改进的怀孕测试装置及方法与流程

本发明涉及怀孕测试装置，且涉及执行怀孕测试的方法，且涉及制造该装置的方法。

本发明的背景

简单侧向流免疫测定装置已被开发和商业化以用于检测流体样本中的分析物，例如见EP291194。此装置通常包括多孔载体，多孔载体包括能够结合至所述分析物的干燥的、可动的标记的结合试剂，且可动的结合试剂还能够结合至在标记的结合试剂下游的检测区域处提供的分析物。在检测区域处检测可动的标记的结合试剂提供了分析物在样本中存在的指示。

备选地，当所关注的分析物是半抗原时，免疫测定装置可应用竞争反应，其中标记的分析物或分析物相似物与存在于样本中的分析物竞争来结合至检测区域处的可动的结合试剂。备选地，化验装置可应用抑制反应，由此可动的分析物或分析物相似物在检测区域处提供，化验装置包括用于分析物的可动的标记的结合试剂。

化验装置可能能够检测多于一种分析物的存在和/或量。例如，在检测滥用药物的存在的化验的情况下，装置可能能够确定药物的整个画面。此侧向流免疫测定装置大体上设有多个检测区域，此区域在化验装置内设在单个或多个侧向流载体上。

确定化验的结果传统上由眼执行。然而，此装置需要由用户解释结果，这引入了不期望的主观程度，特别是在检测区域的强度微弱时的低分析物水平下。

因此，已经开发了数字装置，其包括布置成确定化验结果的光学检测器件，以及显示化验结果的显示器件。与化验测试带组合使用以用于确定液体样本中的分析物的浓度和/或量的数字化验读出器称为包括集成数字化验读出器的化验装置。此装置的示例在EP 1484601中公开。

来自光源(诸如发光二极管(LED))的光照到多孔载体的一部分上，且反射或传输的光由光电检测器检测。通常，读出器将具有多于一个LED以照亮载体的多个区域，且对应的光电检测器提供成用于该多个LED中的每一个。EP 1484601公开了用于侧向流测试带数字读出装置的光学布置，其包括挡板布置，从而允许减少装置中的光电检测器的数量的可能性。

前述类型的化验技术已经实施成“自测试”怀孕测试装置。通常，存在由怀疑其可能怀孕的女性使用的装置。因此，它们必须设计成使得它们容易使用(不需要任何医疗或技术培训)，且通常在单次使用后可弃置。该装置通常是侧向流免疫测定装置，且通常通过使侧向流化验棒的采样部分与尿样本接触来开始。化验棒的采样部分可浸没到容器中的尿样本中，或更通常地，用户可直接排尿到采样部分上。化验然后运行，而不需要女性执行任何进一步的步骤，且结果指示且由眼读出，或在数字装置中，由化验结果读出器件确定且借助于显示器(诸如，例如，液晶显示器(LCD))向用户显示。

此类常规怀孕测试通过测量样本中的人体绒膜促性腺激素(hCG)来工作。hCG通过生长胚胎产生，且样本中的hCG浓度高于一定阀值将触发阳性(即“怀孕”)结果。

需要改进的怀孕测试，尤其是改进的自测试怀孕测试：许多女性希望尽可能快地知道她们是否怀孕，且因此需要非常灵敏的测试，该测试能够检测非常低的浓度下的样本(诸如尿)中的hCG。然而，这产生了问题，因为hCG有时可因为除了怀孕之外的原因在尿中以相对低的浓度出现，使得非常灵敏的怀孕测试可能给出错误的阳性结果(即，化验的特异性降低)。

作为这种情况的说明，与未孕相关联的hCG可在尿样本中存在。更特别地，hCG可在来自近更年期和后更年期的女性的尿中存在，且来自垂体而非生长胚胎。在怀孕检测中，这种来自垂体腺的hCG或其他与未孕相关联的hCG将导致怀孕的错误阳性结果。在许多国家，女性推迟直到一生中较晚才开始家庭，例如，由于工作或其他约束，且因此用于‘家用’或自测试怀孕测试装置的小但重要的市场由可能落入到近更年期或后更年期档的年长女性组成，且因此易受错误的阳性结果(如果使用灵敏的hCG化验)影响。根据一项研究，高达10%的OTC怀孕测试销售给大于40岁的女性(Leavitt SA 2006, “A private little revolution: the home pregnancy test in American Culture”. Bull. Hist. Med. 2006; 80:317-45)。

