细胞色素氧化酶1A1酶检测试剂盒及其使用方法和应用与流程

本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术：

细胞色素p450(cytochromep450,p450)酶，又称混合功能氧化酶或微粒体单加氧酶，是机体内最重要的药物代谢酶。p450参与了人体胆固醇，激素，脂肪酸，维生素等内源性物质的合成和代谢，对维持人体正常生理功能起到重要作用，同时也参与了多数外来物的生物转化，大约70％的药物(包括绝大部分临床药物和杀虫剂)的主要清除是由p450介导的。细胞色素p450酶催化的i相反应是化合物在体内代谢的关键步骤，因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特征，且p450酶活性常随遗传因素、年龄、疾病状态或其它药物相互作用的影响而发生改变。药物对机体p450酶的影响，能造成临床上显著的药物相互作用。

cyp1a1是重要的i相代谢酶，主要在人肝外组织中表达，例如人肺、皮肤、小肠中表达。cyp1a1参与多种环境毒素和内源性底物的代谢，并在多种前致癌物被激活成具有遗传毒性中间体或最终致癌物的过程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因诱使肝硬化的发生(molaspectsmed.1999.20：1-137)。除此之外，cyp1a1的分布存在很大的个体差异，cyp1a1酶的表达受遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，cyp1a1在不同个体中的肝脏含量也有很大差别，其含量范围分别为：cyp1a1:0-3pmol/mg(pharmacology&therapeutics2013；138:103)。因此，开展cyp1a1酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。目前国内外制药巨头在药物开发过程中，需要在体外评估各候选新药抑制cyp1a1的能力。因此，开发高效、超灵敏、高特异性的cyp1a1活性检测方法对于临床样本中cyp1a1活性的检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞色素氧化酶1a1的荧光试剂盒及其使用方法和应用。

一种细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒，该试剂盒使用n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺作为cyp1a1探针底物(图1)，化合物可被cyp1a1特异性氧化代谢释放出去氯乙基化代谢产物，通过定量检测单位时间内其去氯乙基化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中cyp1a1酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

一种细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒，该试剂盒包括5种试剂：a液、b液、c液、d液、e液和质控标准品；

所述a液为：ph＝7.4,100mm磷酸盐缓冲液，40mmmgcl2，100mm6-磷酸葡萄糖，

所述b液为1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

所述c液为0.1～10mm的式(1)化合物的溶液，溶剂为c2h3n，

所述d液为10mmnadp⁺，

所述e液为c2h3n，

所述质控标准品为5mg/ml的cyp1a1水溶液。

保存方式：保存在－20℃冰箱里，所述a液、所述b液、所述c液和所述d液避免光照，终止液(reagentd)具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月。

一种细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒的使用方法，具体按下面步骤进行：

(1)预孵育：将待测样品与a液，b液和c液混匀，优选37℃为最优反应时间；孵育体系ph介于5.5～10.5之间，优选ph7.4为最优反应ph值，37℃孵育下孵育3～5分钟；

(2)起始反应：加入d液后混匀，37℃孵育下孵育20～120分钟；

(2)检测：加入e液终止，确保以上底物相应的o-去氯乙基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；

所述待测样品为：重组表达的细胞色素氧化酶1a1单酶、人组织制备液、各类组织细胞或其他生物体系；

一种细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒的应用，该试剂盒可用于细胞色素氧化酶1a1活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。

所述试剂盒用于细胞色素氧化酶1a1活性的快速定量检测的方法为：探针底物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺可被人细胞色素氧化酶1a1特异性氧化代谢释放出去氯乙基化代谢产物；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内去氯乙基化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中cyp1a1酶的活性。

该试剂盒用于细胞色素氧化酶1a1抑制剂的快速筛选与评估方法为：以式(1)化合物的氧化反应作为cyp1a1的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内其底物消除量或去氯乙基化产物的生成量评估该生物体系中cyp1a1的残余活性，进而实现cyp1a1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

该试剂盒检测原理是利用细胞色素氧化酶1a1能催化脱烷基化反应的特性，特异地识别与催化式(1)化合物结构中的氯乙基，在生理ph条件下催化生成相应的o-去氯乙基化产物。利用该探针反应可对多种生物体系中cyp1a1的分布和功能进行定量评价。其检测原理如图9所示。

