检测ApoC3蛋白含量的试剂在制备诊断和预测胰岛素抵抗型PCOS的试剂盒中的应用的制作方法

：本发明属于胰岛素抵抗型PCOS诊断和预测领域，具体涉及检测ApoC3蛋白含量的试剂在制备诊断和预测胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征的试剂盒中的应用。

背景技术：
：多囊卵巢综合征(PolycysticOvarySyndrome,PCOS)是一种复杂的、多因性的内分泌紊乱的代谢性疾病，其发病机制复杂，自1935年Stein和Leventhal首次报道PCOS以来，科学家们已对这一疾病进行了近80年的潜心研究，但疾病的发病机制尚不明确。按照2004年修正版鹿特丹诊断标准，PCOS的发病率可达到15％-20％。PCOS患者胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)的发病率为50％-70％，IR与月经不规则相关。PCOS患者不仅表现为月经异常、生育问题，还可能存在远期并发症的风险。研究认为，部分体型偏瘦的PCOS患者也会发生IR。高胰岛素血症可能在心血管疾病方面发挥了重要的调节作用。最近的一项荟萃分析发现，无论年龄和体重是否匹配，PCOS患者更易发生的糖代谢异常和2型糖尿病。PCOS合并妊娠糖尿病患者似乎有着持续的糖代谢异常的风险和其一级亲属的糖耐量异常和糖尿病的风险增高。尽早识别PCOS合并IR患者，及时治疗，可能对延缓疾病的远期并发症的发生有着重要的作用。目前，IR的检测方法有多种，高胰岛素正葡萄糖钳夹技术是由DeFromzo1979年创立，是可定量测定IR的“金标准”，但其操作复杂、费用昂贵。Bergman提出的微小模型，与高胰岛素正葡萄糖钳夹技术一样，因昂贵，复杂费时，难以在群体研究中使用。空腹胰岛素是一种与高胰岛素正葡萄糖钳夹技术测定的M值密切相关的胰岛素抵抗指数，但因该法在B细胞功能失代偿的情况下，会将胰岛素缺乏误判为胰岛素敏感，只适用于非糖尿病人群。大量病例的前瞻性研究发现稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与高胰岛素正葡萄糖钳夹技术有很好的相关性；李光伟指数诊断价值与HOMA-IR相似；Composite指数和Cederholm指数对于胰岛素敏感性的评价优于HOMA-IR，但对于临床表型多样的人群，其肝脏与外周组织胰岛素敏感性相似，以上三者均适用于正常糖耐量、空腹血糖受损及糖尿病患者，HOMA-IR更为简单，但敏感性稍差。对于PCOS患者合并IR的诊断，有必要寻找一种血清标志物，联合诊断胰岛素抵抗型PCOS，增加敏感性，尽早治疗，改善疾病的预后及转归。

技术实现要素：
：本发明的目的是提供检测ApoC3蛋白含量的试剂在制备诊断和预测胰岛素抵抗型PCOS的试剂盒中的应用。本文对纳入的研究人群，按照HOMA-IR分为两组，分析PCOS-IR组和PCOS-NIR组患者临床及代谢特征，发现PCOS-IR组患者TCH、LDL-C、FPG、UA明显高于PCOS-NIR组，差异具有统计学意义(P<0.01)。PCOS-IR组TG(Z＝-5.73，P<0.001)、3hBG(Z＝-2.70，P＝0.007)表达水平均高于PCOS-NIR组。两组HDL-C、CRP、1hBG、2hBG无统计学差异(P>0.05)(见表2)。本研究人群中PCOS-IR组血脂异常者72.62％、IFG(4.8％)、IGT(67.9％)，较PCOS-NIR均具有统计学意义(P<0.05)(见表1-2)。胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征患者存在更为严重的血糖、血脂及尿酸的代谢紊乱。然后基于DIGE-MALDI-TOF/TOF-生物信息学的差异蛋白质组学技术平台，从蛋白质组学角度寻找二者血清差异蛋白，采用Westernblot对二者差异表达蛋白进行验证，并挑选一种差异蛋白apoC3行ELISA法，进一步研究差异蛋白apoC3的浓度，PCOS-IR组(n＝80)血清中ApoC3的水平为10.26±3.02ng/mL，PCOS-NIR组(n＝80)血清中ApoC3的水平为9.34±2.41ng/mL，二者差异具有统计学意义(P<0.05)。根据测得的血清apoC3结果，对80例胰岛素抵抗型PCOS患者及80例非胰岛素抵抗型PCOS患者进行ROC曲线分析。结果显示，血清apoC3的ROC曲线，面积(AUC)为0.624(P＝0.007，CI:0.535-0.712)。