本发明属于农业生产技术领域，尤其涉及一种盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法。
背景技术：
生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。经试验研究苦荞中总黄酮含量丰富。
现有的黄酮含量测定方法有NaNO2-Al(NO3)3法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法等。但这些方法多存在价格昂贵、处理时间较长、偏差高等缺点。徐宝才、丁霄霖采用NaNO2-Al(NO3)3法测定苦荞黄酮含量，得到了偏高的测定结果，且其认为产生该结果的原因为苦荞含有的原儿茶酸等物质对测定结果造成了干扰。罗光宏等认为虽然高效液相色谱法(HPLC)具有分析精度高等特点，但其价格昂贵，且前处理时间较长。刘璐等认为毛细管电泳法具有高效快速等优点，但此方法所需设备较昂贵，且难以寻找组分标准样品。苦荞在不同环境下不同时期各器官总黄酮含量不一样，且各器官产生的影响总黄酮含量测定的干扰物质的含量也不同，因此，现有技术很难低价高效去测定逆境胁迫下不同生长期苦荞的各器官总黄酮含量。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法，旨在解决苦荞在不同环境下不同时期总黄酮含量不一样，现有技术很难低价高效去测定其含量等问题。
本发明是这样实现的，一种盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法，所述盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法为以提取的苦荞总黄酮为材料，用AlCl3法分别测定盐，干旱和UV-B不同胁迫条件下芽期、苗期、成熟期的苦荞各器官中的总黄酮含量。
进一步，所述盐、干旱和UV-B对苦荞总黄酮含量的测定前需进行苦荞的栽培和处理；具体包括：
苦荞的栽培：将苦荞种子萌发后12天的苦荞定为芽期；萌发后23天为苗期；萌发后72天为成熟期；
盐处理：分别在苦荞芽期、苗期和成熟期各选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用100mM NaCl溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌；
干旱处理：分别在苦荞各生长期选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用30％PEG-6000溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌；
UV-B处理：分别在苦荞各生长期选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用UV-B 302nm的灯管照射植物12h，24h，辐射强度为0.1mW/cm2；对照组自然光照射。
进一步，苦荞的栽培和处理后需进行：
样品采集：选取处理后12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦荞的器官，各3份置于60℃恒温箱烘至恒重，用于提取苦荞总黄酮；所述器官包括根、茎、叶、种子。
进一步，苦荞总黄酮的提取方法包括：
分别收集UV-B、干旱和盐胁迫的不同时期苦荞器官样品，60℃烘至恒重，粉碎过60目筛；
精确称0.100g样品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用胶带密封；
超声波破碎细胞，输出功率20％，20min，再12000r/min离心5min，然后将上清液转移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，继续超声波10min，12000r/min离心5min，将上清液转移和合并；
为排除样品中叶绿素的干扰，用等体积石油醚萃取至无色后，收集下层液体，过0.45um滤膜所得样品即为苦荞总黄酮提取液。
进一步，AlCl3法测定总黄酮含量的方法包括：
