分析液滴内容物的方法及相关装置与流程
本发明涉及一种分析液滴内容物的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供包含于载流体中的多个液滴，至少一个所述液滴包括颗粒的至少一个聚集体，所述聚集体限定沿着主轴线的细长物体，至少一些所述液滴包含能够附着在聚集体上的至少一种靶成分。
这种方法目的在于例如对分散在液滴中的感兴趣的分子进行筛选。具体地，该方法目的在于确定或甚至选择包括特定靶成分的液滴，该靶成分可能由化学反应或生物反应得到。
具体地，液滴的测量和之后对液滴的选择可基于产物的浓度或连接活性。
背景技术：
文献wo2009/011808a1描述了一种用于测定在液滴中来附着蛋白质的活性的方法。
mazutis等人于2013年4月4日在“natureprotocols”杂志上在线发表出版物“single-cellanalysisandsortingusingdroplet-basedmicrofluidics”阐述了这一原理。
用包被抗小鼠抗体的珠粒将小鼠杂交瘤封装在滴液中。杂交瘤分泌抗体。与荧光团偶联的二抗为显示分泌的抗体的存在提供了可能性。在不存在分泌的抗体的情况下，液滴中二抗的分布是均匀的，但是在存在抗体的情况下二抗重新定位在珠粒上。
因此，该方法对于确定特定细胞的活性是非常有选择性的。
另一方面，这种方法具有多种缺点。用于使细胞和珠粒区室化的方法是随机的。可通过泊松分布法估算滴液中的珠粒数。此外，可通过独立泊松分布法估算滴液中的细胞数。调整珠粒和液滴的初始浓度，以使每个液滴具有平均一个细胞和一个珠粒。因此，对于实现的分析只有液滴的一部分是令人感兴趣的。
此外，每个液滴存在的显着尺寸的单个珠粒不利于该方法的分辨率。实际上，二抗分布在珠粒的整个表面上。因此，该方法的动态范围受限于每个珠粒可用的外表面积。
技术实现要素：
本发明的目的是提供比现有方法更可靠和更灵敏的分析方法。
为此，本发明的目的是提供一种上述类型的方法，其特征在于，所述方法包括测量步骤，所述测量步骤用于测量靶成分在聚集体上附着的物理参数特征。
根据本发明的方法可包括以下特征中的一个或几个，这些特征单独使用或根据技术上所有可能的组合来使用：
-颗粒是磁性颗粒，有利地是顺磁性颗粒，优选超顺磁性颗粒；
-提供液滴的步骤包括：
-将颗粒分散在流体质量中，用于形成液滴，然后
-以液滴形式分散所述流体质量，
-在每一液滴中形成至少一个颗粒的聚集体，所述聚集体限定沿主轴线的细长物体，分散后，颗粒的聚集体形成于每一液滴中；
-靶成分是选自由蛋白质、抗体、肽、dna或rna片段、代谢物、离子、脂质和能由细胞产生的生物分子形成的组的成分；
-至少一些液滴包括能产生靶成分的生产实体，生产实体优选选自由细胞或体外表达系统构成的组；
-所述测量步骤包括在位于所述液滴中的多个点中局部测量所述物理参数，所述测量步骤优选包括确定所述液滴内测量的值的积分；
-该方法包括在测量步骤之前，沿检测轴线定向聚集体的主轴线的步骤；
-该方法包括多个测量步骤，具有用于为每次测量，沿不同的检测轴线定向聚集体的主轴线的步骤；
-测量步骤在不存在任何液滴循环的微流体腔室中进行；
-所述方法包括：
-提供设备，所述设备包括用于使液滴进入循环的组件和检测区域；
-朝检测区域传送液滴，在检测区域内进行液滴内的测量；
-所述方法包括：
-提供设备，所述设备包括用于使液滴进入循环的组件和多个分类区域，以及用于将液滴或液滴的一部分选择性地导向分类区域的构件，
-决定所述液滴或所述液滴的一部分进行分类，所述决定由从多个分类区域中选择性地选择分类区域组成，
-朝决定步骤期间所选择的液滴的分类区域，分别传送所述液滴的部分液滴。
-至少一个液滴包括至少一种靶成分、能够与靶成分形成复合物的至少一个第一信号实体和能够与靶成分形成复合物的不同的至少一个第二信号实体，所述方法包括测量指示在聚集体上重新定位的每一信号实体浓度的信号；
-至少一个液滴包括至少一种靶成分、能与靶成分形成复合物的至少一个信号实体和能与靶成分形成复合物的至少一个定量实体，所述方法包括：
-测量在聚集体上重新定位的信号实体的浓度信号，
-测量在聚集体上重新定位的定量实体的浓度信号，
-由重新定位的信号实体信号与重新定位的定量实体信号的比值，确定靶成分与信号实体的解离常数；
-至少一些液滴包含生产实体，所述生产实体是可以产生作为靶成分的至少一种抗体细胞，所述方法包括确定由所述生产实体所产生的抗体对至少一种抗原的亲和力的步骤，该方法优选包括在确定步骤之后，对液滴进行分选的步骤；
-至少一个液滴包括至少两个不同的信号实体，所述两个不同的信号实体各自都能与聚集体上的不同靶成分形成复合物，所述方法包括测量每一重新定位的信号实体的浓度信号；
-至少一些液滴包括生产实体，所述生产实体是能产生一种或几种蛋白质类型的细胞，每种蛋白质是不同的靶成分，对信号的测量表示每一重新定位的信号实体的浓度，从而能对所述一种或几种蛋白质进行定量；
-物理参数的测量是荧光测量；
-所述液滴中的至少一个包括能够分泌所述靶成分的细胞，并且所述方法包括孵育步骤，在所述孵育步骤期间所述靶成分由所述细胞分泌到所述液滴中；
-所述滴剂的至少一个包括细胞，且所述方法包括用于细胞裂解的步骤；
-所述液滴的至少一个包括能够表达靶成分的体外翻译系统；
-该方法包括以下步骤：在所述液滴的至少一个中，在位于远离聚集体的第一点局部地测量物理参数的步骤，以及在同一液滴中的聚集体附近的第二点局部测量相同的物理参数；
-颗粒的最大维度小于液滴直径的50％
-液滴包含至少一个信号实体，并且物理参数的测量取决于信号实体在液滴的位置或相对于聚集体的位置；
-生产实体产生几种靶成分，靶成分选自由蛋白质、肽、dna或rna片段、代谢物、离子、脂质和能由细胞产生的生物分子构成的组；
-该方法包含确定生产实体的至少一个特征的步骤；
-用于在测量步骤之后进行分类的步骤；
-液滴包含超顺磁性颗粒，通过选自磁力、电场、介电电泳、电聚结或表面声的引导构件将液滴或液滴的一部分引向分类区域；
-通过磁力构件提取液滴的一部分，所提取的部分形成辅液滴并包含聚集体。
本发明的目的还在于一种用于分析液滴内容物的装置，所述装置包括：
用于提供包含于载流体中的多个液滴的组件，所述液滴中的至少一个包括颗粒的至少一个聚集体，该聚集体限定沿主轴线的细长物体，其特征在于，所述装置包括用于测量靶成分在聚集体上附着的特征物理参数的组件，
优选地，所述装置进一步包括：
用于使液滴循环的组件，
用于决定所述液滴分类的组件。
附图说明
通过参照附图，阅读下面仅作为示例给出的描述之后，将更好地理解本发明。在附图中：
-图1是根据本发明的第一分析装置的靶成分的示意图，
-图2是使用第一装置的方法步骤的示意图，
-图3至图6是在执行根据本发明的不同方法步骤期间，根据本发明的第二装置的一部分的照片，
-图7是根据本发明的第三装置的示意图，
-图8是根据本发明的第四装置的示意图，
-图9是使用第一装置的方法步骤的示意图，
-图10示出了通过该方法确定解离系数kd，
-图11和图12示出了用于产生液滴的设备，
-图13和图14示出了用于间隔开液滴并用于测量的组件，
-图15和图16示出了用于在两个维度中读取的组件，
-图17、图18和图19示出了实施例3，
-图20和图21示出了实施例4，
-图22和图23示出了实施例5，
-图24是在实施方法的步骤期间液滴的示意图，
-图25示出了实施例6，
-图26、图27和图28示出了实施例7，
-图29和图30示出了实施例8，
-图31和图32示出了实施例9，
-图33和图34示出了实施例10。
具体实施方式
图1示出了根据本发明的用于分析液滴内容物的第一装置1。
装置1包括组件4，该组件用于提供包含于载流体8中的多个液滴6，液滴6的至少一部分包括颗粒12的至少一个聚集体10，其中颗粒12的至少一个聚集体10限定主轴线x的细长物体。
装置1进一步包括用于液滴中的物理参数的测量组件14。
测量组件14例如能够在至少一个液滴中远离聚集体10的第一点16中局部测量物理参数，并且在同一液滴中位于聚集体10附近的第二点18中局部测量相同的物理参数。
装置1还包含设备20，该设备包括循环组件22、循环导管24和检测区域26。
循环组件22能够使各液滴6作为一连串连续的液滴在导管24中的载流体8中循环。
