本发明涉及一种含皂甙类植物中总皂甙的测定方法，尤其适用于紫花苜蓿为原料的植物中总皂甙提取纯化及测定方法。
背景技术：
紫花苜蓿是重要的高蛋白饲草，具有“牧草之王”之美誉，除了具有较高的营养价值外，据记载也有中草药的功效。主要是由于苜蓿的次生代谢产物皂甙(alfalfa saponins)具有降血脂、抗炎镇痛、抗肿瘤、抑菌等生物活性。皂甙虽然广泛分布于许多植物中，但含量较高的植物并不多见，目前多数是从人参、绞股蓝、刺五加等中草药植物中提取，提取成本较高。近几年苜蓿皂甙的提取受到广泛关注，主要是由于苜蓿中皂甙不仅具有独特的保健和药用价值，而且苜蓿资源丰富，提取成本低，表现出广阔的开发利用前景。
苜蓿皂甙是一种齐墩果酸型的五环三萜类糖苷化合物，紫外吸收较为微弱，利用非特异显色进行比色检测时，杂质的影响特别是糖类与色素的影响难以避免。传统的液-液两相萃取法生产过程繁琐，有机溶媒用量多，如甲醛、甲醇等有毒有害试剂对人类健康产生危害而且污染环境。近年来，大孔吸附树脂分离技术、超临界CO2萃取法等工艺由于其提取时间短，提取成分纯度较高等优点，广泛应用于生物活性物质的提纯与分离，但操作较为复杂，要求较高，难以满足生产实践中快速检测苜蓿总皂甙含量的需求。自从70年代后期商品化固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)问世以来，在环境分析、食品分析、临床用药分析、植物次级(生)代谢产物分析领域中SPE无疑是一种最广泛使用的样品前处理方法。
本发明利用C18SPE柱萃取法去除苜蓿皂甙中的糖类及色素等干扰杂质，探讨研究固相萃取-紫外分光光度法(SPE-UV)在皂甙含量测定中的可行性，为紫花苜蓿总皂甙的安全、快速检测提供一种新型方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于紫花苜蓿为原料的植物中总皂甙提取纯化及测定方法。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿组织并磨成粉末，然后加入溶剂提取、离心，去除上层溶剂后，旋转蒸发去除残余溶剂，取出脱脂残渣，干燥，过筛，得到紫花苜蓿组织粉末；
(2)总皂苷的提取纯化：
称取适量紫花苜蓿组织粉末，加入溶剂，涡旋震荡，然后提取离心，取上清液，旋转蒸发去除溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，用超纯水和甲醇溶液冲洗后，再用100％甲醇洗脱；合并洗脱液，置于试管中，水浴蒸干，冷却后加入香草醛-冰醋酸溶液；待充分溶解后加入高氯酸，水浴后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸，静置；
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其步骤(1)中所述的紫花苜蓿组织包括紫花苜蓿种子或者光照培养后的紫花苜蓿植株的根、茎、叶、全株；
所述的溶剂为石油醚；
所述的加入溶剂提取、离心的具体方法为加入15倍量(V/m)的石油醚提取、离心，去除上层石油醚后，再次加入同等倍量的石油醚，重复提取1次，再次离心；
所述的提取的方式为超声提取，提取时间为30min；
所述的离心的转速为5000rpm，离心时间为10min；
所述的脱脂残渣的干燥处理方式为冻干或者烘干，优选为冻干；其中冻干设备选用低温真空冻干机，冻干条件为-60℃冻干70h；其中烘干设备选用烘箱，烘干条件为60℃烘干70h；
所述的筛子为60目筛；
所述的紫花苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其步骤(1)中所述的光照培养紫花苜蓿植株的方法为：紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％；
紫花苜蓿植株的培养期为8周。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其步骤(2)中所述的紫花苜蓿粉末的用量为30mg；
所述的溶剂为甲醇溶液或乙醇溶液，有效浓度为30％～100％，优选为70％乙醇溶液，用量为1mL；
所述的涡旋震荡的转速为13000r/min，涡旋震荡的时间为3min；
所述的提取离心的具体方法为室温下超声提取30min，在4℃下放置过夜后，再次超声提取30min，然后离心；
所述的离心条件为10000g，离心时间为30min；
所述的上清液的用量为100μL；
所述的超纯水的用量为5mL；甲醇溶液的有效浓度为30％，用量为5mL；
所述的100％甲醇洗脱次数为1～5次，优选为4次；洗脱速率为1mL/min；
所述的试管规格为10mL具塞试管；
所述的香草醛-冰醋酸溶液的浓度为5％，用量为0.2mL；
所述的高氯酸的用量为0.8mL；
所述的加入高氯酸后水浴的条件为70℃水浴15min；
所述的冰醋酸的用量为5mL；
所述的加入冰醋酸后的静置时间为0～60min，优选为20min。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其步骤(3)中测定吸光度选用的波长为545nm。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其步骤(3)中吸光度标准曲线的绘制方法为：称取齐墩果酸对照品，配置成浓度为2mg/mL的对照品储备液，分别吸取0﹑10﹑15﹑20﹑25﹑30﹑35﹑40μL储备液置于10mL具塞试管中进行显色反应，静置20min，使用分光光度计于545nm处测定各个浓度标准品的吸光度，然后绘制吸光度标准曲线。
本发明所述的一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，其中步骤(2)及步骤(3)中最优条件通过以下实验确定：
(1)固相萃取微柱(SPE)洗脱条件的优化；
(2)样品预处理方法的优化；
(3)总皂甙测定波长的选择；
(4)标准曲线的制备；
(5)样品溶液稳定性测试分析；
(6)仪器精密度分析；
(7)测定方法的重复性检测；
(8)样品回收率检测。
具体实验如下：
(1)固相萃取微柱(SPE)洗脱条件的优化：以齐墩果酸作为指标成分进行SPE柱洗脱条件优化，而SPE用于苜蓿比色法测定皂甙于国内外未见报道。取40μL齐墩果酸对照品(2mg/mL)注入预处理好的SPE柱，分别加超纯水和30％甲醇分5次淋洗，每次1mL，再用1mL甲醇(1mL/min)分别洗脱1﹑2﹑3﹑4﹑5次，以0次洗脱的齐墩果酸对照品(即上柱前的40μL齐墩果酸对照品)作为参照，空白平行样作为空白对照，采用比色法在545nm波长下对不同体积洗脱液进行跟踪分析，计算洗脱率。
