本发明涉及分子印迹和电化学聚合技术领域，具体而言，涉及一种草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法。
背景技术：
是目前世界上使用的最为广泛的除草剂之一，由美国孟山都公司研制，至今已使用了近四十年。草甘膦(Glyphosate Gly)是其主要的活性成分，化学名称为N-(膦酸甲基)甘氨酸，属于氨基甲撑膦酸类含有羧基的化合物。草甘膦理化性质稳定，具有内吸传导性、高效低毒、低残留等优点，同时因为转基因作物可耐受草甘膦，草甘膦作为转基因作物的配套产品很受欢迎。自1971年研制成功以来，草甘膦的全球需求量与日俱增。虽然草甘膦的毒性较低，美国环保署(EPA)将草甘膦列为第三类有毒物质(低毒性)，但近年来由于草甘膦的残留导致植被破坏、水体污染、牲畜中毒等案件不断增加，为此世界各国纷纷对农产品中草甘膦的最大残留量(MRL)制定了严格的限量规定。草甘膦及其主要降解产物氨甲基膦酸(Aminomethyl phosphonic acid，AMPA)都具有易溶于水，难溶于一般有机溶剂，难挥发，缺少发色和荧光基团等特性，采用传统方法对其进行检测比较困难，且不能现场检测，样品前处理过程繁琐。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种草甘膦分子印迹电化学传感器及其制备方法以解决如上问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)、在石墨烯修饰电极上沉积金纳米颗粒得到石墨烯-纳米金修饰电极；
2)、在所述石墨烯-纳米金修饰电极表面原位聚合分子印迹聚合物，形成一层分子印迹膜；
所述分子印迹聚合物以吡咯为功能单体、以草甘膦为模板分子；
3)、去除草甘膦模板分子，制得所述草甘膦分子印迹电化学传感器。
基于分子印迹技术制备的分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)能够耐酸碱和有机试剂腐蚀、对目标物具有特异性识别作用。分子印迹电化学传感器是将分子印迹聚合物作为识别元件制备的具有特异选择性的仿生传感器。这种传感器兼具分子印迹技术和电化学传感技术的优点，特异性强、灵敏度高、价格低廉，设备小型化型化便于携带,能够现场快速检测。在电化学检测过程中，草甘膦分子与印迹聚合物识别位点特异性结合导致电化学探针的氧化还原峰电流发生改变，且草甘膦的吸附量与电化学探针氧化还原峰电流的改变量呈现线性关系，从而实现草甘膦的定量检测。
石墨烯(Graphene GR)材料由于其独特的二维平面结构和优异的电学性质，具有新颖的界面选择性吸附和纳米电化学响应能力；金纳米粒子(AuNPs)具有良好的电催化活性，较大的比表面积和良好的生物相容性，已被广泛用于电化学传感器作为固定载体来提高对目标分子的吸附性能和检测灵敏度。
电化学聚合是在电场作用下电解含有单体的溶液，采用电极电位作为聚合反应的引发和反应驱动力，在电极表面沉淀获得共轭高分子膜。能够用于电聚合分子印迹膜的单体种类较多，包括吡咯、邻苯二胺、苯酚、氨基苯酚等。吡咯(Py)具有良好的导电性，氧化还原性及局部交联的特性，作为功能单体可以通过掺杂或过氧化方式形成稳定性好、吸附性能强的疏松多孔结构的聚吡咯分子印迹聚合膜，具有模板分子快速固载、洗脱和传质等优点。本发明基于Py单体在聚合过程中被氧化成正电性原子团需要借助掺杂阴离子延长聚合链的理论，在一定聚合条件下，成功将草甘膦分子(Gly)掺杂于聚吡咯骨架中，形成分子印迹聚合物。
本发明首先制得石墨烯修饰电极，进一步在石墨烯修饰电极上电化学沉积金纳米颗粒得到石墨烯-纳米金修饰电极(AuNPs-GR/GCE)，接着将石墨烯-纳米金修饰电极浸入以Py为功能单体，Gly为模板分子的Britton-Robison(B-R)溶液中基于分子印迹技术，采用电化学聚合法在AuNPs-GR/GCE表面原位聚合分子印迹膜(MIPs)；最后用电化学法洗脱去除Gly模板分子，制得的三维纳米增敏的Gly分子印迹电化学传感器灵敏度高，可以有效地对草甘膦进行检测。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，所述石墨烯修饰电极由石墨烯分散液对待修饰电极进行处理后再滴加BPPF6离子液并烘干后得到；
以体积份数计，所述石墨烯分散液的成分包括BPPF6离子液3～7份、超纯水450～550份、丙酮450～550份。
BPPF6为六氟磷酸正丁基吡啶，BPPF6离子液纯度为分析纯。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，所述待修饰电极为玻碳电极。