根据世界卫生组织，“更年期”和“近更年期”的公认的限定如下：

更年期(自然更年期)-限定为由失去卵巢卵泡活动引起的永久停经。在无月经连续12个月(没有其他明显病理或生理学原因)之后，可认为已经发生自然更年期。更年期随着最终月经期(FMP)发生，其仅在该事件之后追溯一年或更长才确定已知。

近更年期-用语近更年期包括在更年期之前不久的时段(当接近更年期的内分泌学、生物学和临床特征开始时)以及更年期之后第一年。

因此，对于本目的，近更年期女性限定为也处于上文根据WHO限定的近更年期的那些女性，且后更年期女性限定为已经经历上文根据WHO限定的更年期的那些。

自测试或“家用”怀孕测试需要可靠以确保女性在接收其测试结果时采取适当动作。期望的可靠性目标是> 99%准确度(即，组合的错误阳性和错误阴性率为1%或更低)。当前可用的自测试或家用测试装置可按25mIU/ml的浓度以>99%的灵敏度检测尿hCG。此装置可实现期望的>99%准确度目标，但仅在被试者预期她的经期开始的那天(即，预期的月经流血第一天)或之后使用的情况下，因为从该时间点，几乎所有怀孕的女性具有25mIU/ml或更高的尿hCG浓度，且与未孕相关联的hCG的水平通常绝不会达到此水平。然而，情况是，如果女性在她预期的经期的那天之前使用自测试装置，则错误的阴性结果是可能的，因为尿hCG浓度还未达到可由测试检测的水平。因此，当在预期经期的那天之前使用时，当前可用的常规自测试怀孕测试装置不是99%准确。事实上，排卵之后10天，尿中的hCG中值水平是大约8.4mIU/ml，且来自这一天的仅大约10%的样本将具有>25mIU/ml的hCG浓度。因此，在怀孕中如此早使用具有25mIU/ml灵敏度的常规自测试装置将看到非常低的怀孕检测率。排卵之后11天，中值水平升高至19.8mIU/ml，因此在此阶段，少于50%的女性将可能接收阳性结果。基于25mIU/ml测试灵敏度，之后测试的检测率将为近似70%(12天)、80%(13天)、接近100%(14天)。简单地使用更灵敏的测试不是解决方案，因此这将增加错误的阳性结果的风险(由于检测与未孕相关联的hCG的增加的可能性)，因此测试将仍不是>99%准确。

因此存在对这样的怀孕测试装置(尤其是自测试或家用测试装置)的需要，其能够以>99%准确度检测怀孕，即使是在怀孕中早于预期经期的那天的较早时间点使用时。

在不同的情境下，在许多国家，在执行可能损害生长的胎儿的任何医疗干预之前，血清hCG的测试通常在几乎所有育儿年龄的女性患者上执行。由于近更年期和后更年期女性中“垂体”hCG的升高的血清hCG水平的问题是公认的。Snyder等(Clinical Chemistry 2005 51, 1830-1835)检查未孕女性的血清hCG浓度随年龄的变化，且研究使用血清促卵泡激素(FSH)测量作为辅助来解释高于预期hCG的结果。他们提出，血清hCG测量、知道被试者的年龄以及血清FSH测量的组合可用于降低或避免“错误阳性”怀孕结果。然而，这些工作者不关注自测试怀孕测试，且具体而言不关注在非常早的阶段检测怀孕。

