10.0，所述X₂取值范围为48.02-49.47℃，所述X₃取值为60分钟。

7.一种发酵乳制品中组胺的检测方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)将按照如权利要求1～6任一项所述的柱前衍生化反应处理后的待测样品先去除溶剂后，加入甲醇溶解，再经0.45μm膜过滤，得进料样品；

(2)将步骤(1)中所述进料样品再进行高效液相色谱法进行检测，即可。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述去除溶剂的方式为氮气吹干；

步骤(2)中，所述的高效液相色谱法中，色谱柱为C₁₈反相色谱柱，较 佳地型号为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈柱，其中，内径250mm×4.6mm，粒径5μm；

步骤(2)中，所述检测采用高效液相色谱-荧光检测器进行检测；

其中，所述荧光检测器的激发波长较佳地为330～380nm；所述荧光检测器的发射波长较佳地为470～560nm。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的检测使用梯度洗脱的方法，流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；

其中，较佳地，所述流动相A或所述流动相B的洗脱的梯度条件如下，

时间min0714202730353645流动相A％4535303010004545流动相B％55657070901001005555

步骤(2)中，所述进料样品的流速为0.5～1.5mL/min；

步骤(2)中，检测时的柱温为20～30℃；

步骤(2)中，检测时的进样体积为15～25μL。

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高效液相色谱法检测后，待测样品中组胺含量的按照式(1)进行计算：

$c=20\×\frac{A\×{A^{\′}}_i}{A^{\′}\×A_i}$ 式(1)

其中，c为待测样品中组胺含量，单位为毫克每千克mg/kg；

A为待测样品中组胺的峰面积；

A’为组胺标样的峰面积；

A’_i为标准样中内标的峰面积；

A_i为待测样品中内标的峰面积；

20为转换系数。