一种复方氨基酸（15）双肽（2）注射液含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药品生产领域，具体涉及一种复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测 定方法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，氨基酸分析技术 对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制盒生产管理等具有 重要意义，广泛地应用于食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析。其分析测 定方法，按照检测方法可分为化学分析法、电化学分析法、分光光度法等；按照衍生反应的 先后，可分为柱前衍生和柱后衍生。
[0003] 以上分析方法中，化学分析法、电化学分析法以及分光光度法的专属性差，不能实 现多种氨基酸同时分离测定；柱前后柱后衍生法，虽然可以使用自动进样器与色谱联用实 现多种氨基酸的分离测定，但是衍生技术较为复杂，周期较长，衍生条件不易控制，重复性 较差，难以推广。
[0004] 氨基酸分析仪可以同时对多种氨基酸进行分离和含量测定，而且不用进行柱前和 柱后衍生，可以直接进样分析测定，灵敏、快速、数据准确度高；分辨率高、操作简单、重现性 好，峰形好、体系稳定，不存在液相方法生成二级衍生物的问题，迄今氨基酸定性和定量分 析中应用最广泛的方法之一。
[0005] 常规的氨基酸含量测定，通常采用的都是氨基酸分析仪仪器厂家本身推荐的分离 条件，包括缓冲液PH值、缓冲液变换时间以及柱温等等。
[0006] 但是，在使用氨基酸分析仪对复方氨基酸（15)双肽（2)注射液中14种氨基酸和1 个双肽（甘氨酰-谷氨酰胺）进行含量测定时，使用仪器本身推荐的分离条件进行试验时， 其中样品中的甘氨酰-谷氨酰胺和丙氨酸两个组分的分离效果不好，达不到试验对组分分 离度的要求，致使含量测定结果准确度不佳。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术中的不足，提供一种复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测 定方法。
[0008] 本发明的技术方案是：
[0009] -种复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测定方法，采用离子交换树脂柱，柱温 52-62°C，流量为0· 4ml/min，检测波长是570nm和440nm，流动相是由缓冲液B1、B2、B3、B4、 B5组成，洗脱时间为60分钟，0-2. 5分钟采用100%的BI进行洗脱，2. 6-5分钟采用100% 的B2进行洗脱，6. 1-13. 8分钟采用100%的B3进行洗脱，13. 9-29. 0分钟采用100%的B4 进行洗脱，29. 1-33分钟采用100%的B5进行洗脱，33. 1-34. 0分钟采用100%的B2进行洗 脱，34. 1-53分钟采用100%的Bl进行洗脱；
[0010] 所述缓冲液81组成为6.198柠檬酸钠.2!120、11似0册-71^、5.668氯化钠、19.8(^ 柠檬酸· H20、135. Oml乙醇、l-3g柠檬酸，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0011] 所述缓冲液B2组成为7. 74g柠檬酸钠· 2H20、1M Na0H20-22mL、7. 07g氯化钠、 22. OOg柠檬酸· H20、25. Oml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0012] 所述缓冲液B3组成为13. 31g柠檬酸钠·2Η20、3· 74g氯化钠、12. 80g柠檬酸·Η20、 9. OOml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0013] 所述缓冲液M组成为26. 67g柠檬酸钠· 2H20、54. 35g氯化钠、6. IOg柠檬酸·Η20， 用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0014] 所述缓冲液Β5组成为8. OOg NaOH、100.0 ml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶 液。
[0015] 优选的，所述的柱温为57°C。
