本发明涉及一种制备硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米粒子复合材料及其方法，以及将该材料应用于检测癌细胞标志物(或者其他目标肿瘤细胞)的方法。
背景技术：
二氧化铈是一种重要的宽禁带稀土元素半导体材料，具有良好的光学和电学性质，在传感器等高科技领域具有广泛的应用前景。二氧化铈空心球纳米粒子因其较高的比表面积及较快的电子传输能力，是理想的光学材料。硫化镉是另外一种常用的半导体材料，具有良好的光电性质，可用于电致化学发光免疫分析之中。
癌症是威胁人类生命的重要疾病之一，而肠癌是癌症中较为常见的一种，因此如何早期检测和诊断肠癌成为全世界的研究热点之一。目前医院里面采取的检测手段多为酶联免疫分析方法，该方法通过检测肿瘤细胞标志物间接检测肿瘤细胞，因此灵敏度较低，难以早期发现并防治。国内外的科学家尝试多种方法检测癌细胞，希望实现提高灵敏度，达到早发现早治疗的目的，方法包括化学发光方法、融出伏安法和计时电流法等。然而，上述方法通常具有分析检测时间长、操作繁琐等缺点。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米粒子复合材料的制备方法以及基于该纳米复合材料的高灵敏检测癌细胞标志物的方法，该方法具有操作简单、反应速度快、效果好、选择性高和成本低等优点。重要特点是二氧化铈空心纳米球具有良好的承载能力和吸附能力，并且提供了良好的电子转移能力，为高效的生物检测奠定了基础。
本发明按照如下步骤制备硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米粒子复合材料：
（1）纳米CeO2空心球材料的合成：以水热法制备纳米CeO2空心球，1 ~1.5 mmol CeCl3·7H2O 溶解于40~50 mL 去离子水中，然后将10~15 mmol CO(NH2)2 和 100~110 mL 加入到溶液中。磁力搅拌10~20分钟之后，将溶液转移到Teflon材料的反应釜中。将反应釜置于200~220 °C 烘箱中加热18~24小时。反应完成后，将得到的纳米材料用乙醇溶液离心洗涤3~5次，最后烘干备用。
（2）硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米复合材料的合成：称取干燥的二氧化铈纳米粒子0.02~0.05克，加入到20~30 mL蒸馏水中。将该溶液进行剧烈搅拌，同时缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的硫化钠溶液1~1.5 mL；继续剧烈搅拌30~40 min之后，缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的氯化铬溶液1~1.5 mL，然后继续剧烈搅拌30~40 min。最后，停止搅拌，对产物进行离心、洗涤和烘干，备用。
本发明按照如下步骤检测癌细胞标志物：
（1）以水热法制备纳米CeO2空心球；
（2）硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米复合材料的合成：称取干燥的二氧化铈纳米粒子0.02~0.05克，加入到20~30 mL蒸馏水中。将该溶液进行剧烈搅拌，同时缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的硫化钠溶液1~1.5 mL；继续剧烈搅拌30~40 min之后，缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的氯化铬溶液1~1.5 mL，然后继续剧烈搅拌30~40 min。最后，停止搅拌，对产物进行离心、洗涤和烘干，备用。
（3）金纳米粒子的合成：将 1.00~1.5 mL 、1~2 wt.%的柠檬酸钠溶液滴加到100~150 mL、 0.01~0.02 wt.%的氯金酸的沸腾溶液中，回流搅拌反应10~30分钟后，停止加热，在密封条件下，继续搅拌至恢复到室温，备用；
（4）生物传感器的组装：将步骤（2）中得到的具有硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米粒子复合材料的ITO电极用去离子水冲洗，用氮气将该电极吹干；在其表面上滴加5~ 10微升的 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷的水溶液，置于氮气氛围中，10~30分钟后，将步骤（3）中制备好的金纳米粒子10~20微升滴加到已被APTES修饰好的ITO电极表面，置于氮气氛围内，反应0.5~1小时左右，将肿瘤细胞抗体修饰到电极的表面，置于37℃孵育箱中备用；
（5）采用电致化学发光技术对癌细胞进行检测。