供应组件4包括加载组件28和聚集组件30。供应组件4进一步包括间隔组件(ensembled'espacement)31。
加载组件28能提供含颗粒12分散体的多个初始液滴32，至少一个初始液滴32进一步包括至少一种靶成分37。
间隔组件31能够将一系列液滴中的两个连续液滴6分开，即增加两个连续液滴之间的距离。例如，间隔组件31包含载流体8的入口。间隔组件的实施例示出在图13和图14中。
载流体8能够将一系列液滴中的两个连续液滴6分开，以防止它们的接触。或者，液滴6的分离由机械设备进行。
形成液滴6内相的流体和载流体8基本上不混溶。例如，液滴6包括水性内相，而载流体8是有机相或油相。
载流体8有利地是氟化油。
载流体8或形成液滴内相的流体有利地包括能够防止两个液滴6接触时融合的表面活性剂，例如美国专利2010/0105112中所述，或者还有来自raindancetechnologies的表面活性剂ea。
“基本上不混溶”通常是指在25℃和环境压力下测量的，形成液滴的流体在载流体8中的溶解度小于1％。
液滴6的尺寸例如在1μm至1000μm之间。
液滴6的体积有利地在0.1皮升和1微升之间。
所提供的液滴6基本上是单分散的。这意味着液滴6的多分散性小于5％。
在所示实施例中，液滴6是球形的。或者，液滴6沿导管24的循环轴线y具有细长形状。或者，液滴6是沿与循环轴线y垂直的轴线呈扁平的圆盘形。
每个初始液滴32包括基础流体、基础流体中的固体颗粒12的分散体和多个信号实体34。此外，至少一个初始液滴32包括至少一种靶成分37。
颗粒12用于形成细长形状的聚集体10。例如，颗粒12是在施加磁场时获得磁矩的超顺磁性颗粒。超顺磁性是当它们呈小粒子或纳米颗粒形式时，呈现出的铁磁性或亚铁磁性材料的行为。在足够小尺寸的粒子中，磁化可在温度影响下自发地反转。术语“磁性颗粒”在文中表示超顺磁性颗粒。
磁性颗粒12例如选自dynal(lifetechnologies)或ademtech或miltenyi提供的颗粒。
颗粒12例如是纳米级的。因此，它们的最大维度小于1μm，例如在50nm和1000nm之间。颗粒12有利地基本上是单分散的。例如，颗粒12的最大维度之间的差异严格地小于10％。选择每个液滴6中的颗粒12的尺寸和数量，以形成所需数量的聚集体。颗粒12最大维度的尺寸小于液滴6直径的50％。
颗粒12的浓度允许胶体稳定性。
每个液滴6中的颗粒12的浓度使得颗粒12占据液滴6的体积的0.1％至5％，例如1.7％。
在一个例子中，33皮升的每个液滴6平均包含500个直径为300nm的颗粒12。
颗粒12最初在初始液滴32中形成均匀的分散体。它们基本均匀地分布在初始液滴32的体积中。因此，颗粒12的浓度在整个初始液滴32中是均匀的。
颗粒12有利地具有允许生物分子偶联的表面，由表面材料组成。例如，颗粒12包覆具有cooh或nh2官能团的聚合物。
有利的是，该表面材料还为限制颗粒12在液滴中的自发聚集提供了可能性。
此外，例如通过聚集体中的珠粒材料与其相邻体材料之间的非特异键，其可以有利地促进聚集体10的稳定性。
颗粒12有利地被官能团化。这显然意味着颗粒12的表面材料包括官能团部分。
在示例的实施例中，官能团部分包括捕获成分36。捕获成分36例如能够捕获靶成分37。捕获成分36能够经由靶成分37间接地结合信号实体34。或者，捕获成分能够直接与信号实体34结合。
例如，颗粒12上的捕获成分36是蛋白g，靶成分37是能够结合蛋白g的抗体，信号实体34是被抗体识别的抗原，抗原能够结合抗体。
聚集组件30能够沿主轴线x产生颗粒12的聚集体。
聚集组件30例如包含位于导管24两侧的两个磁体38。磁场不与循环轴线y平行，而有利地与循环轴线y垂直。聚集组件30允许在每个液滴6中形成细长的聚集体。
在一个实施例中，磁体38是永磁体。
或者，聚集组件30包含非永磁体。
或者，聚集组件30能够从活动模式切换到非活动模式，以便仅在一些液滴中产生细长的聚集体10。
颗粒12的每个聚集体10例如包含沿主轴线x方向的柱形物。柱形物的高度有利地在液滴6直径的50％至100％之间。其宽度例如小于其高度的60％。
此外，聚集组件30例如能使聚集体沿着优先轴线定向。在示例的实施例中，聚集体12的轴线x与循环导管24中的液滴6的循环轴线y垂直。
测量组件14例如包括激光线，该激光线能沿着沿轴线x'延伸的线光学测量荧光强度，其中轴线x'垂直于循环轴线y或相对于循环轴线y倾斜。
测量组件14能够在检测区域26中液滴内进行测量。
激光线的轴线x'有利地平行于检测区域26中的聚集体的轴线x。
当载流体8的流速恒定时，作为由激光线获得的信号的时间函数，测量对应于对通过激光线前部的液滴6进行空间扫描。这可以连续地假设几个测量点，尤其是位于远离聚集体10的至少一个第一测量点16和位于聚集体10附近更靠近聚集体10的第二测量点18。
实际上，在液滴6朝测量组件14逐渐通过期间，在液滴6的纵向维度上取多个连续的测量点。
在图1和图2示例的实施例中，信号实体34是发荧光的。
循环导管24用于允许液滴6、液滴32沿循环方向上的循环轴线y，从供应组件4循环到测量组件14。
循环导管24有利地具有小于或等于1mm的内径。
循环导管24沿循环轴线y延长。循环导管24具有圆形轮廓的横截面，例如圆形或椭圆形，或为多边形导管，具有诸如矩形轮廓。
例如，循环导管24限定为半透明材料，允许通过测量组件14来测量光学参数。或者，循环导管24在检测区域26中限定有至少一个透明测量窗口。
循环导管24的壁不能渗透载流体8。
例如，循环导管24被限定在内径有利地小于1mm的毛细管中。或者，循环导管24被限定在微流体芯片中。
液滴的循环组件22用于使液滴6、液滴32沿循环方向一个接一个地在导管24中移动。
循环组件22例如包括注射泵，该注射泵可向载流体8施加受控流速。或者，循环组件22包括压力控制器。
现在将描述应用于第一装置1中的根据本发明的第一分析方法。
提供如前所述的装置1。在载流体8中制备如上所述的初始液滴32。
优选地，颗粒12均匀分散在每个初始液滴32中。考虑到单个颗粒12具有比初始液滴32小的尺寸，每个初始液滴32包含大量的单个颗粒12，例如大于10个。获得没有任何颗粒12的初始液滴32的概率非常低，甚至为零。
优选地，靶成分37和信号实体34均匀地分散在每个初始液滴32中。
在初始液滴32内，在具有特定亲和性的成分之间形成键。
在一个实施例中，每个靶成分37结合信号实体34且结合捕获成分36。信号实体34因此被重新定位在颗粒12上。
在下文中，“重新定位”的实体是指结合聚集体10的实体。
通过循环组件22，将初始液滴32与导管24中的载流体8一起放入循环中。
朝聚集组件30引导至少一个初始液滴32。通过聚集组件30在初始液滴32中形成颗粒12的聚集体10，该颗粒12的聚集体10限定沿着主轴线x的细长物体。
优选地，当颗粒12是磁性颗粒时，在它们通过聚集组件30的每个磁体38的前部期间，颗粒12沿主轴线x对齐。
朝检测区域26传送含细长物体的液滴6。通过测量组件14，在至少一个液滴6中的至少一个第一点16中局部测量物理参数。
在具体应用中，通过测量组件14在至少一个液滴6中的至少一个第一点16中局部测量物理参数，并且通过测量组件14在同一液滴6中的聚集体10附近的至少一个第二点18中局部测量相同的物理参数。
图2示出了针对不同液滴6获得的不同测量结果。该曲线图示出了作为时间函数，通过激光线测量的荧光强度。
在信号实体34的波长特征的范围内测量荧光强度。在实施例中，在颗粒12的波长特征的范围内进一步测量荧光强度，颗粒12是发荧光的。因此聚集体10更容易定位。
针对不同的液滴6，在图2中以虚线示出了荧光强度40，其对应于在激光线上测量的信号实体34的荧光。
针对不同的液滴6，在图2中以实线示出了荧光强度41，其对应于颗粒12的荧光。
测量步骤包含局部确定位于液滴中的多个点中的物理参数。它还有利地包括多个点中的测量值的累加，例如确定滴液6内的测量值的积分。
示出的第一液滴42是不同的信号实体34还未重新定位在颗粒12上的液滴6。液滴6内信号实体34的分布是均匀的。测量的荧光强度信号为平稳期44。