本发明的概要

第一方面，本发明提供了一种检测人类女性被试者中的怀孕的测试装置，该测试装置包括：

用以测量来自被试者的样本中的hCG的绝对或相对量的化验器件；

用以测量来自被试者的样本中的FSH的绝对或相对量的化验器件；

以及用以测量来自被试者的样本中的一种或多种孕酮代谢物的绝对或相对量的化验器件。

样本可为任何适合的身体流体，诸如全血、血浆、血清或尿。然而，强烈推荐尿样本，因为此样本可容易获得且不需要执行侵入程序。此外，使用尿样本便于由用户自测试。

在此情境下，样本中存在的分析物的量可按绝对项(例如，按照每单体体积数值)或按相对项(例如，参照预定阀值)确定。具体而言，“一种或多种孕酮代谢物的相对量”不意在表示样本中的不同孕酮代谢物的浓度与彼此比较，而是一种或多种此分析物的浓度可与预定阀值比较。化验器件将适于且构造成测量其相应分析物，但如下文论述，一种化验器件可适于且构造成测量两种或更多种不同分析物的量。

作为说明，在受精之后，进一步的排卵周期不必要，因为女性已经怀孕。因此，在受精之后，通过抑制FSH产物来抑制卵泡形成。因此，在怀孕女性中，人们将预期观察到升高的hCG水平和低的FSH水平。因此，测量FSH可用于帮助解释检测略微升高的hCG水平的意义，尤其在怀疑这可能由于与未孕相关联的来源时。

作为进一步说明，在怀孕的前10-12周期间，由黄体产生的孕酮支撑子宫内膜，因此允许怀孕继续。孕酮水平在月经周期的黄体期的部分期间升高，但如果怀孕未发生(即，如果被试者行经)，则该水平降回基线水平。然而，如果怀孕发生，孕酮(及其尿代谢物)的水平将保持升高，且将贯穿怀孕继续上升，使得孕酮(及其尿代谢物)可用作hCG的附属来作为怀孕的额外确认。

测试装置将优选地还包括用于解释化验结果以确定怀孕测试的成果的器件，以及优选地用于显示测试的成果的显示器件。

第二方面，本发明提供了一种检测人类女性被试者中的怀孕的方法，该方法包括使来自被试者的样本与根据上文限定的第一方面的测试装置接触的步骤。如上文所述，样本优选为尿样本。

本发明的优选特征将在下文更加详细地描述。将明显的是，在这些关于第一方面的测试装置描述之处，它们将同等地应用于第二方面的方法(且反之亦然)，除非上下文另外指出。

测试装置可包括基于微流体的化验，其具有一个或多个加工的毛细管通道(通常是限定的开孔)，液体样本可沿毛细管通道流动，但更优选地，测试装置包括侧向流化验。测试装置可包括微流体化验和侧向流化验两者。在一个实施例中，测试装置将包括三个侧向流化验，其中一种化验用于三种分析物(即，hCG；FSH；和孕酮代谢物)中的每一种中的相应一者。

在一些实施例中，可期望对于一种具体分析物具有多于一种化验。例如，一种化验可能为微流体化验，且另一种化验可能为侧向流化验。备选地，用于分析物的两种化验可能为微流体化验或可能为侧向流化验。在用于分析物的两种化验都是侧向流化验之处，它们可能在单个侧向流测试带上或在相应侧向流测试带上。

例如，在怀孕早期，hCG水平指数地增加，且因此，取决于被试者已经怀孕多久，来自怀孕被试者的尿样本中的hCG的浓度可相当大地变化。因此，可能期望提供对于hCG而言是相对高灵敏度的化验的一种化验以及对于hCG而言是相对低灵敏度的化验的一种化验，使得样本中的hCG的浓度可在扩展的浓度范围上确定。(作为说明，高的分析物水平可引起复杂化，称为钩状效应。这可由于受限的化验范围而在高灵敏度化验中引起不准确，且因此提供具有降低灵敏度的化验可为有利的，从而允许在非常高的分析物水平下进行准确测量)。

