本发明涉及折射率传感和生物分子检测领域，具体涉及一种应用于基于全反射条件下石墨烯偏振吸收效应的折射率传感器的石墨烯玻璃芯片的制备方法。
背景技术：
折射率传感和生物分子检测在生命科学、医疗检测、药物筛选、环境监测等领域具有广泛的应用需求，SPR技术能够对生物分子之间的相互作用进行实时跟踪和检测。在SPR设备中，其芯片是信号检测的核心部件，但由于芯片有限的再生次数使得其成为一种需要频繁更换的耗材，而SPR芯片相对高昂的售价使得SPR仪器的使用成本提升，推高了检测和研发的成本，为用户和企业带来沉重的负担。因此发展一种低成本的对生物分子相互作用实现快速实时检测的新技术具有很强的市场需要。
随着石墨烯光学性质研究的深入，我们发现在全反射条件下，全反射产生的消逝波与界面处的石墨烯有很强的相互作用，部分光被石墨烯吸收，从而使检测到的反射光强度大幅减弱，尤为重要的是，石墨烯对光的吸收表现出与偏振相关的特性，即对S偏振光的吸收远大于对P偏振光的吸收。石墨烯对于光的吸收由石墨烯表面物质的折射率决定，而折射率的变化又与石墨烯表面结合的分子质量成正比，因此可以通过反射光中S光和P光的强度变化来获取生物分子之间相互作用的特异信号。这种新型石墨烯折射率传感器具有灵敏度高、实时监测、无需标记、耗样少、对生物分子无损伤等优点。
对于此类基于石墨烯偏振吸收效应的折射率传感器，石墨烯玻璃芯片是实现精准检测的核心。对于商用仪器而言，实现标准化精准检测要求石墨烯玻璃芯片的各项参数指标是可控的，能够批量制备相同规格的产品。然而，采用常规的转移方法，将金属基底上的石墨烯转移到玻璃基片表面，由于芯片产品要求石墨烯层数较多，需要很多次重复转移，过程非常繁复，不可避免地造成成本高昂，并且转移的石墨烯与基片相互作用弱，石墨烯层容易被冲洗掉，芯片使用寿命短；采用还原氧化石墨烯方法制备的石墨烯玻璃芯片，很难精确控制石墨烯的厚度，每个芯片石墨烯层的厚度各不相同，造成每次的测量结果不一致，这对于商用检测仪器而言是致命的。因此，开发一种新型石墨烯玻璃芯片制备方法，能够保证批量制备的芯片各项参数都是一样的，提高芯片良品率，同时要求制备过程尽可能简单，以降低芯片成本，对于开发和推广这种基于石墨烯偏振吸收效应的折射率传感器具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种应用于基于石墨烯偏振吸收效应的折射率传感器的石墨烯玻璃芯片的制备方法，制备方法简单、良品率高，作为折射率传感器的核心部件，可以直接、快速、实时、灵敏、高通量地检测生物分子之间的相互作用。
为解决上述问题，本发明公开了一种石墨烯玻璃芯片的制备方法，首先采用化学气相沉积的方法直接在石英玻璃基片表面生长出层数可控的石墨烯薄膜，作为芯片的主体，然后在石墨烯表面偶联各类生物分子(靶分子)用于检测分子之间的相互作用。
本发明中适用于石墨烯折射率传感器的石墨烯玻璃芯片的制备方法包括以下步骤：
1)石英玻璃基片清洗；
2)石墨烯生长：
将清洗后的石英玻璃基片置于管式炉中，将反应腔压强抽至10Pa以下，然后通入500-1000sccm Ar和500-1000sccm H2，升温至1000-1100℃；待温度稳定后，向反应腔内通入300-500sccm乙醇蒸气，控制反应腔内压强为1000-2000Pa；石墨烯生长时间30-60min，以获得厚度为5-10nm的石墨烯薄膜；生长结束后关闭乙醇供给，并降温；待降至室温后关闭Ar和H2，并取出石墨烯玻璃样品；
