一种碱性紫1标准物质的制备方法与流程

本发明涉及一种碱性紫1标准物质的制备方法，属于标准品制备领域。

背景技术：

世界各国对人工合成色素的可用品种、使用量以及使用范围等都有严格的限制。2000年以来，我国共批准使用的合成色素有21种。其中，胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄、诱惑红和亮蓝等均为常用色素，其使用范围也有严格规定，如禁止用于肉类、鱼类、水果及其制品等，仅限用于饮料、配制酒、糖果、糕点和青梅等。其他国家如美国等最早先后批准使用的合成色素达24种，但至今保留仅为9种；日本及欧共体允许使用的有11种。除规定之外的所有人工合成的磺化、硝化、偶氮化染料均不允许以任何形式添加于食品中。然而，在利益的诱惑下，这些具有严重危害的添加剂常被不法分子过量添加于食品中，长期食用含有过量合成色素的食品必将严重威胁人体健康。所以研究人员开发了多种用于检测分析食品中化学合成色素含量的技术方法，对这些国家规定限量的添加剂进行定性、定量分析。然而在合成色素非法添加现象无孔不入的今天，快速、准确的检测方法必然更加能够为相关部门监管、打击不法分子提供更为及时有力的依据，同时也为人民群众的健康提供强有力的技术保障。

碱性紫1，又称甲基紫，为副品红碱的四甲基、五甲基、六甲基衍生物的混合物，系绿色发光粉末，熔点137℃。能溶于水和醇，呈紫色溶液，能溶于甘油和氯仿，但不溶于醚。碱性紫1是一种生物染色剂，酸碱指示剂，检定汞、银及锡等，密封避光保存。在COMAR数据库和国家标准物质信息服务平台数据库查询，没有碱性紫1标准物质的相关信息。鉴于此染料标准物质在食品安全领域的重要作用，发展和研制相关标准物质具有非常重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供了一种碱性紫1标准物质的制备方法，该方法制备碱性紫1标准物质易操作、简单快捷，得到的标准品纯度高。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将原料溶于有机溶剂，并采用超声辅助溶解得碱性紫1原料液，将所碱性紫1原料液经微孔滤膜过滤，调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；

(2)液相色谱制备：将所述供试品溶液注入制备色谱中分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为Venusil XBP C18(10μm,50*250mm)、SunFire C18(10μm,50*250mm)或Apollo C18(150×4.6mm,5μm)；

流动相为水：乙腈，或甲醇:0.2％TFA水＝65:35(v/v)；

流动相流速为80mL·min^-1；

洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)，或运行15min匀速洗脱；

检测波长254nm；

柱温30℃；

进样量0.1-1ml；

接收8-16分钟内最高色谱峰的馏分，置于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用氮气吹去全部液态溶剂，然后置于冻干机中冻干，冻干后的碱性紫1固体碾磨粉碎后，再次冻干得碱性紫1标准物质。

在上述方案中优选的是，步骤(1)中所述原料为工业级碱性紫染料，其中碱性紫1的含量在20％-50％。其中可能包含碱性紫1的副品红碱的四甲基、五甲基、六甲基衍生物及其氧化物、降解物、杂质等。

在上述方案中优选的是，步骤(1)中所述有机溶剂包括纯乙腈，体积百分含量为70％—90％的乙腈，体积百分含量为0—20％的甲醇，体积百分含量为0—20％的二氯甲烷，体积百分含量为0—20％的乙酸乙酯。优选为纯乙腈。

在上述方案中优选的是，步骤(1)中超声频率为20-40Hz。优选为30Hz。

步骤(1)中微孔滤膜优选为0.22μm滤膜。

步骤(1)中优选为用1mol/L的盐酸调节溶液pH至7.0。

在上述方案中优选的是，步骤(2)中色谱柱为Venusil XBP C18(10μm,50*250mm)。

在上述方案中优选的是，步骤(2)中流动相为水：乙腈。

在上述方案中优选的是，步骤(2)中洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)。

在上述方案中优选的是，步骤(2)中进样量0.1ml。

在上述方案中优选的是，步骤(3)中标准品制备：先在常温避光状态下用氮气吹去全部液态溶剂，然后置于冻干机-50℃中冻干12-24小时，冻干后的碱性紫1固体碾磨粉碎后，再次冻干12-24小时。