芦丁标准曲线的制作：取7个10mL容量瓶，首先，依次加入不同体积的芦丁标准品0mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL；然后，分别加入2mL 0.1mol/L AlCl3溶液，混匀后静置10min；最后，分别加入3mL 1mol/L的KOAc溶液，并用65％乙醇定容至10mL，混匀后室温放置30min；此时溶液中芦丁浓度依次为0mg/ml、0.00125mg/ml、0.0025mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，于波长425nm下分别测定吸光度；以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线、回归方程和相关系数；
样品测定：分别取每个处理点的3个黄酮提取样品于10mL容量瓶中，并编号；测定其A425吸光度值并对照标准曲线求得总黄酮浓度，按下式求出总黄酮含量：
式中：Y—样品总黄酮含量(g/100g,％)；
c一依据标准曲线计算出被测液中黄酮浓度(mg/ml)；
m一试样的质量(g)；
v一待测液分取的体积(mL)；
n一待测液稀释倍数。
进一步，芦丁标准曲线的制定中，配制芦丁标准溶液，进行芦丁标准溶液的显色反应，并测定芦丁标准溶液在OD425处的吸光度A值，测定结果；根据芦丁标准溶液对应的吸光值A，绘制芦丁标准曲线，并以最小二乘法求得回归方程：
Y＝34.352+0.0103，相关系数R2＝0.9993。
本发明提供的一种盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法，首次系统的分析了不同逆境(盐、干旱、UV-B)对不同生长期苦荞总黄酮含量变化的分析。
本发明分别使用盐、干旱和UV-B胁迫处理不同生长期的苦荞，结果显示，各器官的总黄酮含量从高到低依次为叶子、籽粒、茎、根。
本发明不同胁迫处理对不同生育期苦荞各器官的总黄酮含量的影响不尽相。在不同胁迫处理下，苦荞根和茎的黄酮含量变化不大，分别维持在1.5％和2.4％左右，成熟期种子也维持在2.6％左右。
附图说明
图1是本发明实施例提供的苦荞总黄酮的提取方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的盐、干旱和UV-B胁迫下苦荞总黄酮含量的测定方法，以提取的苦荞总黄酮为材料，用AlCl3法分别测定盐，干旱和UV-B不同胁迫条件下芽期芽期、苗期、成熟期的苦荞各器官中的总黄酮含量。
进一步，所述盐、干旱和UV-B对苦荞总黄酮含量的测定前需进行苦荞的栽培和处理；具体包括：
苦荞的栽培：将苦荞种子萌发后12天的苦荞定为芽期；萌发后23天为苗期；萌发后72天为成熟期；
盐处理：分别在苦荞芽期、苗期和成熟期各选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用100mM NaCl溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌；
干旱处理：分别在苦荞各生长期选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用30％PEG-6000溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌；
UV-B处理：分别在苦荞各生长期选取长势一致的植株，分为对照组CK和处理组，每组由9盆组成；处理组用UV-B 302nm的灯管照射植物12h，24h，辐射强度为0.1mW/cm2；对照组自然光照射。
进一步，苦荞的栽培和处理后需进行：
样品采集：选取处理后12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦荞的器官，各3份置于60℃恒温箱烘至恒重，用于提取苦荞总黄酮；所述器官包括根、茎、叶、种子。
如图1所示，苦荞总黄酮的提取方法包括：
S101:分别收集UV-B、干旱和盐胁迫的不同时期苦荞器官样品，60℃烘至恒重，粉碎过60目筛；
S102:精确称0.100g样品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用胶带密封；
S103:超声波破碎细胞，输出功率20％，20min，再12000r/min离心5min，然后将上清液转移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，继续超声波10min，12000r/min离心5min，将上清液转移和合并；
S104:为排除样品中叶绿素的干扰，用等体积石油醚萃取至无色后，收集下层液体，过0.45um滤膜所得样品即为苦荞总黄酮提取液。
AlCl3法测定总黄酮含量的方法包括：
