本发明涉及一种用于检测胃泌素17(G-17)的试剂盒，具体涉及一种基于化学发光法检测胃泌素17的试剂盒。
背景技术：
：胃泌素是一种重要胃肠激素，最早是EdkinsJS等人发现并且命名。随后，DockrayGJ等人研究发现胃泌素基因定位于17号染色体的长臂，全长为4.1kb，能够编码101个氨基酸残基组成的多肽-胃泌素原。胃泌素原经过一系列的加工和修饰从而形成了具有生物活性的成熟多肽。胃泌素的合成经历了胃泌素原、甘氨酸延伸型胃泌素和成熟胃泌素三个阶段，前两种胃泌素作为胃泌素合成及加工的中间产物，是未酰胺化的胃泌素，而成熟的胃泌素是酰胺化的胃泌素，羧基端的酰胺化是胃泌素家族成员发挥其生物活性所必需的。胃泌素有多种亚型，包括胃泌素34、胃泌素71、胃泌素52、胃泌素14、胃泌素17等，在人体中含量最多(约90％)且作用最为重要的是胃泌素17。胃泌素由存在于胃幽门部粘膜的G细胞(gastrincontainingcell)分泌，进入血中再作用于胃，促进胃液分泌。G细胞主要分布在胃窦部，十二指肠和空肠上段粘膜内也有少量G细胞。胃的幽门窦受到食物等的机械性刺激，幽门部的pH偏碱性时就进行胃泌素的分泌。其结果，胃液特别是盐酸的分泌变得旺盛，而当胃内部的pH降低时盐酸和胃泌素的分泌就停止。此外，胃泌素也具有促进胃蛋白酶分泌、胰液分泌、胆液分泌、胰岛素分泌等的作用。胃窦粘膜内的胃泌素主要是G-17，十二指肠粘膜中有G-17和G-34约各占一半。从生物效应来看，G-17刺激胃分泌的作用要比G-34强5-6倍，G-34在体内被清除的速度很慢(半衰期约为50min)，G-17的半衰期通常只有6min。G-17为由17个氨基酸残基组成的多肽，有两种(胃泌素Ⅰ和Ⅱ)：一种酪氨酸残基进行了硫酸基取代，一种未进行所述取代，两者在生理活性上并没有差异。对各种哺乳动物的G-17的一级结构的研究表明，均为17个氨基酸组成，仅在自氨末端的第5位和第10位的氨基酸残基因动物而异。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于检测胃泌素17的试剂盒。本发明提供了一种用于检测人胃泌素17的试剂盒(试剂盒甲)，包括组件1和组件2；所述组件1为包被有G-17-BSA的微孔板；所述G-17-BSA为多肽，自N末端至C末端依次含有如下两个区段：G-17多肽和牛血清白蛋白成熟肽；所述G-17多肽为：在序列表的序列1所示多肽的N末端第一个氨基酸残基末端连接一个焦谷氨酸得到的多肽；所述组件2为酶结合物溶液；所述酶结合物溶液中含有HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体。所述G-17-BSA具体可为将G-17多肽的C末端与牛血清白蛋白成熟肽的N末端连接形成的多肽。牛血清白蛋白成熟肽具体可如序列表的序列2所示。所述酶结合物溶液中还含有酪蛋白、Proclin-300和BSA。所述酶结合物溶液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；所述溶质及其在酶结合物溶液中的浓度如下：HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体的体积百分含量为0.02％、酪蛋白0.1g/100ml、Proclin-300的体积百分含量为0.02％、BSA2g/100ml。所述包被有G-17-BSA的微孔板的制备方法如下：(1)用pH9.6、0.05mol/L的CB缓冲液稀释G-17-BSA，得到蛋白浓度为2μg/ml的包被液；(2)取微孔板，每孔加入100μl步骤(1)制备的包被液，2-8℃静置18-24h，然后弃除孔内液体；(3)完成步骤(2)后，取所述微孔板，每孔加入200μl封闭液，2-8℃静置18-24h，然后弃除孔内液体；封闭液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；所述溶质及其在封闭液中的浓度如下：蔗糖8g/100ml、BSA0.5g/100ml、酪蛋白0.5g/100ml；(4)完成步骤(3)后，取所述微孔板，在20-30℃、湿度<40％的环境中干燥18-24h。所述试剂盒中还包括组件3和\或组件4和\或组件5。所述组件3为20×浓缩洗液；20×浓缩洗液由溶质和溶剂组成；溶剂为pH7.4、0.2mol/L的PBS缓冲液；所述溶质及其在20×浓缩洗液中的浓度如下：Tween20的体积百分含量为1％。所述组件4为发光液A和发光液B；发光液A由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液；所述溶质及其在发光液A中的浓度如下：鲁米诺3mg/ml、对碘苯酚0.25mg/ml、四苯硼钠0.5mg/ml；发光液B由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液；所述溶质及其在发光液B中的浓度如下：过氧化脲0.5mg/ml。