示出的第二液滴48是部分信号实体34已被重新定位在颗粒12上的液滴6。实际上，这些信号实体34结合由捕获成分36捕获的靶成分37。因此，聚集体10附近的荧光强度比液滴6的其余部分更为显著。测量的荧光强度信号除稳定期52之外还具有峰50。
第二液滴48的平稳期52的高度小于第一液滴42的平稳期44的高度，因为更少的信号34自由地远离聚集体10。
示出的第三液滴56是更显著比例的信号实体34已被重新定位在聚集体上的液滴。荧光强度信号具有峰58和平稳期59。所测量的峰58的高度大于在第二液滴48中测量的峰50的高度，因为更多的信号实体34被颗粒12捕获并因此位于聚集体10附近。
图9示出了对用于估算重新定位的信号实体34浓度的有用参数的选择。
在示出了信号s随时间t变化的图9中，看到三个液滴含具有较高信号峰的一个(左侧和右侧)或两个(聚集体)。有用的参数可以是信号的最大值(表示为max)，即相对于给定阈值的信号积分(int)。
第一种方法由通过每个液滴6中信号最大值(max)估算该浓度，即重新定位在聚集体上的信号峰的高度组成。
第二种方法更精确，例如如图9所示，其由计算每个液滴6的超过用户所设阈值的信号积分(int)组成。如将在实施例3中阐明的，这种方法可证明对于限制信号的离差是更有趣的。
这些信号处理方法都可以实时地进行。
可应用其他方法，例如将这些方式组合，用于例如测量重新定位的和非重新定位的信号实体34。
本发明还允许测量液滴6中的靶成分37的浓度。
在这种情况下，简单的一个例子是：
-捕获成分36具有足够的量并且对靶成分37具有足够的亲和力，以便在聚集体上捕获至少大于90％的靶成分，有利地捕获全部；
-信号实体34的浓度大于靶成分37的浓度，并且信号实体34和靶成分37之间的解离常数kd有利地以大于10的因数小于靶成分37的浓度。对于如实施例5所示的，在使用优化的剂量试剂，如具有次纳摩尔kd的单克隆抗体时，和当想要检测大于1纳摩尔的浓度的靶成分37时，这是通常的情况。
“纳摩尔”是指等于1纳摩尔/l。
在这些具体条件下，每个靶成分37的存在引起捕获成分36-靶成分37-信号实体34复合物的形成。因此，靶成分37的浓度与重新定位在聚集体10上的信号实体34的信号成比例。通过调整捕获成分36或信号实体34对于靶成分37的浓度和亲和力，其它条件可以实现定量，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。
图3至图6示出了根据本发明的第二装置60的一部分。
该第二装置60与第一装置1的不同之处在于，装置20包括腔室62。腔室62包含多个循环通道64和多个分离垫66。
其他的腔室也是可能的。在另一个选择中，腔室不包括文献pct/fr2009/051396中所描述的，和由图15和图16所示的分离垫。
腔室62用于在聚集步骤或定向步骤期间和在测量步骤期间，将多个滴液6存储在载流体8中。
第二装置60的测量组件与第一装置1的测量组件14的不同之处在于，它能够同时测量存在于腔室62中的几个液滴6上的物理参数。
图3示出了含有在载流体8中的初始液滴32的腔室62。磁性颗粒12的分散体是可见的。
图4示出了在液滴中形成聚集体10之后的同一腔室62。在每个液滴6中形成多个细长的聚集体。
图5示出了在相同装置60中具有细长的聚集体10的多个液滴6。已经调节了液滴6的性质和数量，使得每个液滴中仅存在一个细长的聚集体10。每个液滴6存在一个聚集体10有利于测量。
图6示出了在沿相同检测轴线d定向聚集体之后的同一腔室62。
根据本发明的第二装置60的分析方法与先前描述的方法的不同之处在于，例如通过同时在整个腔室62中进行测量，而不是使液滴6在检测器前循环，同时对多个液滴6进行测量，。
该方法的不同之处还在于，其包括在测量步骤之前，沿检测轴线d定向聚集体10的主轴线x的步骤。
有利地，可以通过施加可变方向的磁场使检测轴线倍增。该方法具有能区分液滴的其他非磁性物体的聚集体10，或者减少寄生信号的优点。例如，可降低背景荧光噪声。例如，沿不同轴线的检测可以区分信号实体34在聚集体10上的重新定位，和信号实体34在液滴6的另一物体(例如细胞)上的重新定位。
该想法的实现由以下组成：施加磁场b1，用于使聚集体10的主轴线x沿第一方向d1对齐，然后施加垂直于b1的磁场b2，以使聚集体10的主轴线x沿垂直于d1的第二方向d2对齐。
图7中示出了根据本发明的第三装置70。
该第三装置70与第一装置1的不同之处在于它还包括分类组件72。
此外，第三装置70与第一装置1的不同之处在于，加载组件28包括内相输入区域74，和载流体输入区域76，和汇合区域78。加载组件28还包括孵育区域79。
内相输入区域74包含第一输入导管80、第二输入导管82和汇合流导管84。
第一输入导管80用于引入第一流体质量86，该第一流体质量86旨在形成液滴的内相的一部分。在实施例中，内部的第一流体质量包含颗粒12和多个信号实体34。
第二输入导管82用于引入第二流体质量88，该第二流体质量88旨在形成液滴的内相的一部分。在实施例中，内部第二流体质量包含靶成分37的生产实体90的悬浮液。生产实体90例如是细胞90。
细胞90有利地是能够分泌靶成分37的细胞。具体地，特定的细胞90是分泌抗体的细胞，如杂交瘤或浆细胞。分泌的抗体被颗粒12的捕获成分36和信号实体34识别。
在液滴6中存在这些靶成分37能使信号实体34在聚集体10上重新定位。
第二流体质量中的细胞90的浓度有利地使得相当大比例的液滴仅含有一个细胞90，例如大于10％的液滴含有细胞90。
汇合流导管84允许要形成内相的两个流体质量86、88进行分布。
载流体输入区域76用于输入载流体8。在所示实施例中，载流体8通过两个输入导管92进入。
汇合区域78连接载流体输入区域76和内相输入区域74。具体地，汇合区域连接汇合流导管84与载流体输入管道92。
汇合区域78能够形成初始液滴32。这里所示的汇合区域78是流体动力学聚集汇合处。流体动力学聚集汇合处的实施例在图11和图12中示出。或者，初始液滴32形成于汇合处t处。
初始液滴32包括两个流体质量86、88的混合物。初始液滴32包括颗粒12和信号实体34的分散体。
至少某些初始液滴32进一步包括细胞90。
孵育区域79位于汇合区域78的下游。孵育区域旨在允许通过细胞90分泌靶成分37。或者，细胞90旨在在孵育区域79中被裂解，以便释放靶成分37。
或者，孵育在设备20外进行。
第三装置70的不同之处在于，设备20进一步包括多个分类区域94、96，和用于将液滴或液滴的一部分选择性地导向分类区域94、96的构件98。
分类区域94、96位于检测区域26的下游。导管24包含在两个输出导管102、104中的分叉部100。第一分类区域94包含旨在接收第一组液滴106的第一输出导管102。第二分类区域96包含旨在接收第二组液滴108的第二输出导管104。或者，设备20根据分选标准的数量而包含更多数量的分类区域94、96。
用于选择性地引导液滴的构件98例如能够利用磁力，将一个液滴6导向分类区域94、96。
或者，利用电极引导液滴6。
例如，通过介电电泳，通过具有流动的电聚结或通过表面声波(saw)，将液滴导向分类区域。
现在将描述根据本发明的使用第三装置70的分析方法。
提供如前所述的装置70。制备磁性颗粒12和信号实体34的悬浮液，并将其注入第一输入导管80中。
制备细胞90悬浮液，并注入第二输入导管82中。
提供载流体8，并注入用于载流体输入管道92中。
利用循环组件22，使流体86、88开始运动。初始液滴32形成于汇合区域78中。
该方法进一步包含孵育步骤，在该步骤期间，区室化的细胞90分泌靶成分37，例如待分析的蛋白质。
或者，该方法包含用于细胞裂解的步骤，以释放靶成分37，例如待在细胞质外分析的蛋白质。
这些裂解或孵育步骤在设备20的孵育区域79中进行。
或者，这些步骤在设备20之外进行。
用于形成聚集体10的步骤和测量步骤与使用第一设备1所进行的分析方法相同。
该方法的不同之处在于，测量步骤之后是分析步骤。分析步骤可以根据预定标准确定组106、108中的哪一组属于液滴6，并且在测量步骤之后对于每个液滴6生成分类决定。
根据分类决定，通过引导构件98将液滴6导向分类区域94、96之一。