芦丁标准曲线的制作：取7个10mL容量瓶，依次加入0mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL不同浓度的芦丁标准品；2mL 0.1mol/L AlCl3溶液混匀后静置10min。加入3mL 1mol/L的KOAc溶液并使用65％乙醇定容至10mL，混匀后室温放置30min，波长425nm测定吸光度；以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线、回归方程和相关系数；
样品测定：分别取每个处理点的3个黄酮提取样品于10mL容量瓶中，并编号；测定其A425吸光度值并对照标准曲线求得总黄酮浓度，按下式求出总黄酮含量：
式中：Y—样品总黄酮含量(g/100g,％)；
c一依据标准曲线计算出被测液中黄酮浓度(mg/ml)；
m一试样的质量(g)；
v一待测液分取的体积(mL)；
n一待测液稀释倍数。
芦丁标准曲线的制定中，配制芦丁标准溶液，进行芦丁标准溶液的显色反应，并测定芦丁标准溶液在OD425处的吸光度A值，测定结果；根据芦丁标准溶液对应的吸光值A，绘制芦丁标准曲线，并以最小二乘法求得回归方程：
Y＝34.352+0.0103，相关系数R2＝0.9993。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料
苦荞种子“川荞3号”。
1.1.2主要试剂和药品
液相RNase清除剂、柱式植物RNAout 3.0试剂盒(购自天泽基因工程有限公司)；逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRR Premix Ex TaqTM‖购自Takara公司。八联管、1.5mL Ep、200μL Ep、1mL Ep、200μL Ep、10μL Ep均为RNase free的一次性制品(购自BIO-RAD公司)。一次性注射器、一次性滤膜、液氮等耗材均为国产。芦丁标准(C27H30O16·3H2O)、AlCl3、CH3COOK、无水乙醇、乙醚、氯仿等药品均为国产分析纯。
1.1.3主要仪器
PCR仪(BIO-RAD，S1000TM Thermal Cycler)，荧光定量PCR(Bio Rad)，-80℃冰箱(Thermo，Forma-86ULT Freezer)，Eppendorf(USA)，高速台式冷冻离心机(Thermo，IEC MICROLITE RF)，核酸蛋白检测仪(BIO-RAD，SmartSpecTM Plus Spectrophotometer)，电泳设备、凝胶成像系统(BIO-RAD)，UV-B灯管(北京光电所)。
1.2方法
1.2.1苦荞的栽培及处理
供试材料系“川荞3号”，2013年3月27日种于四川农业大学农场气象站内，土壤肥力中等。将种子萌发后12天的苦荞定为芽期(子叶盛开)；萌发后23天为苗期(四叶期)；萌发后72天为成熟期(50％以上的籽粒成熟)。
盐处理：分别在芽期、苗期和成熟期各选取长势一致的植株，分为对照组(CK)和处理组，每组由9盆组成。处理组用100mM NaCl溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌。
干旱处理：分别在各生长期选取长势一致的植株，分为对照组(CK)和处理组，每组由9盆组成。处理组用30％PEG-6000溶液浇灌植株，对照组用自来水浇灌。
UV-B处理：分别在各生长期选取长势一致的植株，分为对照组(CK)和处理组，每组由9盆组成。处理组用UV-B(302nm)灯管照射植物12h，24h，辐射强度为0.1mW/cm2。对照组自然光照射。
1.2.2样品采集
选取处理后12h，24h的芽期、苗期、成熟期苦荞的器官(根、茎、叶、种子)，各3份置于60℃恒温箱烘至恒重，用于提取总黄酮。
1.2.3苦荞总黄酮的提取和测定
使用AlCl3法测定总黄酮含量。
1.2.3.1苦荞总黄酮提取
分别收集UV-B、干旱和盐胁迫的不同时期苦荞器官样品，60℃烘至恒重，粉碎过60目筛。精确称0.100g样品至10mL EP，加入3mL 65％乙醇，用胶带密封。超声波破碎细胞，输出功率20％，20min，再12000r/min离心5min，然后将上清液转移至另一EP中，再加2mL 65％乙醇，继续超声波10min，12000r/min离心5min，将上清液转移和合并。为排除样品中叶绿素的干扰，用等体积石油醚萃取至无色后，收集下层液体，过0.45um滤膜所得样品即为苦荞总黄酮提取液。
1.2.3.2 AlCl3法测定总黄酮含量
1.芦丁标准曲线的制作：取7个10mL容量瓶，按表3中依次加入不同浓度的芦丁标准品，2mL 0.1mol/L AlCl3溶液混匀后静置10min。加入3mL 1mol/L的KOAc溶液并使用65％乙醇定容至10mL，混匀后室温放置30min，波长425nm测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线、回归方程和相关系数。