所述组件5为G-17标准品溶液；G-17标准品溶液由S0溶液、S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液和S5溶液组成；S0溶液为含1g/100mlBSA和体积百分含量为0.02％的Proclin-300的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液和S5溶液均为含G-17、1g/100mlBSA和体积百分含量为0.02％的Proclin-300的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；S1溶液中，G-17的浓度为20pg/ml；S2溶液中，G-17的浓度为100pg/ml；S3溶液中，G-17的浓度为200pg/ml；S4溶液中，G-17的浓度为500pg/ml；S5溶液中，G-17的浓度为1000pg/ml。所述试剂盒还包括记载有如下操作方法的载体：(1)制作标准方程①取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μlG-17标准品溶液和100μl酶结合物溶液，振荡混匀，然后37℃静置60分钟；②完成步骤①后，用洗涤液洗涤5遍，扣干；所述洗涤液为用蒸馏水或去离子水将20×浓缩洗液稀释至20倍体积得到的溶液；③完成步骤②后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上检测发光值；使用log-logit线性拟合方式进行数据处理，制作标准方程：ln[百分结合率/(1-百分结合率)]＝Blog10浓度+A；A、B为直线参数；S1溶液至S5溶液中任一溶液对应的发光值除以S0溶液对应的发光值，为百分结合率；(2)检测待测溶液待测溶液为待测液体样本、待测液体样本的稀释液或待测固体样本的溶解液；①取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μl待测溶液和100μl酶结合物溶液，振荡混匀，然后37℃静置60分钟；②完成步骤①后，用洗涤液洗涤5遍，扣干；③完成步骤②后，后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上检测发光值；根据步骤(1)得到的标准方程，计算待测溶液中的人胃泌素17浓度。本发明还保护一种用于检测人胃泌素17的试剂盒(试剂盒乙)，包括所述G-17-BSA和所述小鼠抗G-17单克隆抗体。本发明还保护一种辅助诊断待测者是否患有发生胃体萎缩的慢性胃炎或发生胃窦萎缩的慢性胃炎的试剂盒(试剂盒丙)，包括以上任一所述的试剂盒甲或试剂盒乙。所述试剂盒丙还包括记载有如下判断标准的载体：如果血清中胃泌素17的浓度高于120pg/ml，待测者疑似患有发生胃体萎缩的慢性胃炎；如果血清中胃泌素17的浓度低于40pg/ml，待测者疑似患有发生胃窦萎缩的慢性胃炎；如果血清中胃泌素17的浓度为50-100pg/ml，待测者疑似不患有发生胃体萎缩的慢性胃炎且不患有发生胃窦萎缩的慢性胃炎。本发明还保护一种酶结合物溶液，由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；所述溶质及其在酶结合物溶液中的浓度如下：HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体的体积百分含量为0.02％、酪蛋白0.1g/100ml、Proclin-300的体积百分含量为0.02％、BSA2g/100ml。HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体的制备方法：将小鼠抗G-17单克隆抗体进行HRP标记,然后将体积调整为小鼠抗G-17单克隆抗体的初始体积(也就是说，每1ml小鼠抗G-17单克隆抗体得到1mlHRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体)。小鼠抗G-17单克隆抗体具体可为：Biorbyt公司的货号为orb302695的Gastrin-17antibody。人胃泌素17具体可为在序列表的序列1所示多肽的N末端第一个氨基酸残基末端连接一个焦谷氨酸得到的多肽。本发明提供的试剂盒可定量测定人血清样本中的胃泌素17的浓度，具有高敏感性、高特异性、操作方便的特点，从各项性能指标和临床试验的结果来看，试剂盒适用于临床常规检测。本发明提供的试剂盒可用于检测人血液样本中的胃泌素17(gastrin-17)的含量，从而可用于评估或预测胃粘膜状态或状况，诊断萎缩性胃炎高危人群的筛查，从而可用于评价消化道系统生理病理状态。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。