本发明属于烟草成分检测
技术领域：
，涉及一种定量测定烟草中Amadori化合物的分析方法，具体是采用溶剂直接萃取烟草粉末，萃取液经离心、过滤、稀释后，直接采用HPLC-MS/MS同时定量检测10种Amadori化合物的含量。
背景技术：
：Amadori化合物是由还原糖和氨基酸（或其它含氨基基团化合物）经缩合、脱水、Amadori重排而得到的一类美拉德反应的中间产物，即1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。据报道[1]，在烤烟烟叶中Amadori化合物总量在2%以上，是重要的烟草香味成分前体物，对卷烟的感官品质具有重要作用。关于Amadori化合物的测定，国外最早采用氨基酸分析仪、GC进行测定，但均存在一定问题。如，氨基酸分析仪存在分离度不足、定性不准确、干扰严重的问题；而GC方法衍生化将引入多个异构体，难以进行定量。2010年后，有两篇文献报道了用HPLC-MS/MS分析烟草中的Amadori化合物的相关研究[2,3]，但是测定的Amadori化合物数目分别为2个和6个，测定指标数量较少,且均未涵盖烟草中含量较高的Fru-Asn（葡萄糖和天冬酰胺反应生成的Amadori化合物），可能原因是受到色谱方法的分离度不足的限制。根据系统调研，目前已有文献方法检测目标也均没有覆盖结构近似的1对异构体化合物，即Fru-Ile和Fru-Leu（葡萄糖和异亮氨酸、亮氨酸分别形成的Amadori化合物），其主要原因是目前文献方法中Fru-Ile与Fru-Leu的色谱峰均不能分开，导致无法定量。发明专利CN201310487876公开了一种烟草中同时测定Amadori化合物的方法，该方法的样品前处理步骤包括萃取、过滤、净化、HPLC-MS/MS测定步骤。其中净化步骤需要向滤液中加入正己烷进行萃取多次，再将甲醇-水相浓缩至干，用甲醇水溶液再定容，过有机滤膜。发明专利CN201310487876.9所采用的样品前处理步骤较为繁琐，需要引入正己烷进行多次萃取。除此之外，CN201310487876.9所采用样品前处理步骤中需要对甲醇-水溶液进行浓缩蒸干，而甲醇-水溶液的浓缩蒸干过程是必须引入进行加热的。但是，Amadori化合物由糖和氨基酸（或其他含氨基化合物）反应生成的中间产物，在加热的条件下，会导致Amadori化合物进一步分解生成小分子的醛、酮、酸等物质，所以Amadori化合物的分析方法的样品前处理步骤应该尽量避免加热以防止副反应发生。因此，开发一种简单、快速、前处理方法温和、准确度及精密度高且可同时定量测定烟草中多种Amadori化合物的分析方法是一个迫切需要解决的问题，对烟草品质评价、卷烟配方开发具有着重要指导意义，对食品等行业具有着重要的参考价值。技术实现要素：本发明的目的正是基于上述现有状况而提供一种采用HPLC-MS/MS定量测定烟草中Amadori化合物的分析方法，该方法操作简单、快速、温和，准确度及灵敏度高，重现性及回收率好，可同时实现10种Amadori化合物的测定，且10种化合物涵盖了烟草中丰度最高的Fru-Asn，以及一对异构体Fru-Leu和Fru-Lle。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种测定烟草中Amadori化合物的分析方法，其特征在于：包括下列步骤：1）将烟叶或烟丝样品研磨成粉，过40目筛；2）称取烟末样品50～200mg，加入20～40mL甲醇/水（3:7，v:v），超声萃取20～40min，在5000～10000rpm转速下离心3～10min后，取上清液采用0.22上清滤膜过滤；3）将滤液用稀释溶剂稀释5～20倍后，得样品溶液；4）样品溶液直接用于HPLC-MS/MS分析，采用外标法定量测定如表1所示10种Amdori化合物含量。HPLC-MS/MS分析条件如下：采用规格为250mm×2.1mmi.d.,5.0μm的AtlantisHILICSilica色谱柱；柱温：25oC；进样量：5μL；流速：600μL/min；流动相：A.0.2%甲酸溶液，B.乙腈；洗脱梯度：0-0.1min，10.5%B到22%B梯度洗脱，0.1-10min,22%B；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；气帘气压力：15psi；碰撞气压力：7psi；喷雾电压（Capillaryvoltage）：5500V；雾化温度：550oC；雾化气压力：60psi；辅助气压力：75psi。步骤4）中稀释溶剂为甲醇、乙腈或甲醇/乙腈混合溶剂（任意混合比例）。10种Amadori分析物的名称及MRM参数见表1.表110种Amadori化合物的MRM参数注：1-10的Amadori化合物分别是葡萄糖与氨水、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸反应形成的Amadori化合物。本发明的特点在于：用萃取溶剂直接萃取烟草样品，萃取液经离心、过滤、稀释后采用HPLC-MS/MS进行分析，可同时对烟叶、烟丝中10种Amadori化合物进行定量检测，并可首次对Fru-Leu，Fru-Ile这两种异构体实现分离、测定，具有操作简单、快速、重新性及回收率好、灵敏度及准确度高的优点。