通常，孕酮不以可检测的量存在于尿中。而是，它被代谢，且各种孕酮代谢物在尿中排泄。本发明的化验因此适于测量尿中的一种或多种孕酮代谢物。孕酮代谢物可分成4组：孕二醇、孕(甾)烷醇酮、孕(甾)二酮，以及包含比孕二醇极性高的化合物的最后一组。理论上，来自这四组中的任一者的一种或多种代谢物可适合用于本发明中的测量。优选示例包括孕(甾)烷醇酮(3α-羟基-5β-pregnan-20-one)和孕二醇(5β-孕烷-3α-20 α-二醇)。后一化合物尤其优选用于测试，由于它是大体上在尿中存在的最高浓度的孕酮代谢物(Cooke, I.D. 1976, Progesterone and its metabolites. In : Lorraine, J.A. & Bell, E.T. (eds) “Hormone Assays and their Application” pp 447-508)。对于本领域中技术人员而言将明显的是，对例如孕二醇和孕(甾)烷醇酮的参照包含其通常出现的衍生物，除非上下文另外指出。具体而言，孕酮代谢物通常在尿中存在为葡糖苷酸，或有时为硫酸盐。因此，本文对例如孕二醇的参照具体而言包含孕二醇-3-葡糖苷酸(“P-3-G”)，或有时称为PdG。此外，本文对“孕酮”或“孕酮化验”的参照意在具体而言分别包含孕酮代谢物以及用于孕酮代谢物的化验，除非上下文另外指出。

将了解的是，孕酮的各种代谢物的结构同源性的程度且因此抗原类似性可非常高。因此，在基于免疫学的化验中，以第一结合亲和性结合至特定孕酮代谢物的抗体可以以第二结合亲和性结合至不同的孕酮代谢物，第二结合亲和性可不比第一结合亲和性显著低，使得抗体可一定程度上交叉反应。备选地，可应用高特异性抗体，其对于特定孕酮代谢物比对于存在于人类尿中的其他孕酮代谢物具有高得多(例如，至少10倍或更高)的结合亲和性。因此，用于“结合亲和性”的化验可经常检测多种不同的孕酮代谢物。任何试剂对不同孕酮代谢物的交叉反应的程度对于本发明都不是关键的，但本领域技术人员将了解，在其他特性之中，这可需要在选择试剂以及选择适当“阀值”方面考虑，如下文论述的那样。

类似地，人类的FSH存在若干变体，其可在尿中存在(例如，片段，诸如分离β链)，以及异构体(见Walton W.J. 等, J Clin Endocrinol Metab., 86, 3675-85, 2001; Dahl, K.D. 和 Stone M.P. J Andrology, 13, 11, 1992；以及aenziger, J.U. 和 Green E.D Biochem. et Biophys. Acta , 947, 287-306, 1988)，例如具有变化的糖基化程度，且基于免疫学的化验可使用相对特异性地结合至FSH的单个变体、片段或异构体的抗体，或可使用以可接受地高亲和性结合至若干不同人类FSH变体的较不特异的抗体。再次，这可对在化验中选择的试剂的选择和/或阀值的选择具有影响，但这大体上对本发明的工作不关键。类似的意见适用于hCG及其变体。

在大体方面，本发明下面的概念实现的是，非常高灵敏度的hCG化验可用于非常早地检测怀孕，且通过FSH和孕酮代谢物的额外测量，测试的特异性可维持在可接受地高水平(即，避免由于检测来自与未孕相关联的来源的hCG而引起的错误的阳性结果的高数量)，而不需要知道被试者的年龄。化验装置尤其适合作为简单P℃，或更特别地，自测试装置，而不需要为其使用的任何医疗或技术培训。具体而言，化验装置优选在单次使用后弃置。此外，装置期望地为简单的侧向流或基于微流体的装置，其中，一旦装置与足够量的尿样本接触，各种化验就自动执行，而不需要任何进一步的用户干预。进一步优选的是，装置是数字装置，即，读出且显示化验的成果给用户。

具体而言，本发明的化验装置优选是自测试或家用测试装置。在优选实施例中，化验装置具有>99%的准确度，即使是在预期经期的那天之前使用。更特别地，本发明的化验装置可实现>99%的准确度，即使早在预期经期的那天之前2天使用，优选即使早在预期经期的那天之前3天使用，优选即使早在预期经期的那天之前4天使用，且优选即使早在预期经期的那天之前5天使用，且更优选即使早在预期经期的那天之前6天使用(例如，如参照LH峰或LH波计算的那样)。