[0016] 优选的，所述的缓冲液Bl组成为6. 19g柠檬酸钠· 2H20、1M Na0H6-7mL、5.66g氯 化钠、19. 80g柠檬酸· H20、135. Oml乙醇、2g柠檬酸，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测定方法，实现了复方氨基酸（15) 双肽（2)注射液中甘氨酰谷氨酰胺与丙氨酸的良好分离，满足了试验对样品不同组分的分 离度的要求，实现了对样品中14中氨基酸和1种双肽含量的准确测定。
【附图说明】
[0019] 附图1为本发明实施例所得到的分离图谱。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的【具体实施方式】如下，分离图谱如图1所示：
[0021] 采用日立L-8900氨基酸分析仪
[0022] 试验样品：复方氨基酸（15)双肽（2)注射液（华仁药业股份有限公司生产）
[0023] 对照品：来源中检所，批号140624-200805,纯度100% ;
[0024] 柱压：泵1的柱压为IlMpa左右，泵2柱压为2. OMpa ;
[0025] 上样量：10 μ L
[0026] 采用离子交换树脂柱（购自日立），柱温57°C，流量为0.4ml/min，检测波长是 570nm和440nm，流动相是由缓冲液B1、B2、B3、B4、B5组成，洗脱时间为60分钟，0-2. 5分钟 采用100%的Bl进行洗脱，2. 6-6分钟采用100%的B2进行洗脱，6. 1-13. 8分钟采用100% 的B3进行洗脱，13. 9-29. 0分钟采用100 %的M进行洗脱，29. 1-33分钟采用100 %的B5 进行洗脱，33. 1-34. 0分钟采用100%的B2进行洗脱，34. 1-53分钟采用100%的Bl进行洗 脱；
[0027] 表1 :洗脱体系
[0029] 注：表中的％指体积百分比。
[0030] 所述缓冲液81组成为6.198柠檬酸钠*2!120、11似0册-71^、5.668氯化钠、19.8(^ 柠檬酸· H20、135. Oml乙醇、2g柠檬酸，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0031] 所述缓冲液B2组成为7. 74g柠檬酸钠· 2H20、1M Na0H20-22mL、7. 07g氯化钠、 22. OOg柠檬酸· H20、25. Oml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0032] 所述缓冲液B3组成为13. 31g柠檬酸钠·2Η20、3· 74g氯化钠、12. 80g柠檬酸·Η20、 9. OOml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0033] 所述缓冲液M组成为26. 67g柠檬酸钠· 2H20、54. 35g氯化钠、6. IOg柠檬酸·Η20， 用蒸馏水将其配制成1000 mL溶液；
[0034] 所述缓冲液Β5组成为8. OOg NaOH、100.0 ml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000 mL溶 液。
[0035] 表2 :缓冲液的配制表
[0037] 结果如图1所示，复方氨基酸（15)双肽（2)注射液中甘氨酰谷氨酰胺与丙氨酸的 良好分离，满足了试验对样品不同组分的分离度的要求，实现了对样品中14中氨基酸和1 种双肽含量的准确测定。
[0038] 试验例：
[0039] 试验针对缓冲液的pH值、缓冲液的变换时间以及分离柱的柱温等条件进行了一 系列的试验，结果发现分离柱柱温在57°C时，分离效果最佳，如表3。
[0040] 表3 :柱温对分离度影响
[0042] 在如表1的缓冲体系的前提下，向1000 mL中的缓冲液Bl中分别加入柠檬酸、马来 酸、富马酸和维生素 C等缓冲盐，在1000 mL的缓冲液Bl中加入2g量的柠檬酸的情况下，样 品中个组分的分离情况最好，其他缓冲盐，结果均不理想。
[0043] 试验过程中，在1000 mL的缓冲液Bl中加入马来酸适量，超声5min，混匀，经 0. 45 μ m滤膜过滤处理，待用。加入不同量的马来酸后，样品组分中各物质的分离情况如下 表所示，部分组分的分离结果不理想，如表4。
[0044] 表4 :缓冲液Bl中加入马来酸对分离度的影响
[0046] 在1000 mL的缓冲液BI中加入富马酸适量，超声5min，混匀，经0. 45 μ m滤膜过滤 处理，待用。加入不同量的富马酸后，样品组分中各物质的分离情况如下表所示，部分组分 的分离结果仍不理想，同时采用该条件时，分离柱的柱压力有升高趋势（如表5)。表5 :缓 冲液Bl中加入富马酸对分离度的影响