玻碳电极导电性好，化学稳定性高，热胀系数小，质地坚硬，气密性好，电势适用范围宽，通过确定玻碳电极及其经后续的修饰方法，本发明的最佳线性范围恰好与修饰后的玻碳电极的电位窗口范围匹配，可以进一步提升本发明的检测灵敏度与精确度。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，在步骤1)中，沉积金纳米颗粒时所用的沉积溶液为氯金酸-硫酸溶液；
所述氯金酸-硫酸溶液中溶剂为0.18M～0.22M的H2SO4溶液，溶质为终浓度为0.1g/L～0.3g/L的氯金酸。
进一步优选的，沉积金纳米颗粒时所用方法为电化学沉积，反应条件为：
在三电极体系下，控制电位范围为-1.0V～1.0V，扫速为90mV/s～110mV/s，循环伏安沉积8～12圈。
本发明以石墨烯负载金属纳米颗粒可以起到分离临近的金属纳米粒子的作用，从而有效地防止金属纳米颗粒的团聚，增强它的活性，同时能够减少贵金属的使用，降低制备成本。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，在沉积金纳米颗粒之前，还包括：
将所述石墨烯修饰电极电极置于0.18M～0.22M H2SO4溶液中，在-0.8V～1.3V电位范围内采用循环伏安法扫描18～22圈。
此步骤的目的为对石墨烯修饰电极进行活化。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，在步骤2)中，所述功能单体与所述模板分子的摩尔比为(4～6):1。
在合成分子印迹聚合物中，功能单体及模板分子和功能单体的比例的选择，是获得高选择性的MIP、形成稳定的主客体复合物的关键。
优选的，所述功能单体与所述模板分子预先混合并溶解，所用溶剂为Britton-Robison缓冲溶液。
优选的，功能单体在Britton-Robison缓冲溶液中的终浓度为29～45μM，模板分子在Britton-Robison缓冲溶液中的终浓度为6～8μM。
伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)是由磷酸、硼酸和醋酸(H3PO4-HAc-H3BO3)混合而成，向其中加入不同量的氢氧化钠可以组成pH范围很宽的缓冲溶液。
优选的，本发明采用的Britton-Robison缓冲溶液的pH值范围为3.8～4.2。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，在步骤2)中，在所述石墨烯-纳米金修饰电极表面原位聚合分子印迹聚合物，形成一层分子印迹膜的方法为电化学聚合法，反应条件为：
在扫描速度为90mV/s～110mV/s、电位范围为-1.0V～1.0V时，循环扫描聚合4～6圈。
优选的，如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，在步骤3)中，所述去除草甘膦模板分子的方法为电化学洗脱；
优选的，所述电化学洗脱的条件为：
将步骤2)中得到的镀有分子印迹膜的石墨烯-纳米金修饰电极浸入到0.08mol/L～0.12mol/L的NaOH溶液中静置10min～20min；
在-1.3V～1.2V电位范围内，以90mV/s～110mV/s的速率循环扫描18～22圈，直到出现稳定的扫描曲线。
由于过氧化的聚吡咯产生羰基和羧基与带负电的Gly分子互斥从而去除模板分子，获得聚吡咯分子印迹膜修饰电极，从而实现对Gly的特异性检测。
如上所述的草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法制备的草甘膦分子印迹电化学传感器。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明解决了传统液相色谱法无法直接检测草甘膦需要衍生化、当前Elisa快速检测草甘膦技术稳定性不好和灵敏度不高、草甘膦快速检测方法缺失等问题。该传感器与普通传感器想比，具有较高的灵敏度和相对较大的Gly吸附量，可促进传感器的小型化发展。
2)、本发明采用石墨烯/纳米金(AuNPs/GR)修饰电极作为印迹聚合物基底，不仅能够增大电极的比表面积有助于形成更多的印迹识别位点，而且石墨烯/纳米金优异的导电性能使修饰电极拥有更高的电子传导效率。