在图7所示的实施例中，其中强荧光强度的信号大部分位于聚集体10附近的液滴106被引导到第一分类区域94中。第一组液滴106例如对应于图2的第三液滴56。
这些液滴106包含例如能够产生感兴趣蛋白质的细胞90。可选地回收液滴106，以便通过其它技术分析其内容物，或者以便再次培养细胞90。
液滴108被导向另一分类区域96，在液滴108中，测量到了不同信号，特别是液滴108上的基本均匀的信号。第二组液滴108例如包括：不含任何细胞90的液滴，和含有未以足够的量和质量产生蛋白质的细胞90的液滴。
图8中示出了根据本发明的第四装置120。该装置120与第一装置1的不同之处在于它进一步包括提取组件122。
提取组件122能够将液滴6分离成两个被提取的液滴124、126，主液滴124和辅液滴126，辅液滴126包括聚集体10。
有利地，颗粒12是磁性的，并且提取组件122能够施加用于实现提取的磁力。
此外，第四装置120包括在提取组件122下游的，类似于根据本发明的第三装置70的分类组件的分类组件72，其可以将辅液滴126与主液滴124分离开。
在另一种选择中，分类组件和提取组件是相同的。
这样的装置120对于利用细长的聚集体10实现选择性捕获特别有用。由颗粒12捕获的靶成分37旨在回收所选择的液滴之后被洗脱。
根据本发明的第五装置与第一装置不同之处在于它包括额外的注射设备和第二检测区域。额外的注射设备能够在检测之后将成分添加到滴液中。
额外的注射设备例如是用于使滴液融合的设备或用于微量注射的设备。
根据本发明的第五装置的分析方法包括在测量步骤之后的注射步骤，和在注射步骤之后的测量步骤。
例如，信号实体34是发荧光的，在额外的注射步骤期间，添加非荧光的额外的实体。除了荧光之外，额外的实体具有与信号实体34相同的特征。例如，额外的实体具有与信号实体34相同的对靶成分的亲和力。在第一测量步骤中，确定荧光信号实体34的捕获水平。在注射之后，额外的实体和信号实体34与聚集10附近的靶成分37竞争结合。
第二次测量在一定时间之后进行，可以确定荧光信号实体34的释放速率，从而确定信号实体34与靶成分37之间的键的解离常数k解离(koff)。
使用比液滴尺寸小的颗粒12的分散体，确保颗粒12在液滴6中均匀分布，因此在每个液滴6中准确地形成具有显著尺寸的聚集体10。
在全球范围内，该方法可以定量/量化液滴中的分析物。与mazutis等中描述的单个珠粒被封装的试验(natprot2013)相比，细长的聚集体10的形成可以获得更好的信噪比和更大的动态区间。事实上，由信号实体34产生的信号将聚集在比相同表面积的球体的宽度小的宽度上。因此，对于相同数目的重新定位的信号实体34，如图2所示峰的高度将比单个珠粒的情况高。
该方法可用于许多生物分析方法中。
根据本发明的方法可应用于许多类型的分析物，生物分子、多肽、蛋白质、代谢物、核酸、细胞、细胞器、微粒和纳米颗粒、聚合物、胶体、感染剂、食品化合物、环境样品。
根据本发明的装置可作为技术砖集成在更复杂的装置中，尤其是集成在高流量筛选设备、芯片实验室、实验室仪器中的“即时(pointofcare)”装置、机器人或其他设备中。
此外，根据本发明的方法可整合至复杂的程序中，可以进行诊断、药物发现、靶标发现、药物评价。
此外，根据本发明的微流体系统和根据本发明的方法可以组合或包括在其他类型的微流体构件中，或用于现有技术中已知的其它微流体功能中。
此外，由于所使用的样品的尺寸小，本发明对于细胞试验中的应用尤为有利，尤其是对于单细胞筛选和数字式生物学。
数字式是指生物操作是在化学或生物物体的单一拷贝上进行的，并且可分离对每个单一拷贝的操作结果，而不是在一组这样的生物体上进行操作。
生物或化学物体是指任何分子、超分子结晶、胶体、细胞、亚细胞，以非穷举的方式包括，细胞、细胞器、病毒、修饰的天然dna或人工dna、rna或其它核酸、蛋白质、糖蛋白、磷脂蛋白、人工或天然蛋白质、脂质、磷脂、有机分子、有机金属分子、大分子、分离的晶体、量子点(quantumdots)或量子点(pointsquantiques)、纳米颗粒、囊泡、微胶囊和其他实体。
本发明可进一步特别适用于与各种光学方法，特别是光学检测方法结合。
上述方法例如可用于确定溶液中靶成分37的存在，溶液中靶成分37的浓度，上述方法允许建立靶成分37与存在于颗粒12上或液滴6中的另一物质的亲合特征。
本发明还允许测量靶成分37和信号实体34之间的解离常数kd。
在这种情况下，液滴6还包括具有与信号实体34不同的荧光的定量实体。
更具体地，成分a(靶成分37)和成分b(信号实体34)之间这一对a:b的解离常数kd的定义是：kd＝[a游离][b游离]/[a:b]
其中：
[a游离]是溶液中未与b结合的a的浓度，
[b游离]是溶液中未与a结合的b的浓度，
[a:b]是溶液中的a:b复合物的浓度，其中a与b结合。
物质a的总浓度是：
[a总]＝[a游离]+[a:b]
物质b的总浓度是：
[b总]＝[b游离]+[a:b]
液滴6中信号实体34的[b总]浓度由使用者所选择且是已知的。
浓度[a总]可能事先不知道，例如当a是由封装在液滴6中的细胞90分泌的靶成分37时。
本发明可以通过信号实体34的信号测量重新定位在聚集体上的复合物[a:b]的浓度。
该测量可以允许在受控浓度条件下估算a和b之间的解离常数kd，其中a的定量是通过定量实体实现的，该定量实体为另一信号实体34。
这样做的简单的例子是以下情况：
-捕获成分36对于靶成分37具有足够的数量并且具有足够的亲和力，用于捕获90％以上的靶成分37，聚集体10上的a，有利地捕获全部，
-信号实体34的浓度大于靶成分37的浓度，
-用于定量a的定量实体的浓度大于靶成分37的浓度，并且定量实体和靶成分37之间的解离常数有利地以大于10的因数小于靶成分37的浓度。
特定条件下，每个靶成分37的存在引起形成捕获成分36-靶成分37-定量实体复合物，和/或形成由捕获成分36-靶成分37-信号实体34形成的复合物。
通过以下等式，捕获成分36-靶成分37-信号实体34复合物的数量与靶成分37对信号实体34的kd直接相关：
即
存在以下条件，其中b总被设定，a总的变化可以忽略，并且对[a:b]/a总的唯一测量可以推断kd。因此，a总<b总时，[a:b]/a总是
图10再现了[a:b]/a总比值的模拟是对于不同的a总/b总比值的logkd的函数。
通过[a:b]/a总得到kd再次显示出了对于高流量测量的明显优势，因为在上述特定情况下，这样能够通过信号实体信号34与定量实体信号的比值来估算[a:b]/a总的比值，其中信号实体信号34对应于a:b复合物，定量实体信号对应于a总。
该比值可以在液滴上实时获取，并且是根据kd分选出液滴的标准。
该方法适用于确定靶成分37针对各种信号实体34的特异性，或者被捕获成分36固定的分子或分子集合相对于各种信号实体34分子的特异性。在这种情况下，将多种信号实体34，例如标记有不同颜色荧光团的分子，注入到液滴6中。例如通过获取不同波长的荧光，可以同时记录每种信号实体34产生的信号。因此可以确定哪些信号实体34被定位在聚合体10上并对它们进行定量。
例如，捕获成分36是蛋白质g，其捕获由细胞90分泌的抗体37，并且信号实体34是不同动物物种中的同源抗原，各自标记有不同颜色的荧光团。在这个实施例中，对每种信号实体34的信号进行同时测量，可以确定作为抗体的靶成分37对动物物种是特异性的(观察到单一颜色的峰)，或不是特异性的(观察到多种颜色的峰)。
在另一个实施例中，颗粒12包被有能够捕获互补核苷酸序列的核苷酸序列。
或者，靶成分37是在液滴6中生产的蛋白，其中液滴6不包含任何细胞但包含体外翻译系统。
上述方法对标记产物的亲和力分析和定量是有用的。例如，当靶成分是包括荧光蛋白(如gfp)的融合蛋白时。
上述方法进一步允许分选、捕获和提取具有感兴趣的特征的液滴。
在一个实施例中，上述方法包括形成夹心结构，靶成分37一方面与颗粒14的捕获成分36结合，另一方面与信号实体34结合，信号实体34是发荧光的。
在一个实施例中，捕获成分36是抗体。
在一个实施例中，信号实体34是抗体。
在一个实施例中，靶成分37是蛋白质。
或者，靶成分37是抗体或抗体片段。
在一个具体的实施例中，靶成分37是抗体，捕获成分36是蛋白质g，或蛋白质a或结合抗体的另一种蛋白质，如蛋白质a/g或蛋白质l.