对hCG的测试可能指示阳性(怀孕)结果(即，其中尿hCG高于预定阀值的那些样本)，其可由FSH和孕酮代谢物化验的结果来确认(或否认)。因此，例如，hCG水平正好在预定阀值之上，伴随升高的FSH水平和低孕酮代谢物水平，指示了被试者未怀孕(且暗示升高的hCG水平是与未孕相关联的起源)。

以此方式，本发明提供了怀孕测试，其可以以高灵敏度(即，检测怀孕被试者中的99%或更多)、以高特异性(即，1%或更低的错误阳性率)检测怀孕，且此外可实现这些结果，甚至在被试者包括近更年期和后更年期女性时；且甚至更意外地，在怀孕的非常早期阶段的单个时间点(天)(即，甚至在预期经期的那天之前)，且没有任何其他外部信息(诸如，例如被试者的年龄)。

本发明的另一个优点在于，它可避免错误的阴性结果，其可在被试者具有非常高水平的hCG β核心片段时随关注点的基于hCG的怀孕测试装置出现。该问题在本领域中公认，且例如由Gronowski等(2009 Clinical Chemistry 55, 1389-1394)描述。这是因为，由过量β核心片段的抑制效应引起的人为的低hCG信号将由FSH和孕酮代谢物的化验结果(其将不受过量β核心片段影响)补偿。

有利地，单个尿样本将用于为由本发明的化验装置/方法执行的(至少)三种分析物化验中的每一者提供测试样本。常规地，所有三种分析物化验将大致同时执行，优选使用施加至化验装置的单个尿样本。这可特别通过下文描述的实施例方便地完成。

为了本目的，当使用从排尿的相同段得到的尿样本执行测试时，三种化验测试将“大致同时”执行，且化验的结果在各自的10分钟时段内、优选在各自的5分钟内、更优选在各自的3分钟内、且最优选在各自的60秒内读出。期望地，通过用户将尿样品施加至测试装置的样本接触部分，所有三种分析物测试在大致相同时间处(即，在各自的60秒内)开始。

在优选实施例中，本发明的各种方面拥有以下特点中的一者或多者(期望地全部)：

(i)99%或更高的灵敏度；

(ii)99%或更高的特异性；

(iii)能够实现(i)和(ii)，即使测试日在怀孕早期(即，早于预期经期的那天，如本文限定的那样)；

(iv)能够实现(i)和(ii)，即使在单个时间点(即，在单日)执行测试/使用化验装置一次；

(v)化验装置/方法不需要任何外部信息(例如，女性的年龄，或被试者的任何历史，诸如之前测量hCG、FSH或孕酮)；以及

(vi)能够实现(i)和(ii)，即使被试者包括近更年期和/或后更年期女性(如本文限定的那样)。

为了本说明书的目的，怀孕“早期”意思是早于预期经期的那天，如参照在排卵时间或其附近出现的在女性中检测的促黄体生成激素[“LH峰”]的峰值水平计算的那样。作为说明，预期经期的那天通常假设为LH峰之后15天。

本发明者已经使用本发明的设备和方法计算出，将可能以99%或更高的灵敏度以及99%或更高的特异性建立正确怀孕状态，即使在近更年期和后更年期女性之中从单个时间点处的化验。

预期经期的那天可参照某个时间点计算。具体而言，预期经期的那天可参照LH波的那天(即，在周期中第一次检测到LH水平的明显显著增加的那天)计算，该事件通常在LH峰之前大约12-24小时发生。预期经期的那天还可通过将通常周期长度(按天)加至上次月经期的日期来计算。计算预期经期的其他方式包括将28天加至上次月经期的日期。

大体上来说，分析物化验的结果将在经过特定时间之后确定(通常，但不一定，参照样本与化验装置的采样区域接触的时间确定)。确定分析物化验结果的时间可称为t_E。化验结果读出装置包括某种集成计时器件，以便确定何时达到t_E。计时器件可通过使样本与化验装置接触(例如，通过液体样本允许电流流过)而自动启动，或可由用户(例如，压下开关等)或由其他方便的手段触发。化验反应可在t_E处方便地达到平衡，但这不重要。对于所有分析物化验，可同时达到t_E，或t_E可对于不同分析物不同。