3)、本发明制备的MIPs膜可与石墨烯/纳米金复合材料进行有效的结合，印迹聚合物分布于复合材料表面，能够有效地完成薄膜表面与基底之间的电子传递，进一步提高了传感器灵敏度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)、玻碳电极处理：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉在麂皮上抛光，用超纯水冲洗后在乙醇和超纯水中分别超声洗涤3min。然后将电极置于铁氰化钾中进行循环伏安扫描，若得不到准可逆的循环伏安峰(峰电流比为1:1，峰电位差小于90mV)，则重新处理电极。
2)、石墨烯修饰电极：首先将石墨烯分散液滴涂到玻碳电极的表面，室温下放置晾干；然后取5μL BPPF6离子液体再一次滴涂于电极表面，置于60℃干燥箱中烘干，得到石墨烯修饰电极待用。
所述石墨烯分散液的成分包括BPPF6 3份、超纯水450份、丙酮550份。
3)、纳米金修饰电极：将上一步制得的石墨烯修饰电极电极置于0.22M H2SO4溶液中，在-0.8V～1.3V电位范围内采用循环伏安法扫描18圈，对电极进行活化。然后将电极置于氯金酸-硫酸溶液，在三电极体系下控制电位范围为-1.0V～1.0V，扫速为110mV/s，循环伏安沉积8圈后取出电极再用超纯水冲洗晾干，得到石墨烯-纳米金修饰电极(AuNPs-GR/GCE电极)。
4)、MIPs/AuNPs-GR/GCE电极的制备：将上一步得到的AuNPs-GR/GCE电极浸入到30μM吡咯和7.36μM草甘膦的5mL B-R缓冲溶液(pH 4.0)中进行电化学聚合。在扫描速度为90mV/s、电位范围为-1.0V～1.0V时，循环扫描聚合4圈后取出电极用乙醇冲洗，并用氮气吹干，接着将制得的电极置于0.08mol/L的NaOH溶液中静置20min；采用循环伏安法，在-1.3V～1.2V电位范围内，以90mV/s的速率循环扫描18圈，直到出现稳定的扫描曲线，以彻底洗脱Gly模板分子。电极取出后去离子水冲洗，氮气吹干备用。分子印迹聚合膜的制备过程采用电化学工作站(上海辰华CHI630E)三电极系统：铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，石墨烯/纳米金修饰后的玻碳电极为工作电极。
实施例2
草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)、玻碳电极处理：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉在麂皮上抛光，用超纯水冲洗后在乙醇和超纯水中分别超声洗涤3min。然后将电极置于铁氰化钾中进行循环伏安扫描，若得不到准可逆的循环伏安峰(峰电流比为1:1，峰电位差小于90mV)，则重新处理电极。
2)、石墨烯修饰电极：首先将石墨烯分散液滴涂到玻碳电极的表面，室温下放置晾干；然后取5μL BPPF6离子液体再一次滴涂于电极表面，置于60℃干燥箱中烘干，得到石墨烯修饰电极待用。
所述石墨烯分散液的成分包括BPPF6 7份、超纯水550份、丙酮450份。
3)、纳米金修饰电极：将上一步制得的石墨烯修饰电极电极置于0.18M H2SO4溶液中，在-0.8V～1.3V电位范围内采用循环伏安法扫描22圈，对电极进行活化。然后将电极置于氯金酸-硫酸溶液，在三电极体系下控制电位范围为-1.0V～1.0V，扫速为90mV/s，循环伏安沉积12圈后取出电极再用超纯水冲洗晾干，得到石墨烯-纳米金修饰电极(AuNPs-GR/GCE电极)。
4)、MIPs/AuNPs-GR/GCE电极的制备：将上一步得到的AuNPs-GR/GCE电极浸入到44.16μM吡咯和7.36μM草甘膦的5mL B-R缓冲溶液(pH 4.0)中进行电化学聚合。在扫描速度为110mV/s、电位范围为-1.0V～1.0V时，循环扫描聚合6圈后取出电极用乙醇冲洗，并用氮气吹干，接着将制得的电极置于0.12mol/L的NaOH溶液中静置10min；采用循环伏安法，在-1.3V～1.2V电位范围内，以110mV/s的速率循环扫描22圈，直到出现稳定的扫描曲线，以彻底洗脱Gly模板分子。电极取出后去离子水冲洗，氮气吹干备用。分子印迹聚合膜的制备过程采用电化学工作站(上海辰华CHI630E)三电极系统：铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，石墨烯/纳米金修饰后的玻碳电极为工作电极。
实施例3
草甘膦分子印迹电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)、玻碳电极处理：将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉在麂皮上抛光，用超纯水冲洗后在乙醇和超纯水中分别超声洗涤3min。然后将电极置于铁氰化钾中进行循环伏安扫描，若得不到准可逆的循环伏安峰(峰电流比为1:1，峰电位差小于90mV)，则重新处理电极。