在一个具体的实施例中，靶成分37是抗体，捕获成分36是抗体。
在一个实施例中，靶成分37是抗体，捕获成分36是由抗体识别的抗原。
在另一实施例中，靶成分37是抗体，信号实体34是抗原。
在另一实施例中，捕获成分36由彼此不相同的多种捕获分子组成，并且靶实体37由彼此不相同的多种分子组成。
在另一实施例中，可以同时分析捕获成分36-靶成分37对或捕获成分36-靶成分37-信号实体34三联体，用于检测具有不同分子性质的几种靶成分37的存在，或用于检测和表征在同一靶成分37上不同结合位点的存在。
例如，如图24中的液滴所示，液滴包括具有不同性质的几种靶成分37a、37b和几种信号实体34a、34b，每种信号实体能够与靶成分37a、37b之一形成复合物。聚集体10的某些颗粒12包括适于捕获第一靶成分37a的捕获成分36a，其它颗粒包括适于捕获第二靶成分37b的另一捕获成分36b。
在一个实施例中，上述方法可以根据所测量的分泌抗体的永生化细胞的亲和力进行选择。然后将所选择的细胞再次投入培养。
在另一个实施例中，上述方法可以在搜索抗体的基因序列之前，根据所测量的分泌抗体的非永生化细胞的亲和力进行选择。
在另一实施例中，上述方法可以定量由血液中存在的不同类型的细胞分泌的细胞因子。
在某些应用中，颗粒12的聚集是可逆的。
在某些情况下，靶成分37的存在使得聚集不可逆，并且在聚集组件30中形成聚集体10期间进行巩固。因此，聚集体10仅在包含靶成分37的液滴6中以稳定的方式预先存在。在不含靶成分37的液滴中，只要颗粒12不进入读取区域26，颗粒12的聚集可逆性就会使聚集体10解体。在选定的磁化和流体学条件下，聚集体10仅能形成并在这种预聚集的存在下自身进行定向，这限制了通过除了经由信号实体34之外的其它方法，获取包含阈值成分37的液滴的根据图2的峰。
上述方法特别适用于通过测量所产生的抗体的亲和力，来筛选产生抗体的细胞。例如，如果细胞是可产生抗体的b细胞，则该抗体对至少一种抗原的亲和力由根据本发明的方法确定。并且根据所确定的亲和力，通过根据本发明的方法对液滴进行分选。
在另一应用中，上述方法可以通过白细胞的异质群体分析一种或多种细胞因子的分泌。例如，如果细胞是可产生一种或几种类型细胞因子的细胞，则根据本发明的方法定量细胞因子。分析结果是关于细胞状态的信息，具有潜在的诊断价值。
现在将描述上述方法的应用实施例。
以下实施例的程序包括：
-制备水溶液，这几种水溶液含有颗粒12、信号实体34和靶成分，或有利地是能够在液滴中产生靶成分的系统，在液滴生成芯片的入口处注入水溶液，
-产生包括所有测试试剂的液滴，
-孵育含有液滴的溶液，
-将液滴注入根据本发明的设备中(下面在实施例1和2中描述了两种设备)，
-测量测试结果，
-可选地，根据测量分选出液滴。
实施例1：用于产生液滴并测量1型液滴的设备
在将试剂溶液和样品溶液混合在芯片上之后，实现液滴的生产，或称为区室化。
将溶液保持在冰中直到进行区室化，以避免试剂和样品发生任何降解。
就在开始区室化之前，将试剂溶液吸入到与填充有矿物油的1mlhamilton注射器(sigmaaldrich，#330760)连接的罐中。
待筛选的样品在区室化前与工作溶液混合，然后转移到预先装有氟化油(3m，novechfe-7500)的玻璃小瓶中，并将小瓶在冰上保持在4℃。
毛细管，有利地是内径为0.3mm的ptfe(由fischer出售，#11919445)，可以将试剂溶液的小瓶和罐连接到用于形成液滴的设备。
这两种溶液都注入到用于形成液滴的芯片上，这可以产生液滴，该液滴包括相同体积的两种溶液中的每一种。
液滴的体积由使用者根据氟化油的流速来选择。有利地，液滴的体积为33皮升。氟化油是载流体8。它形成含液滴的乳液连续相。
将试验试剂溶液和待筛选的试验样品溶液以相同的流速注射到芯片中，各溶液有利地以200微升/小时的流速注射。通过标准注射泵系统(例如cetoni的泵nemesys)或通过控制压力的泵(例如由fluigent销售的系统)，来改善流速。
如图11和图12所示，液滴在流体动力学聚集汇合处产生。在此处，外相是氟化油(3m，novechfe-7500)，在其中添加有重量/体积为2％的表面活性剂(例如包含两个全氟聚醚(pfpe)尾部(分子量约为6000g/mol)和peg头部(约600g/mol)的三嵌段共聚物)。
图11和图12代表流动聚集设备，其可以在右侧的流体动力学聚集汇合处形成液滴之前，混合含磁珠的流与含样品的流，其中在含磁珠的流中，磁珠与其它试剂混合。在图11中，磁性颗粒直径的测量值为500nm，而在图12中，磁性颗粒直径的测量值为200nm。
第二步是收集步骤。小瓶允许液滴的收集，该小瓶在磁场下保持为4℃，磁场有利地由环形磁体(amazingmagneth250h-dm)产生。短的毛细管可以将小瓶连接到芯片。理想情况下，输出毛细管测量值小于20厘米，有利地小于10厘米。
将液滴设置为有利地在37℃下孵育20至90分钟并处于磁场中，时间和孵育温度取决于所进行的分析，以及生产实体90的类型和所研究的靶成分37的类型。
随后进行孵育，在4℃下转移含有乳液的小瓶，且始终保持在磁场中。
第一种类型的设备是如图1所述的根据本发明的设备。
含有液滴的小瓶连接到用于再注射的芯片，小瓶一方面连接到芯片，另一方面连接到压力系统、压力泵或注射器及其泵，从而形成循环组件22。
间隔组件31包括与芯片连接的两个油入口。这些入口旨在注入油，有利地注入氟化油，从而可以如图13所示，将乳液的液滴间隔开。
有利地，间隔开的油的流速各自设定为300微升/小时，循环组件的流速有利地设定为50微升/小时，并且可以调整液滴的流速和再注射频率，以便获得包括在250hz和1000hz之间的频率。
将有利地由k&jmagnetics，#bc14-n52提供的永磁体对38放置在芯片两侧主通道24的周围。这些磁体38旨在在液滴的再注入期间产生和定向珠粒聚集体。
生成用于控制装备，例如激光器或光电倍增管的软件，用于分析和分选出液滴。分选系统需要用于进行实时信号分析的fpga卡。
在液滴进入间隔组件之后逐个进行液滴测量，并且在经过图14所示的读取区域之后，这些液滴可被分选至期望的出口。
在分选和回收是期望的时，被分选出来的液滴和未被分选出来的乳液收集在冰上，并且按照标准程序回收液滴的内容物。
实施例2：用于测量2型液滴的设备
第二类型的测量设备是用于存储在二维平面中产生的液滴的腔室。本实施例有两个可能的替代选择来制造该腔室。
第一选择是以pdms用常规的微制造制成的腔室，如图3～图6所示，其有利地包括以规则的方式定位的柱形物以避免腔室的塌陷。
第二选择是如图14和图16所示，根据发明pct/fr2009/051396的玻璃腔室。有利地，该方式可以在不使液滴变形的情况下长时间(>1h)孵育液滴。因此，在液滴形成后，可以将其直接收集在该腔室中。
图15和图16示出了根据本发明的二维读出设备的实例，此处在玻璃腔室中，磁场由位于腔室一侧的永磁体来操控。
以下实施例通用
在以下实施例中，液滴的制备包括：
-制备在以下实施例中被称为“试剂溶液”和“待筛选的样品溶液”的两种水溶液，其中“试剂溶液”含有颗粒12、信号实体34，而“待筛选的样品溶液”含有靶成分，
-在芯片入口处注入两种水溶液，用于产生液滴，
-产生液滴，该液滴包括相同体积的两种溶液中的每一种，
-在1型设备中测量液滴，
-可选地，分选出液滴(实施例4)。
将大体地描述两种水溶液的制备，且如果需要，将在实施例中提及相对于该标准程序的差异。
a)试剂溶液的制备
该溶液中所包含的成分有利地彼此是惰性的，以避免在产生液滴之前发生试剂的聚集。
该第一水溶液包含：
-经捕获成分36(此处是蛋白质g)官能化的颗粒12，此处是胶体磁性颗粒，和
-信号实体34，此处是标记有荧光的抗原，例如标记有荧光团alexafluor488的抗原，
-可以检测液滴6的着色剂，例如磺酰罗丹明b，
-用于定量抗体的实体，此处是发荧光的，例如标记有荧光团alexafluor647的抗小鼠单克隆抗体的片段，
-工作溶液。
每一试剂的浓度将针对每一实施例进行详细说明。
将这些试剂稀释于被称为工作溶液的溶液中。所述工作溶液例如包括：
-30％v/v珀可(percoll)(由sigmaaldrich提供)，
-50mmnacl，
-25mmhepes缓冲液，ph7.4，