在一些实施例中，如果分析物化验信号在t_E处仍低于上阀值，则化验的结果为阴性(在那些形式中，其中所关注的分析物的存在引起信号的形成)。化验的终点可能不一定是反应的完成。事实上，通常在反应完成之前认为已经达到终点t_E。

t_E终点可方便地通过读出器参照特定时间点来确定(即，在化验开始之后的特定时间量，例如在读出器启用之后和/或将化验棒插入读出器中和/或将样本施加至测试棒之后特定时间间隔，可认为发生t_E)。为了说明的目的，t_E将通常在化验开始之后1到10分钟之间、优选1到5分钟之间发生。

期望地，化验结果读出器将编程成以便在获得中间信号的情况下重复测量。在简单得实施例中，测量在t_E处重复。然而，优选地，测量在终点之前重复一次或多次。最优选地，读出器装置编程成按规律时间间隔(例如，1秒或5秒时间间隔)重复测量，直到信号超过上阀值或直到达到t_E，无论哪个先发生。

期望在化验结果读出器中包括时钟或其他计时装置，使得读出器可在没有进一步用户输入的情况下自动按预定时间点进行测量。

因此，例如，读出器可编程成在初始时间点t_o进行测量，且(如果必要)之后以任何期望的时间间隔进行重复测量，直到信号超过上阀值或达到t_E，如上文描述的那样。

此外，时钟或其他计时装置便于读出装置确定信号积累的速率。如果在两个或更多个时间点(带有已知时间分隔)进行信号量的测量，则信号积累的速率可容易地计算。

应当注意的是，信号积累的速率或量可按绝对项或相对值测量(例如，相比于控制或其他比较值，可选地从大致同时反应获得)。

具体而言，在一些实施例中，如果一种或多种分析物化验读数远远高于或低于(如适当)特定相关阀值水平，则化验结果读出器可在达到t_E之前确定化验结果(即，怀孕或未怀孕)。以此方式“较早”确定化验结果在EP 1484613中描述。在本情况下，例如，如果样本中的FSH的量高于预定上阀值(处于从未观察到怀孕的水平)，则FSH化验信号将非常快地生成，且这将允许化验结果读出器(或人类观察者)在t_E之前确定化验的结果为“未怀孕”结果，可能不需要等待以分析hCG和/或孕酮代谢物化验的结果。类似地，如果样本中的孕酮代谢物的水平非常低(例如，低于1 µg/ml)，则非常强的孕酮代谢物化验信号将在用于达到孕酮代谢物化验的t_E之前非常快速地生成，从而允许较早确定化验结果为“未怀孕”，再次可能不需要读出hCG化验和/或FSH化验。

化验结果的“较早”确定可对于三种分析物中的任一者在达到t_E之前执行；或对于三种分析物中的两者的任何组合(即，hCG和孕酮；孕酮和FSH；孕酮和FSH)，在达到t_E之前执行；或对于三种分析物中的仅一者在达到t_E之前执行(即，对于三种分析物中的另外两者，在t_E时或之后)。