采用约登指数(YoudenIndex)，即敏感度+特异度-1，进行评判，选出指数最大时的分界值9.315ng/mL为最佳筛选界值，此时敏感度为67.50％，特异度为61.25％。由此可见，检测ApoC3蛋白含量的试剂能在制备诊断和预测胰岛素抵抗型PCOS的试剂盒中的应用。一种诊断和预测胰岛素抵抗型PCOS的试剂盒，其特征在于，包括检测ApoC3蛋白含量的试剂。本发明提供了一种用于区分胰岛素抵抗型和非胰岛素抵抗型多囊卵巢综合症的标志物ApoC3蛋白，利用该标志物的含量可以判定是否是胰岛素抵抗型多囊卵巢综合症，从而为有效判断胰岛素抵抗型多囊卵巢综合症提供了科学依据。附图说明：图1是经过荧光差异双向凝胶电泳及TyphoonImager9400成像仪对胶进行荧光扫描，利用ImageQuantTL分析软件观察，不同染料标记的样本呈现不同颜色的图谱；图2是制备胶染色后扫描获取图像；图3和图4是胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征患者相关蛋白质WESTERNBLOT结果图；图5是PCOS患者APOC3在不同疾病状态下的浓度图；图6是血清apoC3的ROC曲线图。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：研究2012年至2014就诊于广东省妇幼保健院的218名妇科门诊，初诊为多囊卵巢综合征的育龄期未妊娠且近6个月无激素药物使用史的患者，平均年龄为(24.9±4.8)岁。按HOMA-IR≥2.69判为胰岛素抵抗，将研究人群分为PCOS胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)组(PCOS-IR)84名，PCOS非胰岛素抵抗(non-insulinresistance,NIR)组(PCOS-NIR)134名。纳入标准：参照欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学学会鹿特丹会议上修订的诊断标准，即稀发排卵或不排卵；临床或生化高雄激素表现；超声显像示单侧卵巢内可见12个直径2-9mm的卵泡。符合3项中任意2项，并排除先天性肾上腺皮质增生症、甲状腺疾病、高泌乳素血症、库欣综合征、卵巢或肾上腺肿瘤疾病者可确诊。所有纳入研究对象均签署广东省妇幼保健院伦理委员会知情同意书。对PCOS胰岛素抵抗组(PCOS-IR)和PCOS非胰岛素抵抗组(PCOS-NIR)进行TCH、LDL-C、FPG、UA、TG、3hBG、HDL-C、CRP、1hBG测试，其结果如表1所示。结果：从表1可以看出，PCOS-IR组患者TCH(胆固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、FPG(空腹血糖)、UA(尿酸)明显高于PCOS-NIR组，差异具有统计学意义(P<0.01)。PCOS-IR组TG(甘油三脂)(Z＝-5.73，P<0.001)、3hBG(3小时血糖)(Z＝-2.70，P＝0.007)表达水平均高于PCOS-NIR组。两组HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)、CRP(C反应蛋白)、1hBG(1小时血糖)、2hBG(2小时血糖)无统计学差异(P>0.05)(见表1)。本研究人群中PCOS-IR组血脂异常者占72.62％、空腹血糖受损(Impairedfastingglucose,IFG)占4.8％、糖耐量异常(impairedglucosetoleranc,IGT)占67.9％，较PCOS-NIR均具有统计学意义(P<0.05)。由此可见，胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征患者存在更为严重的血糖、血脂及尿酸的代谢紊乱。表1代谢指标分析续表1非正态分布指标用中位数表示,比较用秩和检验。PCOS血糖、血脂及尿酸异常的发生率比较：PCOS-IR组血脂异常、IFG、IGT、糖尿病及高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)的发生率，同PCOS-NIR组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)(见表2)。表2两组相关指标发生率对比P*<0.05为差异具有统计学意义。实施例2：研究对象：从218名PCOS-IR组和PCOS-NIR组患者中，分别随机挑选30名PCOS-IR和PCOS-NIR患者血清标本，用于血清差异蛋白质谱分析和Westernblot验证。