BSA即牛血清白蛋白。小鼠抗G-17单克隆抗体(Gastrin-17antibody)：Biorbyt公司，货号orb302695。G-17：人工合成G-17多肽(人胃泌素17)，序列如下：Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(焦谷氨酸-甘氨酸-脯氨酸-色氨酸-亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸—苯丙氨酸)。G-17多肽为：在序列表的序列1所示多肽的N末端第一个氨基酸残基末端连接一个焦谷氨酸得到的多肽。G-17-BSA：人工合成G-17-BSA多肽。G-17-BSA多肽为将G-17多肽的C末端与BSA的N末端连接形成的多肽。BSA如序列表的序列2所示。胃蛋白酶原(PGⅠ)：Fitzgerald公司，货号30R-AP038。胃蛋白酶原(PGⅡ)：Fitzgerald公司，货号30R-AP039。实施例1、试剂盒的制备一、试剂盒组件的制备1、包被有G-17-BSA的微孔板。包被有G-17-BSA的微孔板的制备方法如下：(1)用pH9.6、0.05mol/L的CB缓冲液稀释G-17-BSA，得到蛋白浓度为2μg/ml的包被液。(2)取微孔板，每孔加入100μl步骤(1)制备的包被液，2-8℃静置18-24h，然后弃除孔内液体。(3)完成步骤(2)后，取所述微孔板，每孔加入200μl封闭液，2-8℃静置18-24h，然后弃除孔内液体。封闭液：溶剂为pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；溶质及其在封闭液中的浓度如下：蔗糖8g/100ml、BSA0.5g/100ml、酪蛋白0.5g/100ml。(4)完成步骤(3)后，取所述微孔板，在20-30℃、湿度<40％的环境中干燥18-24h。(5)每个铝箔袋放入一个完成步骤(4)的微孔板和一包干燥剂，进行真空密封包装。2、酶结合物溶液：溶剂为pH7.4、0.02M的PBS缓冲液；溶质及其在酶结合物溶液中的浓度如下：HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体0.02％(体积百分含量)、酪蛋白0.1g/100ml、Proclin-3000.02％(体积百分含量)、BSA2g/100ml。HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体的制备方法：将小鼠抗G-17单克隆抗体按照常规方法进行HRP标记,然后将体积调整为小鼠抗G-17单克隆抗体的初始体积(也就是说，每1ml小鼠抗G-17单克隆抗体得到1mlHRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体)。3、G-17标准品溶液(S0溶液-S5溶液)。S0溶液为含1g/100mlBSA和0.02％(体积百分含量)Proclin-300的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液。S1溶液至S5溶液为含G-17、1g/100mlBSA和0.02％(体积百分含量)Proclin-300的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液。S1溶液中，G-17的浓度为20pg/ml。S2溶液中，G-17的浓度为100pg/ml。S3溶液中，G-17的浓度为200pg/ml。S4溶液中，G-17的浓度为500pg/ml。S5溶液中，G-17的浓度为1000pg/ml。4、20×浓缩洗液：溶剂为pH7.4、0.2mol/L的PBS缓冲液；溶质及其在20×浓缩洗液中的浓度如下：Tween201％(体积百分含量)。5、发光液A：溶剂为pH8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在发光液A中的浓度如下：鲁米诺3mg/ml、对碘苯酚0.25mg/ml、四苯硼钠0.5mg/ml。6、发光液B：溶剂为pH8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在发光液B中的浓度如下：过氧化脲0.5mg/ml。二、试剂盒的制备试剂盒的组件见表1。表1包被有G-17-BSA的微孔板孔阵列：12×8酶结合物溶液12ml×1瓶G-17标准品溶液S0溶液-S5溶液：各1.0ml×1瓶20×浓缩洗液50ml×1瓶发光液A6ml×1瓶发光液B6ml×1瓶封板膜若干自封袋1个说明书1个试剂盒的保存条件：2-8℃。试剂盒的有效期：12个月。三、试剂盒的使用方法(即说明书记载的内容)洗涤液的制备方法：用蒸馏水或去离子水将20×浓缩洗液稀释至20倍体积。