本发明的方法重点在于利用水热法一步制备出二氧化铈空心球纳米材料，利用静电作用实现了纳米材料的修饰和组装，最后将合成的纳米复合材料应用于癌细胞的生物传感器的制备，实现了对肠癌细胞标志物的灵敏检测，具有操作简单、反应速度快、效果好、选择性强、成本低等优点。该方法还可以通过改变修饰的抗体种类实现对多种肠癌细胞的检测，可用于科研方面和临床医学方面，尤其是在生物分析领域，肿瘤细胞检测等方面有很强的应用前景。
附图说明
图1为肠癌细胞标志物CEA检测曲线，其中：X轴CEA浓度的对数值，Y轴电致化学发光强度值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
以肠癌细胞标志物为例，本发明的基于纳米复合阵列材料的高灵敏检测肠癌细胞的方法，包括如下步骤：
（1）纳米CeO2空心球材料的合成：以水热法制备纳米CeO2空心球，1 ~1.5 mmol CeCl3·7H2O 溶解于40~50 mL 去离子水中，然后将10~15 mmol CO(NH2)2 和 100~110 mL 加入到溶液中。磁力搅拌10~20分钟之后，将溶液转移到Teflon材料的反应釜中。将反应釜置于200~220 °C 烘箱中加热18~24小时。反应完成后，将得到的纳米材料用乙醇溶液离心洗涤3~5次，最后烘干备用。
（2）硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米复合材料的合成：称取干燥的二氧化铈纳米粒子0.02~0.05克，加入到20~30 mL蒸馏水中。将该溶液进行剧烈搅拌，同时缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的硫化钠溶液1~1.5 mL；继续剧烈搅拌30~40 min之后，缓慢滴加浓度为0.15~0.2 mol/L的氯化铬溶液1~1.5 mL，然后继续剧烈搅拌30~40 min。最后，停止搅拌，对产物进行离心、洗涤和烘干，备用。
（3）金纳米粒子的合成：先用0.45 μm的多孔滤膜将柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液过滤，然后将1.00 mL、 1% (质量浓度) 柠檬酸钠溶液与100 mL 0.01% (质量浓度) 氯金酸溶液混合于烧瓶中，回流（100℃）搅拌反应十至三十分钟后，停止加热。在密封条件下，继续搅拌至恢复到室温（25℃）, 备用。 具体回流搅拌时间取决于所需要的金纳米粒子大小。（4）生物传感器的组装：将步骤（2）中得到的具有硫化镉包覆的二氧化铈空心球纳米粒子复合材料的ITO电极用去离子水冲洗，用氮气将该电极吹干。在其表面上滴加5~ 10微升的 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷的水溶液 (APTES) (浓度为1%，体积分数)。置于氮气氛围中，十分钟后，将步骤（3）中制备好的金纳米粒子10~20微升滴加到已被APTES修饰好的ITO电极表面，置于氮气氛围内，半小时以上。将肿瘤细胞抗体（10-6 g/mL）修饰到电极的表面，置于37摄氏度孵育箱中备用。
（5）对肠癌细胞标志物的检测：采用电致化学发光技术对肠癌细胞标志物进行检测，具体检测方法如下：
利用三电极体系，包括饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，步骤2中得到的电极作为工作电极。 三只电极同时置于含有0.1 M PBS磷酸缓冲溶液 (pH 7.4)、0.05 M K2S2O8 和 0.1 M KCl的溶液中，在电压范围为0~ -1.5V之间进行扫描。在电极表面，硫化镉包覆的氧化锌能够和溶液中的K2S2O8 共反应，从而产生电致化学发光信号。
根据步骤（4）和（5），通过癌细胞标志物CEA与抗体的特异性免疫反应，可以根据抗体上结合的癌细胞标志物的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对癌细胞标志物的检测。由于癌细胞标志物CEA与抗体的结合会对电极和溶液中的电子转移产生阻碍作用，使得电致化学发光信号降低，从而实现了对癌细胞标志物CEA的定量检测。
检测机理：与抗体结合的癌细胞标志物CEA的增多，会阻碍溶液中电子与电极上纳米材料之间的传递作用，即导致电极阻抗不断增加，进而使得在同样的电流激发条件下所产生的电致化学发光的光信号减弱。也就是，电极表面上结合的癌细胞标志物的数量和电致化学发光信号降低的数值存在线性关系。依据该线性关系实现对癌细胞标志物的高灵敏检测。
基于纳米复合材料的这种检测方法能够实现对癌细胞标志物的灵敏检测，实验结果表明电致化学发光信号的强度与癌细胞的浓度的对数在0.09 pg/ml-1~1.5 ng/ml-1范围内程线性关系。根据线性关系，可以对癌细胞标志物进行定量检测（如图1所示），其灵敏度比现有方法有所提高。