-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，
-thermoscientific的5％v/v血清超低igg。
使用lifetechnologies提供的补充有
在使用前，处理磁性胶体颗粒12。颗粒12是由chemicell(screenmag)或ademtech(bioadembeads)以储存溶液形式提供的颗粒。它们保留在磁性载体上以便抑制储存溶液，但它们以10％w/w悬浮在过量的pluronicf-127(sigmaaldrich)中，有利地是颗粒初始体积的10倍，并在室温下孵育30分钟。
在该处理之后，磁性胶体颗粒12在pbs中洗涤两次并悬浮在工作溶液中。
有利地，在加入测试试剂之前，将悬浮在工作溶液中的颗粒12超声处理十分钟。
荧光试剂在使用前进行处理。荧光试剂例如是信号成分34、液滴的检测着色剂和定量试剂。在抑制痕量的试剂聚集体前，荧光试剂在4℃下以至少12000g离心5分钟。
b)待筛选的样品溶液的制备。
待筛选的样品溶液包括：
-靶成分37，该靶成分37能够被捕获成分36捕获，
-或生产实体90，该生产实体90可在孵育阶段期间在液滴中合成该靶成分37。该系统可以例如是细胞，或dna或体外表达系统。在这种情况下，靶成分37不预先存在于待筛选的样品溶液中。
-工作溶液。
待使用的细胞的浓度取决于液滴所需的尺寸。有利地，每个液滴的细胞浓度为每个液滴0.3个细胞。具有33皮升液滴的乳液每毫升含有30×106以上的液滴。对于33皮升的液滴，为了使每个液滴具有0.3个细胞，待筛选的样品溶液中浓度大约需要是每毫升18×106个细胞(其相对于液滴浓缩两倍)。
应当注意，待筛选的样品溶液中的细胞浓度比最终浓度高两倍，因为两种水溶液将以50/50的比例混合在液滴中。
细胞的制备过程取决于细胞类型和实验目标。
实施例3：单克隆抗体对其抗原的亲和力的定量和测量。
在本实施例中，靶成分37是已被包含于待筛选的溶液中的抗体，本实施例不使用细胞。
本实施例的一个目的是说明使用多种颜色进行结合测试的可能性。另一个目的是证明用另一信号使重新定位信号归一化的可能性。这样通过可以使与重新定位的抗体(定量实体)的轻链结合的蛋白质的信号归一化，可以从抗原(信号实体)的定位信号来估算kd。
在本实验中，液滴测量值为33皮升。
待筛选的样品溶液含有不同浓度的抗htnfα的单克隆抗体(由sigmaaldricht6817提供)，其稀释于补充有30％v/vpercoll、0.1％v/vpluronicf-68、18mmhepes的、含2mm谷氨酰胺的rpmi-1640中。
在待筛选的样品溶液中，抗htnfα的单克隆抗体的浓度如下：0nm、10nm、25nm或50nm。
试剂溶液含有以下试剂：
-8.33％v/v磁性颗粒(ademtech#0433)
-200nm的fab-dl650抗小鼠fab'2(定量实体)，
-100nm的htnfα-af488(信号实体)，
-1μm的磺酰罗丹明b(用于标记液滴)。
由缀合有dylight-650(由abcam销售，ab98760)的山羊f(ab')2抗小鼠igg(fab')2制备抗体fab-dl650片段，使用木瓜蛋白酶
该溶液用补充有30％v/vpercoll、0.1％v/vpluronicf-68和18mmhepes的rpmi-1640+2mm谷氨酰胺补足。
这样可获得具有50nm抗原af488、100nmfab-dl650，和分别为0nm、5nm、12.5nm或25nm针对该抗原的单克隆抗体的四种不同乳液。
然后利用1型设备分析液滴。
如图17所示，本实验可示出以下可能性：在具有两种荧光读数的二级试剂的液滴中，在柱状物中的磁性颗粒上进行结合测试。此外，该方法可以通过将抗原的结合信号与参与抗原捕获的抗体数量相关联，来表征结合亲和力。实际上，可从分析中提取不依赖抗体浓度的参数。
图17示出了对于两种颜色，且对于a的量从0nm到25nm增加的一连串液滴的实时荧光测量，其中的两种颜色中，一种颜色对应于信号实体34(复合物ab，在图17中为浅灰色)，一种颜色对应于定量实体(化合物a，深灰色)。图18是对应于本实验的二维图，其中每个点是一液滴，横坐标是定量实体的颜色为荧光最大值，纵坐标是信号实体34为荧光最大值。图19表示对于同一组液滴的二维图，其中每个点的横坐标是定量实体的颜色的积分，纵坐标是信号实体34的积分。
我们看到，尽管特别是由于在全部液滴上聚集体的形状和位置的波动，数据点具有离差，但“最大”信号之间的关系是全局线性的(如r2＝0.79的线性回归所示)。我们看到，“积分”信号之间的关系由具有更好的r2(r2＝0.90)的线性回归所表征，点的离差更低，并且可以如前阐明的由ab/a比值估算kd。
实施例4：根据杂交瘤分泌的抗体的亲和力，在单个细胞的规模上分选出杂交瘤。
本实验的目的是通过使用类似于实施例3的试剂和方法，根据分泌的单克隆抗体的结合亲和力，来证明产生抗体的细胞的筛选。具体地，看到可以区分和分选出两种杂交瘤：分泌抗tnfα抗体的杂交瘤(25h12系)和分泌抗c-myc抗体的杂交瘤(9e10系)。
在这个实施例中，不仅估算了亲和力，而且根据细胞的亲和力分选出了细胞。
在本实验中，液滴测量值为33皮升。
待筛选的样品溶液含有悬浮在实施例1中描述的工作溶液中的、13.5×106个杂交瘤9e10细胞和4.5×106个杂交瘤25h12细胞。
试剂溶液含有悬浮在工作溶液中的以下试剂：
-8.33％v/v磁性颗粒(ademtech#0433)，
-100nm的抗体-dl650抗小鼠fab'2片段(定量实体)，
-100nm的htnfα-af488(信号实体)，
-2μm的磺酰罗丹明b。
这样得到具有50nm的htnfα-af488、50nm的fab-dl650和一种杂交瘤细胞的乳剂，其中一种杂交瘤细胞要么对于25h12杂交瘤来说分泌抗htnfα的抗体，要么对于9e10杂交瘤来说分泌抗c-myc的抗体。25h12细胞占细胞的25％，而9e10细胞占细胞的75％。
测量不同荧光通道的荧光，绿色用于测量抗原，红色用于测量定量实体。本实施例中的相关信号是荧光最大值。分选出并收集显示出显著绿色和红色荧光信号的液滴。
如mazutis等人(natprot2013)所述，破坏经分选并收集的液滴，并回收细胞。
然后对从被分选出来的液滴或从未被分选出来的乳液中提取的细胞溶液，进行实时pcr，并通过使用两种限制酶消化pcr产物。bamhi酶在来自9e10细胞的cdna上具有限制性位点，而kpni酶在来自25h12的cdna上具有限制性位点。通过电泳分析消化产物。在图20和图21中，可以看出该方法能使25h12细胞在通过该设备筛选后中得到富集。
因此，本发明可以以高流速的单细胞进行特定选择，其中单个细胞分泌识别信号实体的抗体。
图20和图21示出了根据本发明的杂交瘤的分选。图20描绘了二维图，其中每个点是以下液滴，该液滴的横坐标是对于信号实体颜色的荧光最大值，并且纵坐标是对于定量实体的荧光最大值。黑框表明所选的用于进行分选的取值范围。
图21示出了通过实时pcr和使用bamh1(左四栏系列)或kpn1(右四栏系列)的酶切进行的分析，该分析是对来自纯杂交瘤25h12(抗tnfα)和纯杂交瘤9e10(抗cmyc)(每系列的前两栏)，和25/75混合物(每个系列的第三栏)，最后是根据本发明使用识别tnfα的生物测试进行富集后的该混合物(在每个系列的第四栏)的dna进行的。分选后，25h12细胞富集约20倍。
实施例5：在单细胞规模上定量分泌的细胞因子。
本实施例的目的是通过夹心免疫学试验的一般方法，来证明在单细胞规模上检测和定量分泌的细胞因子的可能性。在本实施例中，捕获成分36是与链霉亲和素连接的生物素化抗体，而信号实体34是荧光检测抗体。
颗粒用链霉亲和素功能化，捕获抗体被生物素化。可以使用另一种用于将捕获抗体偶联在颗粒上的方法。
偶联方法是共价的或非共价的。重要的准则是信号实体不直接捕获在颗粒表面上。
此处显示了一种方法，其用于根据本发明并用1型的测量设备，在单细胞规模上定量γ干扰素(ifnγ)的分泌，其中γ干扰素是许多炎症或感染情况下的生物标记细胞因子。这样的生物测定可在功能免疫学测试范围内，用于测试患者的免疫系统的运行。在该测试中，刺激免疫细胞并测量它们的细胞因子分泌。
在本实施例中，我们证明了在体积测量值为25至40pl的液滴中，测定重组ifnγ的可能性。