1、制作标准方程(1)取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μlG-17标准品溶液和100μl酶结合物溶液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，然后37℃静置60分钟。(2)完成步骤(1)后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(3)完成步骤(2)后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，轻轻振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上测定发光值。使用log-logit线性拟合方式进行数据处理。方程式为:ln[百分结合率/(1-百分结合率)]＝Blog10(浓度)+A。A、B为直线参数。S1溶液至S5溶液中任一溶液对应的发光值除以S0溶液对应的发光值，为百分结合率。2、检测待测溶液待测溶液可以为待测液体样本(例如血清)、待测液体样本的稀释液、待测固体样本的溶解液等。待测液体样本为血清时，适用于新鲜血清样本,静脉采血后24小时内分离。(1)取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μl待测溶液和100μl酶结合物溶液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，然后37℃静置60分钟。(2)完成步骤(1)后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(3)完成步骤(2)后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，轻轻振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上测定发光值。根据步骤1得到的标准方程，计算待测溶液中的G-17浓度。四、试剂盒的工作原理用G-17-BSA包被微孔板制成固相，加入待测溶液和酶结合物，待测溶液中的G-17和包被在微孔板上的G-17-BSA与HRP标记的小鼠抗G-17单克隆抗体竞争性结合，加入发光液，测定其发光值，根据校准曲线即可算出待测溶液中胃泌素17的含量，发光值随待测溶液中G-17浓度的增加而降低。实施例2、应用实施例1制备的试剂盒检测不同人群的血清中的胃泌素17含量208例正常人组成体检组，为排除胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃泌素瘤、胃窦粘膜增生等胃病的健康者，且均为知情同意的志愿者。143例经医院确诊的发生胃体萎缩的慢性胃炎患者组成胃体萎缩组，且均为知情同意的志愿者。168例经医院确诊的发生胃窦萎缩的慢性胃炎患者组成胃窦萎缩组，且均为知情同意的志愿者。待测溶液为血清。采用实施例1制备的试剂盒并按实施例1中的试剂盒的使用方法进行操作。各组人群的血清中胃泌素17的浓度见表2。可建立如下辅助诊断标准：如果血清中胃泌素17的浓度高于120pg/ml，待测者疑似患有发生胃体萎缩的慢性胃炎；如果血清中胃泌素17的浓度低于40pg/ml，待测者疑似患有发生胃窦萎缩的慢性胃炎；如果血清中胃泌素17的浓度为50-100pg/ml，待测者疑似不患有发生胃体萎缩的慢性胃炎且不患有发生胃窦萎缩的慢性胃炎。表2例数血清中胃泌素17的浓度(pg/ml)体检组20871.00±17.26胃体萎缩组143267.21±103.46胃窦萎缩组16820.41±10.15实施例3、试剂盒的性能待测试剂盒为：实施例1制备的三个批次的试剂盒(批次一、批次二和批次三)。一、最低检测限(1)取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μlS0溶液和100μl酶结合物溶液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，然后37℃静置60分钟。每个待测试剂盒，S0溶液设置20个复孔。(2)完成步骤(1)后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(3)完成步骤(2)后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，轻轻振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上测定发光值。各孔的发光值见表3。使用log-logit线性拟合方式进行数据处理。计算20孔S0溶液相应的发光值的平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程计算出发光值为Mean-2×SD时的浓度值为最低检测限。