本发明所述特异性检测细胞色素氧化酶(cyp1a1)的试剂盒的应用领域，包括但不限于重组表达的cyp1a1酶、含有cyp1a1的细胞及组织制备物等生物样品中cyp1a1活性的定量测定。

本发明提供的检测细胞色素氧化酶(cyp1a1)的试剂盒的应用，需注意所述去氯乙基化产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

本发明所提供的检测细胞色素氧化酶(cyp1a1)的试剂盒，底物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺均是荧光化合物，可采用酶标仪实现产物的快速灵敏检测。此外，该比率型特异性探针底物及相应cyp1a1活性检测过程受生物体系基质及杂质的干扰较少，可用于各种生物体系中cyp1a1酶活的定量测定。

本发明中试剂盒可用于重组细胞色素氧化酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中cyp1a1酶活的定量测定，还可用于快速筛选cyp1a1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。

选用本发明所述的细胞色素氧化酶1a1检测试剂盒及其使用方法具有以下突出优势：

(1)高特异性：1,8-萘酰亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶cyp1a1单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即o-去氯乙基化产物；

(2)廉价易得：1,8-萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行；

(3)高灵敏度：具有1,8-萘酰亚胺母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450～700nm)，且该底物及其o-去氯乙基化代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征(如图9所示)，能较好的进行区分检测，同时可通过比率型标准曲线的建立进行定量测定cyp1a1单酶的检测下限为5nm。

(4)高通量检测：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。

附图说明

图1.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的结构；

图2.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的检测流程图；

图3.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的人cyp重组单酶筛选试验结果；

图4.cyp1a1氧化代谢n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的线性反应浓度；

图5.cyp1a1的活性化学抑制实验；

图6.12例hlm对n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢图；

图7.22例肺癌和癌旁s9对n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的氧化代谢速率差异；

图8.不同浓度的tcdd诱导肿瘤细胞s9对n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的氧化代谢速率差异；

图9.cyp1a1介导n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢通路示意图；

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。细胞色素氧化酶1a1酶检测试剂盒的结构通式如图1所示，检测流程如图2所示。

实施例1.体外测定人重组cyp单酶的选择性

(1)预先准备90μlcyp代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、重组人cyp各单酶(50nm)、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入100μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)；重组人cyp1a1酶的选择性最高约是其它单酶的10倍左右(图3)。

实施例2.cyp1a1氧化代谢n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的线性反应浓度

(1)预先准备90μlcyp代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、重组人cyp各单酶(系列浓度)、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)1h后，加入100μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(3)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)；n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺能检测到5nm的cyp1a1(图4)。

实施例3.cyp1a1抑制剂的抑制能力表征

(1)预先准备cyp代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、人肝微粒体、不同cyp亚型的特异性抑制剂、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm或，于37℃条件下震荡预孵5-20分钟；

(2)向反应体系中加入20μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入200μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)；n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺在人肝微粒体中的去氯乙氧基活性能够分别被cyp酶和cyp1a1亚型特异性抑制剂abt和呋喃茶碱显著抑制，而其它cyp亚型抑制剂对其氧化反应没有显著的抑制活性，证实n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺能够特异性检测复杂生物样本的cyp1a1的活性(图5)。

实施例4.不同个体来源肝微粒体中cyp1a1的活性定量评估

(1)选取12例人肝微粒体(hlm)稀释至2.5mg/ml，准备cyp1a1代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、人肝微粒体，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入20μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入200μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到12例人肝微粒体(hlm)对n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图6)。

实施例5.不同个体来源肺癌和癌旁s9中cyp1a1的活性定量评估

(1)选取22例肺癌和其对应的癌旁组织s9，准备cyp1a1代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、人肺s9、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入20μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入200μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到22例肺癌和其对应的癌旁组织s9对n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图7)。

实施例6.肿瘤细胞中cyp1a1的活性定量评估

(1)选取被不同浓度cyp1a1诱导剂tcdd诱导的肿瘤细胞，准备cyp1a1代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、细胞匀浆、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入20μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入200μlc2h3n，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝372nm，em＝450nm)，将检测到的荧光强度代入标准曲线后得到不同浓度tcdd诱导的肿瘤细胞对n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图8)。