但是，这个测定法的目的是用于单独封装的细胞，现在描述该测定法的一般步骤。
每个液滴含有免疫夹心系统所需的所有成分：夹心结构例如由包被有链霉亲和素的磁性荧光珠粒、生物素化抗体和荧光抗体组成。两种抗体抗ifnγ的两个不同的表位。
工作溶液含有一些培养基和细胞活化剂(例如分裂素、抗原)。
一旦将细胞和免疫测试夹心系统封装在液滴中，就孵育乳液。在磁场的作用下，颗粒在液滴内定向并形成柱状物。在捕获抗体通过链霉亲和素-生物素系统非共价偶联的情况下，通过位于捕获抗体上的多个生物素桥接珠粒，使柱状物中的珠粒的聚集变得不可逆。
孵育允许分泌，并可选地允许分子彼此结合。孵育后，利用根据本发明的1型设备分析液滴。
含细胞的液滴不对激活信号作出反应，且不分泌任何γ干扰素，包括全部液滴内的荧光抗体。分泌γ干扰素的液滴具有生物素化的捕获抗体-ifnγ-荧光检测抗体的夹心结构，该夹心结构重新定位在珠粒的链霉亲和素表面上。从而在这些液滴中，测量了在聚集体处重新定位的荧光。
分泌的γ干扰素越多，颗粒线上的荧光越强，荧光峰和/或荧光信号的积分越高。因此，这可以定量被刺激细胞分泌的γ干扰素。
在本实施例中，我们已经表明，可以通过使用以下试剂来实现根据本发明的用于检测和定量γ干扰素的测试：
试剂溶液：
-200nm的生物素化捕获抗体(mabtech7-b6-1)。
-200nm的标记有藻红蛋白(pe)(miltenyi45-15)的检测抗体(信号实体)
-工作溶液：30％percoll(sigma)/1％pluronicf-68(lifetech)/69％pbs(sigma)
待筛选的溶液：
-0nm或20nm或200nm的重组ifnγ1b(miltenyi)
-磁珠筛选mag/r链霉亲和素0.5μm(chemicell)(120μl乳液为20μl)。
使用类似于实施例1和3的设备，通过作用于流量以获得对于每一ifnγ浓度的不同大小(但总是通过保持水溶液两个注射流量相等以获得所需的最终浓度)，从三种待筛选的溶液产生液滴。对于0nm的ifnγ，液滴为约25pl；终浓度为10nm时液滴为31pl，终浓度为100nm时液滴为38pl。混合、孵育并分析这三种液滴群，以测量重新定位的橙色检测抗体。相同的步骤是实施例3中的步骤之一。2个荧光通道所测量的荧光：橙色为检测抗体(pmt3)，红色为珠粒(pmt4)。本实施例中所考虑的信号是荧光最大值。
我们去除了对低pmt4(珠粒)值(pmt4<0.34)的液滴的分析，这对应于磁珠线形成或定向不良的情况。
如图22和图23所示，对剩余液滴的分析表明，可以由尺寸和检测抗体信号(pmt3)来区分三种液滴群，这证明了定量液滴中ifnγ的可能性。
还显示了pmt3和pmt4上的信号之间存在线性关系，这表明每个磁珠的检测抗体量是恒定的，并且信号实体信号(pmt3)的变化与聚集体形状的变化直接相关。
图22和图23示出了根据本发明的微流体液滴中的细胞因子(γ干扰素，ifnγ)的检测和定量。在图22中，按照相对于其尺寸(宽度)的，它们的橙色(pmt3)的最大荧光表示含有0nm、10nm或100nmifnγ的三种液滴群，其中橙色(pmt3)的最大荧光对应于检测抗体。在图23中，按照相对于其红色(pmt4)的最大荧光，按照它们的橙色(pmt3)的最大荧光，示出三种液滴群，其中红色(pmt4)的最大荧光对应于珠粒。
实施例6：根据所分泌的抗体的结合活性，在单细胞规模上分选出原代细胞，更特别是淋巴细胞b(浆细胞)。
本实验的目的是通过使用类似于实施例4的试剂和方法，根据所分泌的单克隆抗体的结合活性，来证明对生产抗体的原代细胞的筛选。具体地说，已表明可以根据b淋巴细胞分泌的单克隆抗体的结合活性，对b淋巴细胞进行区分和分选。
已经预先从小鼠的脾脏中提取了b淋巴细胞，并按照标准方法(panb试剂盒ii#130-104-443，miltenyibiotec)进行了纯化。在本实施例中，捕获成分36是生物素化抗原，更特别的是“tt生物素”，“tt生物素”是利用例如由thermofisher提供的标准试剂盒的标记程序，预先经生物素功能化的蛋白质破伤风毒素(tetanustoxoid)。在本实施例中，仅观察抗体与靶抗原的结合活性，除此以外还根据其结合活性对细胞进行分选。
在本实验中，液滴测量值为40皮升。
在本实施例中，工作溶液包括：
-5％v/v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，
-25mmhepes缓冲液，ph7.4，
-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，
-1％v-v抗菌-抗真菌剂(#15240，thermofisher)。
使用lifetechnologies提供的dmem-f12补足工作溶液的体积，以达到最终体积。
生产两种乳液，并在生产之后，分析和筛选之前放在一起。多数乳液(约1000万个液滴)由待筛选的细胞以及检测试剂组成。第二乳液，所谓的阴性对照乳液，包含约100万个液滴，仅由检测试剂组成。两种乳液利用两种不同浓度的橙色荧光团、磺酰罗丹明b是可区分的。
待筛选的样品溶液含有悬浮在实施例1中描述的工作溶液中的6.6×106纯化的原代细胞。
试剂溶液含有悬浮在工作溶液中以下试剂：
-33.33％v-v磁性颗粒链霉亲和素(ademtech#0433)，
-200nm兔fab'2抗fc小鼠af647，jacksonir#315-606-146(定量实体)，
-100nmtt生物素(捕获成分36)，
-0.8μm或1.6μm或2.4μm磺酰罗丹明b(sigmaaldrich#s1402)。
这样得到具有以下物质的乳液：50nm生物素化抗原(tt生物素)、100nm兔fab'2抗fc小鼠af647，和分泌或不分泌抗抗原(破伤风类毒素)的抗体的独特的原代细胞。
测量定量实体的红色荧光。本实施例中所考虑的信号是荧光最大值。将具有大的红色荧光信号、具有正确尺寸和来源于原代细胞乳液(磺酰罗丹明b的低橙色荧光)的液滴分选出来，收集并破碎，然后如实施例4那样回收细胞。
图25表示对于在定量实体通道上测量的荧光信号，所计数的液滴数目的直方图。横坐标表示定量实体的颜色的荧光最大值，纵坐标表示在该荧光值下测量的液滴数目的底数10的对数。将获得的待筛选的原代细胞乳液的值绘制成黑色实线。将获得的阴性对照乳液的值绘制成灰色虚线。具有黑色圆点状垂直线表示阈值，选择该阈值以上的液滴用于分选。
然后，对从被分选出来的液滴所提取的细胞或未被分选出来的细胞溶液进行elispot，即在纯化之后(miltenyi试剂盒)但在微流体筛选之前。从而测试由elispot分析的细胞的抗体分泌和抗tt抗体分泌。
通过elispot，实现了对被分选出来的原代细胞，和经纯化的、但未被分选出来的原代细胞的分析。通过使用如小鼠iggelispotbasic试剂盒(mabtech#3825-2a)所述的方法，对两种标记物进行分析。第一标记物，所谓的igg，使用“总igelsipot”方法，并可以检测分泌抗体的细胞数量。第二标记物，所谓的tt，使用“抗原特异性igelsipot，protocolii”方法，并且能检测分泌具有对抗原tt的结合活性的抗体的细胞数目。
丰度(enrichissement)η根据下式计算：n+,0是分选前的阳性细胞数目，n+,1是分选后的阳性细胞数目，n-,0和n-,1分别为分选前后阴性细胞的相应值。
在一个实验中，对于5000个未被分选出来的细胞，获得对tt的51个阳性细胞和4949个阴性细胞，并且对于1000个被分选出来的细胞，获得对tt的132个阳性细胞和868个阴性细胞。
该实验显示，在分选后对tt具有结合活性的分泌细胞中丰度η因子为约15，并且这些细胞占所检测的分泌抗体的细胞的93％。
elispot测试显示，该方法允许在使用设备进行筛选之前在原代细胞中进行富集的可能性。
因此，本发明允许对高流速的单个原代细胞进行特定选择，其中单个原代细胞分泌识别捕获成分的抗体。
实施例7：在2d腔室中定量单克隆抗体并检测与其抗原的结合。
在本实施例中，靶成分37是已被包含于待筛选的溶液中的抗体，本实施例不应用细胞。