三个批次的试剂盒的最低检测限均在15pg/ml以下。表3二、分析特异性在人血液中容易对G-17的检测造成干扰的物质主要有胃蛋白酶原(PGⅠ)和胃蛋白酶原(PGⅡ)。(1)取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μl特定溶液和100μl酶结合物溶液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，然后37℃静置60分钟。特定溶液为S0溶液、S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液、S5溶液、PGⅠ溶液或PGⅡ溶液。PGⅠ溶液的制备方法：将PGⅠ溶于pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，得到浓度为200ng/ml的PGⅠ溶液。PGⅡ的制备方法：将PGⅡ溶于pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，得到浓度为50ng/ml的PGⅡ溶液。每个待测试剂盒，每种特定溶液设置2个复孔。(2)完成步骤(1)后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(3)完成步骤(2)后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，然后在化学发光免疫分析仪上测定发光值。各孔的发光值见表4。表4使用log-logit线性拟合方式进行数据处理。根据标准曲线计算PGⅠ溶液或PGⅡ溶液对应的发光值对应的G-17浓度，即为PGⅠ或PGⅡ的交叉反应值。结果见表5。结果表明，试剂盒与PGⅠ或PGⅡ的交叉反应值均低于15pg/ml，不会对G-17的检测造成干扰。表5交叉反应值(pg/ml)批次一批次二批次三PGⅠ2.0611.567.88PGⅡ5.7611.917.64三、重复性和批间差重复性是用同一批试剂盒重复测定一份样本得到的变异系数(CV)，每个质控品需在一块板内随机做10孔精密性测定，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批内变异系数(CV)＝SD/Mean×100％。批间差是不同批次试剂盒间的重复性，随机抽取三批试剂试剂盒，用这些试剂盒测定质控品3次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批间变异系数(CV)＝SD/Mean×100％。质控品为G-17多肽。(1)取包被有G-17-BSA的微孔板，每孔加入50μl特定溶液和100μl酶结合物溶液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，然后37℃静置60分钟。特定溶液为特定溶液甲或特定溶液乙。特定溶液甲为S0溶液、S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液或S5溶液。每个待测试剂盒，每种特定溶液甲设置2个复孔。特定溶液乙为不同浓度的质控品溶液。质控品溶液的制备方法：将质控品溶于pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，得到100pg/ml的低浓度质控品溶液(Qc1)和500pg/ml的高浓度质控品溶液(Qc2)。每个待测试剂盒，每种特定溶液乙设置10个复孔。(2)完成步骤(1)后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(3)完成步骤(2)后，每孔加入50μl发光液A和50μl发光液B，轻轻振荡混匀，然后在化学发光免疫分析仪上测定发光值。采用特定溶液甲时，各孔的发光值见表6。表6采用特定溶液乙时，各孔的发光值见表7。表7使用log-logit线性拟合方式进行数据处理。根据标准曲线计算特定溶液乙中的G-17浓度。结果见表8。三个批次的试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控，批内变异系数都小于10％，表明试剂盒的均一性良好，结果具有重复性。综合三批试剂盒两种包装规格测定高浓度和低浓度两个质控品的结果，批间变异系数小于15％，表明不同批次的试剂盒之间变异很小，测量结果具有重复性。表8综上所述，本发明提供的试剂盒的主要性能指标的标准如下：最低检测限：不高于15pg/ml；分析特异性：PGⅠ(200ng/ml)、PGⅡ(50ng/ml)交叉反应值不大于15pg/ml；重复性：批内变异系数不高于10％；批间差：批间变异系数不高于15.0％。当前第1页1 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