血清差异蛋白质谱分析和Westernblot验证实验方法可以参考现有技术中的文献，其属于现有技术中的常规技术手段的。结果：1、经过荧光差异双向凝胶电泳及TyphoonImager9400成像仪对胶进行荧光扫描，利用ImageQuantTL分析软件观察，不同染料标记的样本呈现不同颜色的图谱，胶扫描后得到三张不同颜色的图谱，其中蓝色图谱代表内标，由Cy2标记，见图1C；绿色图谱代表PCOS-IR组蛋白，由Cy3标记，见图1A；红色图谱代表PCOS-NIR组蛋白，由Cy5标记，见图1B。三个图像重叠后能得到的图像，见图1D。将胶的Cy3和Cy5通道进行叠加，表达量接近的蛋白点，叠加后呈黄色，上调的点呈红色，下调的点呈绿色。2、制备胶染色后扫描获取图像(见图2)，使用DeCyder2D6.5差异分析软件对DIGE结果进行分析，经过胶内差异分析和胶间差异分析，PCOS-IR组和PCOS-NIR组相比较，共找出了20个差异蛋白点。3、通过mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白，去除鉴定结果相同的蛋白、表达差异变化倍数上调或下调不超过1.5倍的蛋白点及未能鉴定出的蛋白质，共鉴定出4种蛋白质，在PCOS-IR组表达均上调，具体蛋白名称可见下表3。表3在PCOS-IR组表达均上调的蛋白4、胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征患者相关蛋白质WESTERNBLOT结果结果如图3和图4所示，从图3和图4可以看出，PCOS-IR组和PCOS-NIR组apoC3蛋白(ApolipoproteinC-III，其在UniProtKB的编号为：P02656)表达水平的差异具有统计学意义(P＝0.003)。本实验DIGE-MALDI-TOF/TOF结果中(图2)，1955和2012号胶粒点差异蛋白质谱鉴定均为apoC3，增加了apoC3在两组患者表达差异的可信度，该指标有可能成为胰岛素抵抗型PCOS联合诊断指标之一。实施例3：APOC3扩大样本再验证研究对象在已收集的2013年10月至2014年10月在广东省妇幼保健院妇科门诊就诊的218例血清中，从PCOS-IR和PCOS-NIR组随机各选出80例。方法：ELISA试剂盒测定PCOS-IR和PCOS-NIR患者血清APOC3采用竞争酶免疫分析技术。样品、缓冲液和辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)孵育一个小时后，甩干孔板后洗涤五次。然后孔板与HRP酶孵育。该产品酶-底物反应形成蓝色络合物。最后，加入终止液，将溶液由蓝变成黄。用酶标仪在450nm波长下测定光密度(opticdensity,OD)值。因为样品中apoC3和apoC3-HRP共轭争夺anti-apoc3抗体结合部位，结合位点数量是有限的，越来越多的位点被样品中apoC3抗原占用，则与apoC3-HRP抗原结合的越少。OD值与apoC3的浓度成反比，通过标准曲线计算样品中apoC3浓度。结果：PCOS患者APOC3在不同疾病状态下的浓度PCOS-IR组(n＝80)血清中ApoC3的水平为10.26±3.02ng/mL，PCOS-NIR组(n＝80)血清中ApoC3的水平为9.34±2.41ng/mL，二者差异具有统计学意义(P<0.05)(表4和图5)。表480例PCOS患者血清APOC3的测定PCOS-NIR(ng/mL)PCOS-IR(ng/mL)tPApoC39.34±2.4110.26±3.022.2130.035*P*<0.05为差异具有统计学意义。根据测得的血清apoC3结果，对80例胰岛素抵抗型PCOS患者及80例非胰岛素抵抗型PCOS患者进行ROC曲线分析。结果显示，血清apoC3的ROC曲线(图6)，面积(AUC)为0.624(P＝0.007，CI:0.535-0.712)。采用约登指数(YoudenIndex)，即敏感度+特异度-1，进行评判，选出指数最大时的分界值9.315ng/mL为最佳筛选界值，此时敏感度为67.50％，特异度为61.25％。在两组患者表达差异的可信度，该指标有可能成为胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征的标志物，作为PCOS-IR的联合诊断指标之一，因此检测ApoC3蛋白的试剂能在制备诊断和预测胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征的试剂盒中的应用。