附图说明图1为标样（左图）及一种烤烟烟叶样品（右图）中10种Amadori化合物的MRM图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。实施例1将Fru-Leu,Fru-Asn,Fru-Trp,Fru-Pro,Fru-Phe,Fru-Val,Fru-Lle,Fru-Ala,Fru-Glu,Glucosamine共10种Amadori化合物配制成不同浓度的混合系列标准工作溶液，其中Fru-Pro、Fru-Asn的浓度梯度为0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0µg/mL，而其它8种Amadori化合物浓度梯度为0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0µg/mL。用HPLC-MS/MS对系列标准工作溶液进行分析，以目标物的色谱峰面积对浓度进行线性回归分析，线性方程及相关系数如表2所示。以最低浓度混标溶液进行10次测定，计算10种目标物色谱峰面积的标准偏差，以3倍标准偏差为检出限，10种标准偏差为定量限,结果列入表2。结果表明，方法线性好，检出限低。表2方法线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限化合物线性方程相关系数r线性范围µg/mL检出限ng/mL定量限ng/mLGlucosaminey=5.97×103x+1.85×1040.99940.005–1.001.926.40Fru-Alay=6.08×103x+1.79×1040.99980.005–1.001.525.07Fru-Asny=2.26×103x-2.99×1030.99980.050–10.02.538.33Fru-Gluy=5.61×103x-1.31×1030.99960.005–1.001.836.09Fru-Proy=3.37×103x+4.88×1030.99990.050–10.01.595.31Fru-Valy=1.14×104x+5.32×1030.99980.005–1.001.765.87Fru-Lley=9.18×103x-5430.99970.005–1.002.117.04Fru-Leuy=7.47×103x+8.3×1030.99900.005–1.001.575.22Fru-Phey=8.87×103x+4.82×1030.99990.005–1.001.354.51Fru-Trpy=1.21×104x-5.27×1040.99770.005–1.001.645.48实施例2称量100mg同一烟粉样品，加入20mL甲醇/水（3:7,v:v），超声萃取30min；在5000rpm转速下离心3min后，取上清液5mL过滤，取1mL滤液用甲醇稀释10倍后，采用HPLC-MS/MS测定，HPLC-MS/MS方法参考
发明内容部分。按照上述操作进行日内6次平行和日间6次平行试验，计算测定结果的日内精密度和日间精密度，如表3所示，日内精密度小于4.1%，日间精密度小于5.4%，证明方法的重现性较好。表3方法日内精密度及日间精密度实施例3称量实施例2所用烟草样品100mg，分别添加浓度为高、中、低含量水平的Amadori标准品混合溶液，其中每个添加浓度水平下进行3次重复实验，其它操作步骤和实施例2完全相同，采用HPLC-MS/MS进行测定并计算回收率。如表4所示，对10种目标Amadori化合物，三个添加水平下，回收率在86.1%～120.3%，结果较为满意。表4方法回收率实施例4称量200mg的样品A（烤烟烟叶粉末）、样品B（白肋烟烟叶粉末）、样品C（香料烟烟叶粉末），分别加入30mL甲醇/水（3:7,v:v），超声萃取40min；在8000rpm转速下离心3min后，取上清液5mL过滤，取1mL滤液用甲醇稀释（样品A、C稀释10倍，样品B稀释3倍），采用HPLC-MS/MS测定，HPLC-MS/MS方法参考
发明内容部分。测定结果如表5所示，表明烤烟、白肋烟、香料烟烟丝样品中Amadori化合物的含量具有较大差异性。参考文献：[1]Dickerson.Useofadditivestoenhanceformationofamadoricompoundsduringaging[J].ChemicalResearch.1972;1101-1150.[2]ZhouW,WangJ,WuD.Determinationofimportantflavourprecursorcompounds(Amadoricompounds)incigarettesbyLC-MS/MS[J].JournalofAnalyticalChemistry,2014,69(7):691-695.[3]贾春晓，修龙飞，牟定荣，毛多斌,液相色谱一串联质谱法同时测定烟草中6种Amadori化合物,质谱学报，36（1）:45-51。当前第1页1 2 3