3)石墨烯表面处理：
将所得石墨烯玻璃样品下表面石墨烯全部清除，暴露出干净的石英玻璃表面；利用等离子体清洗处理石墨烯玻璃上表面的石墨烯，使石墨烯薄膜含有丰富的羟基基团；
4)生物分子修饰：
将处理后的石墨烯玻璃浸泡到配置好的包含有特定生物分子的缓冲溶液中，在室温下反应10小时，使石墨烯表面偶联一层生物分子；
5)石墨烯玻璃芯片清洗。
本发明中，所选用石英玻璃基片尺寸为15mm×15mm×1mm。本发明的玻璃基片不仅可以采用石英玻璃，还可以采用其他合适的玻璃。
优选地，所述步骤1)中，将石英玻璃基片依次置于丙酮、乙醇、超纯水中超声清洗10分钟，用氮气吹干，完成石英玻璃基片的清洗。
优选地，所述步骤3)中，处理石墨烯表面所采用的等离子体清洗的机器功率为500W，清洗时间为15秒。
优选地，所述步骤5)中清洗石墨烯玻璃芯片步骤为使用洗脱液(含1-3％乙酸和0.1-1％SDS的水溶液)反复振荡洗涤6次，每次40min，再使用超纯水振荡洗涤6次，每次40min。
本发明中，步骤4)中所偶联的生物分子包含但不仅限于多巴胺、免疫球蛋白、酶、DNA等，也就是说生物分子可以是多巴胺、免疫球蛋白、酶、DNA中的一种和多种，还可以是本领域技术所用到的其他生物分子，只要是其可以偶联到石墨烯上，且可以用于生物分子检测。
另一方面，本发明还公开了一种利用该石墨烯玻璃芯片快速实现折射率传感和检测生物分子相互作用的方法，包括下列步骤：
1)待测样品的采集和处理；
2)将石墨烯玻璃芯片与棱镜和微流体通道组装到一起，具体为利用折射率匹配液将芯片玻璃一侧与棱镜贴合到一起，并将微流体通道贴合到芯片的石墨烯一侧；
3)将组装好的棱镜/石墨烯玻璃芯片/微流体通道安装到测量光学系统中，采用532nm激光器作为光源，利用1/4波片产生圆偏振光，垂直入射进入棱镜，并在石墨烯界面处发生全反射，反射光采用偏振分光棱镜分成P偏振光和S偏振光，采用平衡探测器探测两束光强度，实时采集信号；
4)利用蠕动泵将待测样品溶液注入微流体通道，经过石墨烯玻璃芯片时与石墨烯上的靶分子发生结合；
5)进样结束后通入缓冲液将通道内未与靶分子结合的待分析物冲走，完成解离过程；
6)测量完成后对石墨烯玻璃芯片进行再生，将与配体结合的分析物彻底洗掉，恢复配体的活性，使得石墨烯玻璃芯片可再次使用。
待测样品可以为液体或气体，将待分析物溶解于相应溶液中，过滤除杂。待分析物包含但不仅限于蛋白质、DNA/RNA、脂类/脂质体/生物膜、多糖、多肽、小分子、全细胞/病毒/微生物等。
本发明所制备的石墨烯玻璃芯片将使用在基于石墨烯偏振吸收效应的石墨烯传感器上，替代通过转移或者还原氧化石墨烯制备的石墨烯薄膜，实时监测待测样品的折射率变化和生物分子的特异性结合过程。与传统的转移和氧化还原法制备的石墨烯芯片相比，石墨烯玻璃芯片制备方法简单，与玻璃基片结合力强，使用寿命更久，石墨烯厚度控制精准，可重复性强，检测结果灵敏、准确、稳定等优点。
本发明的优点在于：1)采用化学气相沉积技术直接在石英玻璃表面可控生长石墨烯，所获得石墨烯薄膜的厚度精确可控，确保每次制备的石墨烯玻璃芯片都是一样的，从而保证采用该类型芯片测量的结果是准确且一致的，这是商业化应用的前提；2)相比于转移和还原氧化石墨烯方法制备的芯片，直接在玻璃基片上生长的石墨烯薄膜光学性质良好，层厚均匀，与基片作用力强，具有更好的灵敏度和准确性，并且使用寿命更长；3)采用该方法制备石墨烯玻璃芯片，整个过程相对简单，可控性强，良品率高，极大地降低了产品的成本；4)基于全反射条件下石墨烯偏振吸收效应的石墨烯折射率传感器具有快速、灵敏、耗样少、高通量等优点，采用该石墨烯玻璃芯片的石墨烯折射率传感器检测灵敏度要优于普通商用SPR检测设备。