2.样品测定：分别取每个处理点的3个黄酮提取样品于10mL容量瓶中，编号8-10。测定其A425吸光度值并对照标准曲线求得总黄酮浓度，按下式求出总黄酮含量：
式中：Y—样品总黄酮含量(g/100g,％)；
c一依据标准曲线计算出被测液中黄酮浓度(mg/ml)；
m一试样的质量(g)；
v一待测液分取的体积(mL)；
n一待测液稀释倍数；
表1 AlCl3法测定总黄酮含量
2结果与分析
2.1芦丁标准曲线的制定
按表1配制芦丁标准溶液，按1.2.3.2进行芦丁标准溶液的显色反应，并测定其在OD425处的吸光度A值，测定结果如表2。芦丁标准溶液对应的吸光值A，绘制芦丁标准曲线，并以最小二乘法求得回归方程Y＝34.352+0.0103，相关系数R2＝0.9993。
表2芦丁标准溶液吸光值
Table 7Absorbance of Rutin Standard Solution
2.2盐，干旱和UV-B胁迫下不同生长期苦荞总黄酮含量的测定
2.2.1盐，干旱和UV-B胁迫下芽期苦荞总黄酮含量
以1.2.3.1中提取的苦荞总黄酮为材料，用AlCl3法分别测定不同胁迫条件下芽期苦荞各器官中的总黄酮(mg/100mg干重，％)。苦荞芽期中的总黄酮主要集中在叶子中，茎次之，根中最低。逆境胁迫前，对照组叶子的总黄酮含量为7.56％，其含量约为茎中的3倍，为根中的6倍。盐胁迫后，芽期苦荞叶子中的总黄酮含量显著升高(P<0.05)，根、茎中的总黄酮含量显著下降(P<0.05)。干旱处理后，芽期苦荞根、茎中的总黄酮含量显著下降(P<0.05)，叶子中的总黄酮含量变化不显著。UV-B胁迫后，芽期苦荞叶子中的总黄酮含量极显著升高(P<0.01)，根、茎中的总黄酮含量显著下降(P<0.05)。在不同逆境中芽期苦荞根、茎中总黄酮含量显著下降，然而在叶子中的总黄酮含量(除干旱胁迫)均显著上升(P<0.05)；不同胁迫处理中，UV-B处理下的叶子总黄酮含量最高，表3。
表3芽期苦荞根、茎和叶在不同逆境下的总黄酮含量
注：每组数据分别表示各器官的总黄酮含量，由3组重复实验数据的均值±标准误差组成。以“*”表示不显著(P>0.05)，无“*”的代表显著(P<0.05)。
2.2.2盐，干旱和UV-B胁迫下苗期苦荞总黄酮含量
苦荞苗期中总黄酮含量主要集中在叶子中，茎次之，根中最低。逆境胁迫前，对照组叶子的总黄酮含量为3.66％，其约为根、茎总黄酮含量的5倍。盐处理后，苗期苦荞根、茎、叶中的总黄酮含量均显著升高(P<0.01)，叶子、茎、根的总黄酮含量分别增加了1.7％、0.75％、0.34％。干旱处理后，苗期苦荞根、茎、叶中的总黄酮含量均极显著升高(P<0.01)，叶子、茎、根的总黄酮含量分别增加了1.5％、0.74％、0.28％。UV-B处理后，苗期苦荞叶子中的总黄酮含量极显著的升高(P<0.05)，胁迫24h后的含量为8.47％，其含量为对照组的2.314倍，根中总黄酮的含量变化不显著(P>0.05)，在UV-B处理12h后，根中总黄酮含量变化不显著，处理24h后，根中总黄酮含量增加了0.1％。在不同逆境中苗期苦荞根、茎、叶均显著升高(P<0.05)；不同胁迫中，UV-B处理下叶子总黄酮含量最高，但处理后根的总黄酮含量基本不变，表4。
表4苗期苦荞根、茎和叶在不同逆境下的总黄酮含量
注：每组数据分别表示各器官的总黄酮含量，由3组重复实验数据的均值±标准误差组成。以“*”表示不显著(P>0.05)，无“*”的代表显著(P<0.05)。
Note:Each data represent the total flavonoid content of each organization,each value is the mean of 3replicates,and error bars indicate standard deviations."*"indicates not significant(P>0.05),no"*"on behalf of a significant(P<0.05).
2.2.4盐，干旱和UV-B胁迫下成熟期苦荞总黄酮含量