2)、石墨烯修饰电极：首先将石墨烯分散液滴涂到玻碳电极的表面，室温下放置晾干；然后取5μL BPPF6离子液体再一次滴涂于电极表面，置于60℃干燥箱中烘干，得到石墨烯修饰电极待用。
所述石墨烯分散液的成分包括BPPF6 5份、超纯水500份、丙酮500份。
3)、纳米金修饰电极：将上一步制得的石墨烯修饰电极电极置于0.2M H2SO4溶液中，在-0.8V～1.3V电位范围内采用循环伏安法扫描20圈，对电极进行活化。然后将电极置于氯金酸-硫酸溶液，在三电极体系下控制电位范围为-1.0V～1.0V，扫速为100mV/s，循环伏安沉积10圈后取出电极再用超纯水冲洗晾干，得到石墨烯-纳米金修饰电极(AuNPs-GR/GCE电极)。
4)、MIPs/AuNPs-GR/GCE电极的制备：将上一步得到的AuNPs-GR/GCE电极浸入到36.98μM吡咯和7.36μM草甘膦的5mL B-R缓冲溶液(pH 4.0)中进行电化学聚合。在扫描速度为100mV/s、电位范围为-1.0V～1.0V时，循环扫描聚合5圈后取出电极用乙醇冲洗，并用氮气吹干，接着将制得的电极置于0.10mol/L的NaOH溶液中静置15min；采用循环伏安法，在-1.3V～1.2V电位范围内，以100mV/s的速率循环扫描20圈，直到出现稳定的扫描曲线，以彻底洗脱Gly模板分子。电极取出后去离子水冲洗，氮气吹干备用。分子印迹聚合膜的制备过程采用电化学工作站(上海辰华CHI630E)三电极系统：铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，石墨烯/纳米金修饰后的玻碳电极为工作电极。
实验例
本发明采用差分脉冲伏安法(DPV)考察了实施例1～3制备的草甘膦分子印迹电化学传感器(MIPs/AuNPs-GR/GCE电极)对不同浓度Gly的响应。将三个电极浸入含有一定浓度Gly的甲酸-水溶液(pH＝4.0)中，富集18min后，取出电极，用超纯水反复冲洗电极表面，去除非特异性吸附到电极表面的物质，再将电极置入铁氰化钾溶液中进行DPV扫描，Gly浓度范围为5～800μg/L，扫描电位为-0.2V～0.6V。在检测浓度范围内，三个电极的响应电流均随Gly浓度的增大而不断减小，表明随着Gly浓度的增大，印迹膜对Gly的吸附量逐渐增大，印迹识别位点(孔穴)减少导致铁氰化钾分子很难穿过印迹膜达到电极表面。最终，随着印迹膜对Gly的吸附达到平衡状态，响应电流逐渐趋于稳定，当浓度超过一定范围时响应电流将不再改变。在5-800μg/L浓度范围内，Gly浓度与响应峰电流成良好的线性关系，其中，实施例3对应电极的回归方程曲线为I＝-12.85537lgC+75.9205(R2＝0.98168)，检出限(S/N＝3)为0.27ng/mL。实施例1和2的检出限为0.26ng/mL和0.29ng/mL。
本发明选择草甘膦的代谢物氨甲基膦酸(AMPA)及不同类别农药毒死蜱(Chlorpyrifos)、涕灭威(Aldicarb)作为干扰物来验证MIPs/AuNPs-GR/GCE电极的选择性。在Gly和干扰物的浓度均为1000μg/L的甲酸-水溶液中进行富集18min后转移至铁氰化钾溶液中进行差分脉冲伏安扫描，结果显示MIPs/AuNPs-GR/GCE电极对草甘膦、氨甲基膦酸、毒死蜱、涕灭威的响应电流分别为35μA、6μA、5μA、3μA从而得出MIPs/AuNPs-GR/GCE电极对Gly具有较好选择性。进一步的，在实施例3所述的条件下制备5支印迹电极，测定浓度为50μg/L草甘膦溶液，平行测定5次，计算电流响应值的相对标准偏差为3.1％，表明该印迹传感器具有良好的重现性，模板分子与印迹膜上“孔穴”的结合为可逆过程，印迹电极可重复使用。电极在多次使用之后，洗脱后置于超纯水中常温保存，3周后电极响应值降至初始响应值的80.89％，表明印迹电极的稳定性良好。
为了评价本发明的检测效果，随机选择9份实验室自来水进行加标回收率实验。分别取1000μg/L的草甘膦标准溶液100μL、200μL、500μL用自来水定容至10mL，加标浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL。不做任何前处理，直接用实施例2制备的分子印迹电极检测18min，每个样品平行测定3次。结果如表1所示。
表1草甘膦的测定结果(n＝3)
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。