附图说明
图1为本发明所制备的石墨烯玻璃芯片。
图2为本发明所采用的石墨烯折射率传感器的核心结构。
图3为本发明所采用的石墨烯折射率传感器的检测光路系统。
图4为本发明所建立的石墨烯玻璃芯片检测不同浓度anti-IgG的响应信号强度。
图5为采用商用BIAcore 100X型SPR传感器检测不同浓度anti-IgG的响应曲线。
图6为本发明所建立的石墨烯玻璃芯片的重复使用情况。
图7为本发明所建立的石墨烯玻璃芯片的特异性检测结果。
具体实施方式
下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂家建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料都可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：石墨烯玻璃芯片的制备
在清洗后的石英玻璃基片上直接利用化学气相沉积技术生长层数可控的石墨烯薄膜，并在石墨烯表面偶联各种生物分子，从而制得如图1所示的应用检测生物分子之间相互作用的石墨烯玻璃芯片。具体方法包括如下步骤：
1)石英玻璃基片清洗：
将15mm×15mm×1mm尺寸的石英玻璃基片分别利用丙酮、异丙醇、超纯水超声清洗10分钟，用氮气吹干；
2)石墨烯生长：
清洗后的石英玻璃基片置于管式炉中，将反应腔压强抽至10Pa以下，然后通入500-1000sccm Ar和500-1000sccm H2，升温至1000-1100℃；待温度稳定后，向反应腔内通入300-500sccm乙醇蒸气，控制反应腔内压强为1000-2000Pa；石墨烯生长时间30-60min，以获得厚度为5-10nm的石墨烯薄膜；生长结束后关闭乙醇供给，并降温；待降至室温后关闭Ar和H2，并取出石墨烯玻璃样品；
3)石墨烯表面处理：
将所得石墨烯玻璃样品下表面石墨烯全部清除，暴露出干净的石英玻璃表面；利用等离子体清洗机(500W)处理石墨烯玻璃上表面的石墨烯，处理时间15s，使石墨烯薄膜含有丰富的羟基基团；
4)生物分子修饰：
将处理后的石墨烯玻璃浸泡到配置好的包含有特定生物分子的缓冲溶液中(如多巴胺、免疫球蛋白等)，在室温下反应10小时，使石墨烯表面偶联一层生物分子；
5)石墨烯玻璃芯片清洗：
使用洗脱液(含1-3％乙酸和0.1-1％SDS的水溶液)反复振荡洗涤石墨烯玻璃芯片6次，每次40min，再使用超纯水振荡洗涤6次，每次40min，从而完成石墨烯玻璃芯片的制备。
我们利用相同的方法和工艺参数，重复制备出10片石墨烯玻璃芯片，对这些芯片的石墨烯厚度进行测量，如表1所示，10组样品石墨烯薄膜厚度偏差不超过±0.1nm，小于单层石墨烯厚度，属于正常测量偏差，说明该方法制备的石墨烯薄膜厚度可以精准控制，并且具有很好的可重复性，从而能够保证多批产品的质量相同，良品率高。
表1为本发明采用相同工艺制备的10组芯片的石墨烯薄膜厚度。
实施例2：石墨烯玻璃芯片在石墨烯折射率传感器中的使用