实验结果表明：经过4mL和5mL甲醇洗脱后，洗脱液中齐墩果酸的含量与上柱前的齐墩果酸含量是一致的，说明经过4mL甲醇洗脱后齐墩果酸样品基本可以被洗脱。故实验确定SPE柱洗脱条件为：超纯水和30％甲醇分别淋洗5次，每次1mL，再用1mL(1mL/min)甲醇洗脱4次，收集甲醇洗脱液，进行比色测定。
(2)样品预处理方法的优化：称取30mg紫花苜蓿全株﹑根﹑种子冻干样品各6份，分别用1mL的30％、50％、80％、100％甲醇和70％、100％乙醇在超声清洗机中提取30min，4℃过夜，再次超声30min。1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，采用优化的SPE洗脱条件淋洗柱子和洗脱皂甙，收集洗脱液供比色测定用。以空白平行样作对照，用分光光度计在545nm处测定各管中溶液的吸光度。
实验结果表明：影响苜蓿皂甙提取率的主要因素是提取液浓度。当甲醇浓度增大时，对提取效果影响较大；当乙醇浓度增加时，对提取效果增加不大。90-100％甲醇﹑90-100％乙醇﹑60-70％乙醇溶液提取皂甙产率基本接近，而高浓度乙醇会增加蛋白质和糖类等杂质的出现。必须加超纯水利于中等极性成分的溶出。因此，采用70％乙醇溶液提取苜蓿皂甙效果比较适宜。
(3)总皂甙测定波长的选择：取适量齐墩果酸对照品溶液置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中水浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。以不加齐墩果酸的平行样作为空白对照，进行可见光全波长扫描，确定其最大吸收波长。
实验结果表明：最大吸光度的波长范围在545nm左右，故确定苜蓿皂甙含量测定最佳波长为545nm。
(4)吸光度标准曲线的绘制：称取一定量的齐墩果酸对照品，配置成对照品储备液(2mg/mL)，分别吸取0﹑10﹑15﹑20﹑25﹑30﹑35﹑40μL储备液置于10mL具塞试管中进行显色反应，静置20分钟，使用分光光度计于545nm处测定各个浓度标准品的吸光度，并绘制吸光度标准曲线。
(5)样品溶液稳定性测试分析：取30mg根﹑茎﹑叶﹑全株﹑种子的冻干样各一份，按上述步骤中优化的样品预处理方法制备并显色后，每隔10分钟测定一次吸光度，共测定6次，记录吸光度，观察样品溶液的稳定性。
实验结果表明：通过对苜蓿不同组织样品在显色后吸光度的测定分析表明，显色后20min内不同样品间组内吸光度相对变化较大，而显色后的20-60min内样品的吸光度基本保持稳定。故实验样品显色反应后，室温静置20min后再进行吸光度的测定为宜。
(6)仪器精密度分析：取30mg根﹑茎﹑叶﹑全株﹑种子冻干样各一份样品，按上述步骤中优化的样品预处理方法制备并测定吸光度，平行测定三次，计算皂甙含量，精密度用相对标准偏差RSD(％)表示。如果RSD<5％，说明仪器精密度良好。
(7)测定方法的重复性检测：称取同一批全株冻干草粉30mg，重复5份，采用上述步骤制备样品，并进行皂甙含量的测定分析。如果RSD<5％。说明该方法重复性良好。
(8)样品回收率检测：取同一批样品进行定量，分别加入精确定量的对照品，测定吸光度，计算加样回收率。
紫花苜蓿样品采用冻干处理和烘干处理两种方法，其不同组织中总皂甙含量的测定结果分析表明，冻干样不同组织中总皂甙含量测得率明显高于烘干样，因此，在苜蓿皂甙提取和纯化工艺中最好采用冻干处理，有利于提高皂甙的提取效率和纯度。此外，经分析表明苜蓿不同组织中皂甙含量也有一定的差异，其中根中的含量最高，叶中的含量次之，茎和种子中的含量基本相当。
本发明所述的紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法与现有技术不同之处在于：
(1)目前，苜蓿皂甙提取纯化方法一般为水醇提取，大孔树脂纯化或者正丁醇等萃取纯化，此类方法的主要缺点是提取成本高、样本用量大、回收率低，而且提取纯化得到的总皂甙的含量差异大，结果往往偏高或者偏低。此外，上述方法有机媒溶剂需求量大对操作人员的身体健康有危害，而且不易回收容易对环境造成污染。本发明采用的Sep-Pak C18微柱是商品化的固相萃取微柱，常用于液体样品中微量成分的萃取富集，而且该发明是在中药植物中皂甙成分纯化提取的基础上进行了优化和改进，与传统的提取工艺相比：样本用量少，样品处理简便，排除了可溶性糖和酚类物质的干扰，不损失待测成分，重复性好，回收率高。
(2)目前，苜蓿总皂甙含量的测定方法主要有生物法和化学法。生物方法中主要是溶血指数法和木霉菌抑制法，但存在较多的局限性。化学方法主要为比色法﹑薄层色谱法(TLC)﹑液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)等方法。采用TLC法更适用于经过初步分离的定性，对于定量具有一定的局限性；采用HPLC方法，以苜蓿皂甙的某一单体成分作为标准品测定苜蓿皂甙含量的方法，因为在国内苜蓿皂甙的单体成分不易获得且此类方法主要用于单体皂苷的含量检测。采用LC-MS方法，对设备要求较高，需要较高的操作技术。因此，本发明通过优化SPE柱净化条件和摸索不同甲醇浓度和乙醇浓度作为提取剂对苜蓿总皂甙提取率的影响，最终确定固相萃取-紫外分光光度法测定苜蓿总皂苷含量的最佳工艺。实验对选定的SPE-UV法的精确性、重复性、稳定性及回收率进行了测试，结果表明该方法工艺简单，萃取时间短，重复性好，仅用少量的苜蓿草粉可检测出苜蓿总皂甙含量，所消耗的溶剂量较少，降低了成本，减少了环境污染，适用于常规生产实践中紫花苜蓿总皂甙的含量检测。
下面结合具体实施例对本发明的紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其全株，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 30％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
测定方法的重复性检测：称取同一批全株冻干草粉30mg，重复5份，采用上述步骤制备样品，并进行皂甙含量的测定分析。总皂苷含量分别为1.22％、1.23％、1.22％、1.27％、1.26％，RSD<5％，说明该方法重复性良好。