[0047]
[0048] 在1000 mL的缓冲液BI中加入维生素 C适量，超声5min，混匀，经0. 45 μ m滤膜过 滤处理，待用。加入不同量的马来酸后，样品组分中各物质的分离情况如下表所示，部分组 分的分离结果仍不理想，且样品结果的重现性较差（如表6)。
[0049] 表6 :缓冲液Bl中加入维生素 C对分离度的影响
[0050]
[0051] 在1000 mL的缓冲液BI中加入2g量的柠檬酸，超声5min，混匀，经0· 45 μ m滤膜 过滤处理，待用。通过改变缓冲液Bl中柠檬酸的量，从而使得缓冲液Bl的pH值有所改变， 样品组分中各物质的分离情况如下表所示，该条件下样品组分中的甘氨酰-谷氨酰胺和丙 氨酸的分离度良好，同时其他组分之间的分离情况也很好，满足试验对样品分离度的要求 (如表7)。
[0052] 表7 :缓冲液Bl中加入柠檬酸对分离度的影响
【主权项】
1. 一种复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测定方法，其特征在于：采用离子交换树 脂柱，柱温52-62°C，流量为0· 4ml/min，检测波长是570nm和440nm，流动相是由缓冲液B1、 B2、B3、B4、B5、B6组成，洗脱时间为60分钟，0-2. 5分钟采用100%的B1进行洗脱，2. 6-6分 钟采用100%的B2进行洗脱，6. 1-13. 8分钟采用100%的B3进行洗脱，13. 9-29. 0分钟采用 100%的Μ进行洗脱，29. 1-33分钟采用100%的B5进行洗脱，33. 1-34. 0分钟采用100%的 Β2进行洗脱，34. 1-53分钟采用100%的Β1进行洗脱； 所述缓冲液Β1组成为6. 19g柠檬酸钠· 2Η20、1ΜNaOH6-7mL、5. 66g氯化钠、19. 80g柠 檬酸·H20、135. 0ml乙醇、l-3g柠檬酸，用蒸馏水将其配制成1000mL溶液； 所述缓冲液B2组成为7. 74g柠檬酸钠·2H20、1MNaOH20-22mL、7. 07g氯化钠、22. 00g柠檬酸·H20、25. 0ml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000mL溶液； 所述缓冲液B3组成为13. 31g柠檬酸钠· 2H20、3. 74g氯化钠、12. 80g柠檬酸·H20、 9. 00ml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000mL溶液； 所述缓冲液Μ组成为26. 67g柠檬酸钠· 2H20、54. 35g氯化钠、6. 10g柠檬酸·H20，用 蒸馏水将其配制成l〇〇〇mL溶液； 所述缓冲液B5组成为8. 00gNaOH、100. 0ml乙醇，用蒸馏水将其配制成1000mL溶液。2. 根据权利要求1所述的复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测定方法，其特征在于： 所述的柱温为57°C。3. 根据权利要求1所述的复方氨基酸（15)双肽（2)注射液含量测定方法，其特征在于 所述的缓冲液B1组成为6. 19g柠檬酸钠·2H20、1MNaOH6-7mL、5. 66g氯化钠、19. 80g柠檬 酸·H20、135. 0ml乙醇、2g柠檬酸，用蒸馏水将其配制成1000mL溶液。
【专利摘要】本发明涉及药品生产领域，具体涉及一种复方氨基酸（15）双肽（2）注射液含量测定方法，采用离子交换树脂柱，柱温52-62℃，流量为0.4ml/min，检测波长是570nm和440nm，流动相是由缓冲液B1、B2、B3、B4、B5组成，洗脱时间为60分钟，0-2.5分钟采用100%的B1进行洗脱，2.6-5分钟采用100%的B2进行洗脱，6.1-13.8分钟采用100%的B3进行洗脱，13.9-29.0分钟采用100%的B4进行洗脱，29.1-33分钟采用100%的B5进行洗脱，33.1-34.0分钟采用100%的B2进行洗脱，34.1-53分钟采用100%的B1进行洗脱。本发明含量测定方法，实现了复方氨基酸（15）双肽（2）注射液中甘氨酰谷氨酰胺与丙氨酸的良好分离，满足了试验对样品不同组分的分离度的要求，实现了对样品中14中氨基酸和1种双肽含量的准确测定。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105319282
【申请号】CN201410279676
【发明人】于杰, 邹珊珊, 韩瑶
【申请人】华仁药业股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年6月20日