本发明中的石墨烯玻璃芯片专门适用于基于全反射条件下石墨烯偏振吸收特性的折射率传感器。如图2所示，该类型折射率传感器的核心由光学系统、石墨烯玻璃芯片、微流控系统组成。棱镜、石墨烯玻璃芯片、微流体通道以三明治结构组装在一起，具体为：利用折射率匹配液将芯片玻璃基片一侧与棱镜贴合在一起，并将PDMS微流体通道贴合到芯片石墨烯一侧，石墨烯表面结合的生物分子位于微流体通道中。将组装完成的棱镜/石墨烯玻璃芯片/微流体通道安装到如图3所示的检测光学系统中，采用532nm激光器作为光源，利用1/4波片产生圆偏振光，垂直入射进入棱镜，并在石墨烯界面处发生全反射，反射光采用偏振分光棱镜分成P偏振光和S偏振光，采用平衡探测器探测两束光强度，实时采集信号；利用蠕动泵将待测样品溶液注入微流体通道，经过石墨烯玻璃芯片时与石墨烯上的靶分子发生结合；进样结束后通入缓冲液将通道内未与靶分子结合的待分析物冲走，完成解离过程；测量完成后对石墨烯玻璃芯片进行再生，将于配体结合的分析物彻底洗掉，恢复配体的活性，使得石墨烯玻璃芯片可再次使用。
实施例3：石墨烯玻璃芯片的灵敏度分析
在实施例1的石墨烯玻璃芯片上偶联兔IgG分子作为靶分子，将芯片安装到实施例2所述的折射率传感器上后，利用蠕动泵向芯片表面注入一系列浓度梯度的兔anti-IgG溶液(0.1，0.4，1，2.5，10，25，100μg/ml)，anti-IgG与芯片上的IgG相结合引起石墨烯表面介质折射率发生变化，从而使石墨烯对于S偏振光和P偏振光的吸收发生变化，经偏振分光之后平衡探测器采集到的信号也随之改变。从图4可以看出，随着anti-IgG浓度的升高，探测器的响应值增强，传感器对anti-IgG的检测灵敏度为0.1μg/ml。图5为采用商用BIAcore 100X型SPR传感器检测不同浓度的anti-IgG溶液的结果，检测灵敏度为0.625μg/ml，低于本发明中的石墨烯折射率传感器。
实施例4：石墨烯玻璃芯片的重复使用
对于实施例1制备的石墨烯玻璃芯片，在检测完成之后经过再生过程可将与配体结合的分析物彻底洗掉，恢复靶分子的活性，石墨烯玻璃芯片可重复利用多次。在实施例1的石墨烯玻璃芯片上偶联兔IgG分子作为靶分子，将芯片安装到实施例2所述的折射率传感器上后，利用蠕动泵向芯片表面注入浓度为100μg/ml的anti-IgG溶液，采集传感信号；进样结束后通入磷酸缓冲液(PBS)冲洗掉未与配体结合的anti-IgG分子，完成解离过程；测量完成后通入甘氨酸，彻底冲洗掉与配体结合的anti-IgG分子，完成石墨烯玻璃芯片的再生。再生结束后，芯片可以再次用于检测anti-IgG分子。如图6所示，使用同一片石墨烯玻璃芯片，经过再生过程对100μg/ml的anti-IgG溶液连续进行五次检测，检测结果相同，说明本发明制备的石墨烯玻璃芯片稳定性良好，可以多次使用。
实施例5：石墨烯玻璃芯片的特异性检测
在实施例1的石墨烯玻璃芯片上偶联兔IgG分子作为靶分子，将芯片安装到实施例2所述的折射率传感器上后，利用蠕动泵分别向芯片表面注入浓度为100μg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液和anti-IgG溶液，如图7所示，BSA与芯片表面的IgG分子是非特异性的，因此信号很弱，而anti-IgG与芯片表面的IgG分子发生特异性结合，检测到很强的传感信号，说明本发明中的石墨烯玻璃芯片具有特异性检测的功能。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。