样品回收率检测：取同一批样品进行定量，分别加入精确定量的对照品，测定吸光度，计算加样回收率。
实验结果表明：样品平均回收率为98.97％，RSD为1.14％，说明本方法符合要求，准确可靠。
实施例2
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其全株，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，
旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例3
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其根，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例4
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其根，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例5
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其茎，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例6
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其茎，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例7
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其叶，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例8
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
紫花苜蓿种子萌发后，转移至光照培养箱培养，培养条件为16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％，8周后取其叶，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例9
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿种子，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例10
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿种子，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 70％乙醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱4次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置20min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例11
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿种子，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于低温真空冻干机中-60℃冻干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿冻干粉末30mg，加入1mL 30％甲醇溶液，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱1次，速率为1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置0min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例12
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿种子，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 100％甲醇，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱5次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置60min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
实施例13
一种紫花苜蓿总皂甙提取纯化及快速测定方法，包括如下步骤：
(1)提取材料的培养及处理：
取紫花苜蓿种子，磨成粉末后，然后加入15倍量(V/m)的石油醚超声提取30min，5000rpm离心10min，弃上层石油醚后再加入15倍量的石油醚，重复提取1次，再离心弃去上层石油醚，旋转蒸发去除残余石油醚。脱脂残渣置于烘箱中60℃烘干70h，取出后过60目筛，苜蓿粉末可置于干燥器中长期保存。
(2)总皂苷的提取纯化：
称取紫花苜蓿烘干粉末30mg，加入1mL 100％乙醇，13000r/min涡旋震荡3min，室温下超声提取30min，4℃过夜后再次超声提取30min，10000g离心30min。取100μL上清液，旋蒸去溶剂，用纯水重悬后注入已预处理的SPE柱，分别用5mL超纯水和5mL 30％甲醇冲洗后，再用100％甲醇洗脱3次，每次1mL/min。合并洗脱液置于10mL具塞试管中，水浴蒸干，冷却后加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，待充分溶解后加入高氯酸0.8mL。置于70℃水浴锅中，温浴15min后立即冰浴，冷却后加入冰醋酸5mL，静置40min。
(3)总皂苷的含量测定：
以空白平行样作对照，用分光光度计在一定波长处测定溶液的吸光度，并根据吸光度标准曲线计算总皂苷的含量。
注：选用紫花苜蓿品种为中苜1号。
表1中苜1号中皂甙的含量测定
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。