本实施例的目的是证明，在60型设备中，可以根据针对给定抗原的单克隆抗体的浓度，测量定量反应，其中60型设备即为液滴以单层二维分布于其中的腔室。在本实施例中，信号实体是荧光抗原，更特别的是“tt-af488”，一种利用例如由thermofisher提供的标准试剂盒的标记程序，预先经荧光团alexaflour-488功能化的蛋白质破伤风毒素。在本实施例中，用于形成液滴的柱状物的磁性颗粒用捕获实体进行饱和标记，此处，捕获实体是“captureselecttm生物素抗lc-κ(鼠科)偶联物”(thermofisher#7103152500)。
在本实验中，液滴测量值为40皮升。
在本实施例中，工作溶液包括：
-5％v-v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，
-25mmhepes缓冲液，ph7.4，
-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68。
使用lifetechnologies提供的不含任何酚红的dmem-f12补足工作溶液的体积，用于达到最终体积。
试剂溶液含有悬浮在工作溶液中以下试剂：
-33.33％v-v磁性颗粒链霉亲和素(ademtech#0433)，预先用捕获实体饱和标记，
-150nm兔fab'2抗fc小鼠af647，jacksonir#315-606-146(定量实体)，
-50nm的tt-af488(捕获实体)，
-0.8μm或1.6μm或2.4μm磺酰罗丹明b(sigmaaldrich#s1402)。
这样得到具有25nm荧光抗原(tt-af488)、75nm定量实体(兔fab'2.抗fc小鼠af647)，和一定浓度范围的单克隆抗体的乳液，该单克隆抗体(tt7)具有对抗原的结合活性，且浓度范围包括以下数值：0、4.2、12.5、20.8、42(仅图s7b)，62.5、83.3、125、208、250(仅图s7b)。通过表达由brandonjdekosky等人撰写的文章中公开的序列的重组蛋白，获得称为tt7的抗tt抗体，该文章的名称为“high-throughputsequencingofthepairedhumanimmunoglobulinheavyandlightchainrepertoire”2013年发表在“naturebiotechnology”第31卷，第166至169页。
所测量的多种乳液可以通过使用一系列浓度的橙色荧光团、磺酰罗丹明b来区分。所收集的测量结果并不是同时实现的。
图26表示在本实施例中使用的第二装置60的类型的测量设备。在两个玻璃载片之间产生高度为40μm的腔室。上玻璃载片上制成入口和出口，各自均设置有标准连接器，用于将其与连接毛细管连接。
如图27所示，本实验示出以下可能性：在具有两种荧光读数的二级试剂的液滴中，对柱状物中的磁性颗粒上进行结合测试。在没有任何单克隆抗体的情况下，观察到信号实体(图27a)和定量实体(图27b)的分散的荧光。相反，在存在50nm的对抗原具有结合活性的单克隆抗体(tt7)的情况下，观察到信号实体(图27c)和定量实体(图27d)的荧光的重新定位。
图28是滴定曲线，表示根据靶成分(抗体tt7)的纳摩尔浓度，定量实体(图28a)和信号实体(图28b)的重新定位的信号与分散信号的比值。
实施例8：在2d腔室中测量单克隆抗体对其抗原的亲和力
除了测量几种不同的靶成分37之外，本实施例在各方面与实施例7类似，其中靶成分37代表对于抗原的亲和力范围。
本实施例的目的是证明，在60型设备中，可以测量单克隆抗体针对给定抗原的亲和力，其中60型设备即为液滴以单层二维分布于其中的腔室。
根据测量与珠粒柱上的固定化抗体结合的荧光抗原的浓度，并且根据同时测量珠粒柱上所捕获的抗体的浓度，来估算解离常数kd。
通过表达由brandonjdekosky等人撰写的文章中公开的序列的重组蛋白，获得称为tt4、tt7和tt10的抗tt的抗体，该文章名称为“high-throughputsequencingofthepairedhumanimmunoglobulinheavyandlightchainrepertoire”2013年发表在“naturebiotechnology”第31卷，第166至169页。
在几种不同的乳液中，使用不同浓度的三种抗体中的每一种，以便通过线性回归，分别获得三个抗体的每一种的信号实体信号与定量实体信号的比值，更具体地，对于tt10抗体为0nm、5nm和10nm，对于tt4抗体为0nm、2.5nm和10nm，以及对于tt7抗体为0nm、5nm、10nm，15nm和25nm。
如图29和图30所示，本实验为示出以下可能性：将信号实体信号与定量实体信号的比值，与所选择的靶成分的解离常数相关联。
图29是表示对于本实验中测试的三种单克隆抗体tt4、tt7和tt10的图，横坐标表示定量实体的重新定位的信号和分散信号比值，纵坐标表示信号实体的重新定位的信号和分散信号比值。
图30是如下的图，其横坐标表示通过表面等离子共振(spr)获得的三种单克隆抗体的解离常数，纵坐标表示它们信号实体信号与定量实体信号的比值。
实施例9：在2d腔室中原代细胞分泌单克隆抗体的动力学和定量测量。
除了靶成分37是由原代细胞分泌的单克隆抗体且动力学测量了该分泌之外，本实施例在各方面与实施例8类似。
本实施例的一个目的是证明，对于给定抗原，可以同时测量分离于60型设备的液滴中的单原代细胞所产生的单克隆抗体的分泌动力学和亲和力。
如实施例6那样，预先从小鼠的脾脏提取b淋巴细胞，并按照标准方法(panbkitii#130-104-443，miltenyibiotec)纯化。
图31是表示在单细胞规模上，磁珠线重新定位的信号与液滴的分散信号的比值随时间(分钟)的时间依赖性变化的曲线图。此外，通过滴定曲线(实施例7的图28a)，可以将所测量的信号与单克隆抗体浓度相关联。该浓度如图30所示。
图32是表示对于n＝25的不同的原代细胞，在单细胞规模上，磁珠线重新定位的信号与液滴的分散信号的比值，随时间(分钟)的时间依赖性变化的曲线图。图32示出了原代细胞的异质性。
实施例10：液滴中磁珠的聚集体的数量、几何形状和稳定性。
在本实施例中，靶成分37是生物素化的荧光分子，例如af546-生物素(thermofisher#s11225)，其还具有信号实体的作用并已经包含于待筛选的溶液中。本实施例不应用任何细胞。
本实施例的一个目的是证明，可以通过使用横向结合分子，来稳定磁珠聚集体线，并确保其在液滴中的奇点。在本实验的情况下，我们显示使用不同浓度的多重生物素化蛋白质，生物素-bsa(sigmaaldrich#a8549)作为横向结合分子。所使用的生物素-bsa每摩尔白蛋白具有8摩尔至16摩尔生物素。
在本实验中，液滴测量值为40皮升。
在本实施例中，工作溶液包括：
-5％v/v血清超低igg(#sh30898.03，thermothermoscientific)，
-25mmhepes缓冲液，ph7.4，
-由lifetechnologies提供的0.1％v/vpluronicf-68，
-1％v-v抗菌-抗真菌剂(#15240，thermofisher)。
使用lifetechnologies提供的dmem-f12补足工作溶液的体积，以达到最终体积。
用于本实验的七种乳液含有悬浮在工作溶液中的以下试剂：
-终浓度为100nm的af546-生物素(信号实体)
-标准量33.33％v/v的一倍、两倍或三倍的磁性颗粒链霉亲和素(ademtech#0433)，
-50nm、100nm、200nm、400nm、800nm或1600nm的dy-649(dyomics)，
-生物素-bsa、磁珠的可变比率，对于0为1，对于1为5，对于1为25，或对于1为100，即生物素-bsa的浓度为0nm、0.5nm、2.5nm、5nm或15nm。
如实施例“c”所述，产生称为“vhh线”的参考乳液。在乳液“vhh线”的情况下，通过靶成分(抗体)和捕获实体(“captureselecttm生物素抗-lc-κ(鼠科)偶联物”thermofisher#7103152500)之间的横向键合，获得磁珠线的稳定性，因为同一靶成分(抗体)可结合两个捕获实体。
图33是表示根据不同的实验条件的磁珠线的格式比的图，并且通过显微镜图像示出每种情况。
图34是表示根据不同的实验条件的奇点或多个磁珠线的图。
如图33和图34所示，本实验示出，可以稳定每个液滴磁珠线数目和几何形状。
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