苦荞成熟期中总黄酮含量主要集中在叶子中，种子、茎次之，根中最低。逆境胁迫前，对照组中叶子的总黄酮含量为7.90％，种子为1.35％。盐胁迫处理后，成熟期苦荞根、茎、叶、种子的总黄酮含量均极显著升高(P<0.01)，胁迫24h后，根、茎、叶、种子中的总黄酮含量分别比对照组的总黄酮含量增加了2.05％，3.24％，2.55％，2.45％。干旱胁迫处理后，成熟期苦荞根、茎、种子中的总黄酮含量均显著升高(P<0.05),叶子中的总黄酮含量显著下降(P<0.05)。根、茎、种子中的总黄酮含量分别比对照组的总黄酮含量增加了0.62％、2.24％、2.45％，叶子中的总黄酮下降了1.15％。UV-B胁迫处理后，成熟期苦荞根、茎、叶、种子中的总黄酮含量均显著升高(P<0.05)，胁迫12h后，根、茎、叶、种子的总黄酮含量分别比对照组的总黄酮含量增加了1.31％、1.2％、2.16％、1.35％。在不同逆境中成熟期苦荞根、茎、种子中的总黄酮含量均显著升高(P<0.05)，叶子的总黄酮含量有升高也有下降，表5。
表5花期苦荞根、茎和叶在不同逆境下的总黄酮含量
注：每组数据分别表示各器官的总黄酮含量，由3组重复实验数据的均值±标准误差组成。以“*”表示不显著(P>0.05)，无“*”的代表显著(P<0.05)。
3讨论
3.1逆境胁迫下不同生长期苦荞各器官的总黄酮含量
植物中的黄酮类物质广泛的参与了其抗逆应答。我国苦荞主要种植于高纬度、高寒、干旱、紫外辐射强烈的边远山区，环境相对恶劣。为了适应恶劣的环境，苦荞可能通过调控黄酮和其它物质的合成来预防高盐、干旱UV-B等对生长发育的不利影响。
苦荞可通过调控黄酮来吸收UV-B的辐射，由此形成一种自我保护机制，有效的免受UV-B带来的损伤。Kreft等为了检测三种不同程度的UV-B辐射对苦荞芦丁含量的影响，发现苦荞芦丁含量在环绕UV-B下最高，其次是增强UV-B，然后是减弱UV-B，同时发现苦荞的叶子比花对UV-B胁迫处理要敏感，在环绕UV-B辐射下叶子的芦丁含量增加了97％，花的芦丁含量增加了19％。Suzuki等分别采用UV-B、寒冷和干旱胁迫处理苦荞叶子，发现苦荞叶子芦丁含量在UV-B、寒冷和干旱胁迫处理下分别增加了129％，190％和122％，同时还增加芦丁糖苷酶的活性。Jeong-Ho Lim等利用不同浓度的NaCl处理苦荞芽，结果显示苦荞芽的黄酮类物质有着不同程度的增加，其中100mM NaCl处理7天后，苦荞芽的黄酮含量增加了153％。蔡娜等水分胁迫苦荞，结果显示水分胁迫能促使苦荞总黄酮和芦丁的合成与积累。
在营养生长期(芽期、苗期)，苦荞各器官的黄酮含量由高到低依次是叶、茎、根。本发明中，芽期苦荞的叶子对外界坏境的变化和胁迫较其它器官敏感，导致叶子中总黄酮的含量变化与根、茎中的总黄酮含量变化存在一定差异。在盐、干旱和UV-B 3种不同胁迫处理下，根和茎中总黄酮含量均下降，其中根中总黄酮的含量下降极显著(P<0.01)，而叶子中的总黄酮含量则显著的上升(P<0.05)，其中干旱和UV-B处理24h后，叶子中的总黄酮含量有所下降。原因可能在于：在面对盐、干旱胁迫时，虽然苦荞的根是最先受到刺激，但由于植物的根主要是吸收和供给矿物质等，而不是合成代谢的主要区域，只能消耗总黄酮来克服盐和干旱胁迫造成氧自由基等升高所造成的伤害。由于茎面临盐、干旱和UV-B胁迫是次要的，其主要是起营养传输功能，因此茎中的总黄酮含量下降不是很明显。由于叶子是合成代谢的主要区域，在受到外界刺激，如盐、干旱、UV-B胁迫时，叶子会快速合成相关物质来抵御这种不良的刺激，因此，在面临不同逆境时叶子中总黄酮含量会显著上升。当叶子长期在UV-B、干旱下，会因叶面被灼伤，氧化胁迫等而引起有关光合作用的酶失活或变性，导致总黄酮的合成下降，同时其合成的部分黄酮类物质会被传送到其他器官中，从而引起干旱、UV-B处理24h后叶子中总黄酮的含量下降。
在盐、干旱和UV-B 3种不同胁迫处理下，苦荞苗期的根、茎、叶中总黄酮含量均显著上升(P<0.05)，其中叶子经UV-B胁迫后总黄酮含量提高极为显著(P<0.01)，达到8.47％。通过对比胁迫前对照组与胁迫后的处理组的总黄酮含量表明：盐、干旱和UV-B均可刺激苦荞的黄酮合成和积累，且叶中总黄酮的含量变化要较茎、根中的显著。造成这种现象的原因可能是：根主要是吸收和供给矿物质等，基本不含色素类物质；茎主要是起营养传输功能，其蛋白质含量和色素类物质的含量都比叶子中的低；因此，叶片中抗逆相关的蛋白或黄酮类物质必须被高效的合成并积累以此来抵抗不同逆境带来的损伤。
4结论
本发明首次系统的分析了不同逆境(盐、干旱、UV-B)对不同生长期苦荞总黄酮含量变化的分析，
(1)分别使用盐、干旱和UV-B胁迫处理不同生长期的苦荞，结果显示，各器官的总黄酮含量从高到低依次为叶子、籽粒、茎、根。
(2)不同胁迫处理对不同生育期苦荞各器官的总黄酮含量的影响不尽相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。