本发明所述的碱性紫1标准物质用于食品中非法色素添加的定性定量检测。

现在工业上主要是通过改进合成方法提高由碱性品红合成为碱性紫的收率来提高产品纯度。目前商品化碱性紫1纯度约20％-80％。

本发明的有益效果：本发明的方法制备碱性紫1标准物质纯度高，可用于食品中非法色素添加的定性定量检测。本发明的方法工艺简单、操作方便、分离速度快，制备的碱性紫1纯度高、产品纯度可达到99.3％，产品质量稳定，均匀性好，流动相可回收利用，无污染，实现清洁生产。

附图说明

图1为碱性紫1的红外光谱图；

图2为碱性紫1的紫外可见光吸收光谱图；

图3为碱性紫1的一级质谱图；

图4为碱性紫1的二级质谱图；

图5为碱性紫1的¹H-NMR谱图；

图6为碱性紫1的13C-NMR谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将含量约为20％的碱性紫1原料溶于甲醇并采用30Hz超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；；

(2)液相色谱制备：将碱性紫1供试品溶液注入制备色谱分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为SunFire C18(10μm,50*250mm)，

流动相为水：乙腈，

流动相流速为80mL·min^-1，

洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)，

检测波长254nm，

柱温30℃，

进样量0.5ml，

收集14.9min馏分接收于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入少量盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用旋转蒸发仪去全部液态溶剂，获得的碱性紫1固体纯度为97.4％。

本实施例得到的碱性紫1的红外光谱图如图1，紫外可见光吸收光谱见图2，一级质谱见图3，二级质谱见图4，¹H-NMR谱见图5(399.65MHz；0.032g:0.5ml DMSO-d6)，13C-NMR(100.54MHz；0.032g:0.5ml DMSO-d6)谱见图6。

实施例2：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将含量约为20％的碱性紫1原料溶于纯乙腈并采用30Hz超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，用1mol/L的盐酸调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；；

(2)液相色谱制备：将碱性紫1供试品溶液注入制备色谱分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为Apollo C18(150×4.6mm,5μm)；

流动相为甲醇:0.2％TFA水＝65:35(v/v)；

流速为1.0mL·min^-1；

柱温为30℃；

运行时间为15min；

检测波长为254nm；

柱温为30℃；

进样量为0.1ml，

收集8.7min馏分接收于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入少量盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用氮气吹去全部液态溶剂，然后置于冻干机-50℃中冻干24小时，冻干后的碱性紫1固体纯度为96.7％。

实施例3：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将含量约为20％的碱性紫1原料溶于纯乙腈，并采用30Hz超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，用1mol/L的盐酸调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；

(2)液相色谱制备：将碱性紫1供试品溶液注入制备色谱分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为Venusil XBP C18(10μm,50*250mm)，

流动相为水：乙腈，

流动相流速为80mL·min^-1，

洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)，

检测波长254nm，

柱温30℃，

进样量0.1ml，

收集13.6min馏分接收于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入少量盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用氮气吹去全部液态溶剂，然后置于冻干机-50℃中冻干24小时，冻干后的碱性紫1固体纯度为99.3％。

实施例4：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将含量约为20％的碱性紫1原料溶于纯乙腈，并采用30Hz超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；；

(2)液相色谱制备：将碱性紫1供试品溶液注入制备色谱分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为SunFire C18(10μm,50*250mm)，

流动相为水：乙腈，

流动相流速为80mL·min^-1，

洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)，

检测波长254nm，

柱温30℃，

进样量0.5ml，

收集14.9min馏分接收于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入少量盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用旋转蒸发仪去全部液态溶剂，获得的碱性紫1固体纯度为98.1％。

实施例5：

一种碱性紫1标准物质的制备方法，包括以下各步骤:

(1)供试品溶液的制备：将含量约为20％的碱性紫1原料溶于纯乙腈并采用30Hz超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，用1mol/L的盐酸调节溶液pH至7.0，然后抽滤获得供试品溶液；

(2)液相色谱制备：将碱性紫1供试品溶液注入制备色谱分离纯馏分，其色谱条件为：

色谱柱为Apollo C18(150×4.6mm,5μm)；

流动相为水：乙腈；

流动相流速为80mL·min^-1；

洗脱方式为梯度洗脱：梯度为0-30min，10％乙腈-90％乙腈(v/v)；

流速为80mL·min^-1；

柱温为30℃；

检测波长为254nm；

柱温30℃；

进样量0.1ml；

收集8.7min馏分接收于预先氮气填充的外壁包裹锡箔纸的棕色瓶中，然后加入少量盐酸中和至pH7；

(3)标准品制备：先在常温避光状态下用氮气吹去全部液态溶剂，然后置于冻干机-50℃中冻干24小时，冻干后的碱性紫1固体纯度为97.2％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。