类似地，对于所有三种分析物化验、或三种分析物化验中的任一者、或三种分析物化验中的两者的任何组合，可存在下阀值、中间阀值和上阀值。

测试装置将包括至少一个流路，优选至少两个流路，且通常三个或甚至四个流路。

为了本发明的目的，用语“流路”指能够将液体从第一位置传送至第二位置得基底，且可例如为毛细管通道、微流体路径或多孔载体(诸如侧向流多孔载体)。多孔载体可包括一种或多种多孔载体材料，其可以以线性或堆叠布置重叠，或其流体地连接。多孔载体材料可为相同或不同的。测试装置的各种化验可设在单独的基底上，或它们可设在公共基底上，使得沿一个化验的流路传送的液体不能够跨越不同化验的流路。例如，第一和第二化验可设在相同多孔载体上，使得第一和第二流路与彼此隔离。这例如可通过激光切割多孔载体的部分而使其非多孔来实现，因此分开第一和第二化验。备选地，非多孔阻挡材料可沿带施加，以在相同多孔载体上提供两个或更多个流路(通常基本平行)。在其他实施例中，单个流路可适应用于两种或甚至三种不同分析物的测试。例如，单个流路可包括用于测试hCG的试剂且还可包括用于测试孕酮代谢物的试剂。备选地，单个流路可包括用于测试hCG和FSH的试剂；或单个流路可包括用于测试FSH和孕酮代谢物的试剂。具体而言，流路可包括两个检测区域，对于每种分析物一个，其中标记的试剂可倾向于以与样本中的相应分析物的浓度成比例(直接或相反)的方式积累。

测试装置中的一个或多个流路可包括侧向流多孔载体。可用作多孔载体的适合的材料包括硝化纤维、醋酸纤维、纤维素或纤维素衍生物、聚酯、聚酰胺、聚烯烃或玻璃纤维。多孔载体可包括硝化纤维。这具有的优点在于，结合试剂可牢固地固定，而不需要之前化学处理。例如，如果多孔固相材料包括纸，则抗体的固定可由使用的化学耦合(例如CNBr、羰基二咪唑或三氟代乙烷磺酰氯氯化)执行。

本发明的化验装置/方法通常使用一种或多种结合试剂。通常，hCG化验使用结合至hCG的结合试剂，FSH化验使用结合至FSH的结合试剂，孕酮代谢物化验使用结合至孕酮代谢物的又一种结合试剂。具体而言，化验可包括使用标记的结合试剂。如其它地方论述的那样，可能使用结合至hCG和FSH两者的标记的结合试剂，因为这两种分子具有一些共同的结构。

为了本目的，用语“结合试剂”指结合对(即，两种不同的分子，其中，分子中的一者与第二种分子通过化学和/或物理手段结合)的成分。这两种分子在其彼此结合的意义上相关，使得它们能够从具有类似特点的其他化验组分区分其结合伙伴。结合对的成分称为配合体和受体(反配合体)，结合对成分和结合对伙伴等。分子也可为分子的集合的结合对成分；例如，抗体相对于第二抗体的免疫复合物产生，且其对应的抗原可认为是免疫复合物的结合对成分。

除了抗原和抗体结合对成分之外，其他的结合对包括(合为示例而非限制)，生物素和抗生物素蛋白，碳水化合物和外源凝集素，互补核苷酸序列，互补肽序列，效应器和接受器分子，酶辅因子和酶，酶抑制剂和酶，肽序列和针对该序列或整个蛋白质的抗体，聚合酸和碱，染料和蛋白质结合剂，肽和特定蛋白质结合剂(例如，核糖核酸酶、S肽和核糖核酸酶S肽)等。此外，特定结合对可包括与原始特定结合成分相似的的成分。

在标记的结合试剂的语境下使用的“标记”指能够产生可由视觉或仪器手段检测的信号的任何物质。适合用于本发明的各种标记包括通过化学或物理手段(诸如，可光学检测)而产生信号的标记。此标记包括酶和基底、色原体、催化剂、荧光化合物、化学荧光化合物、电活化物质、染料分子、放射性标记和颗粒标记。颗粒标记可包括磁性或带电荷的标记，其可由磁性或电化学手段检测。标记可共价地附接至结合试剂。具体而言，标记可来自可光学检测的那个。优选的可光学检测的标记包括胶体金属颗粒标记和装载染料的颗粒，如下文那样。

标记可包括胶体金属颗粒，诸如金、银、铂、银强化金溶胶、碳溶胶或碳纳米颗粒；胶体金属或非金属颗粒，诸如碲或硒；或染色或上色的颗粒，诸如包含染料或染料溶胶的聚合物颗粒。染料可为任何适合的颜色，例如蓝色。染料可为荧光的，或包括定量点。对于本领域技术人员，适合的荧光材料是公知的。染料溶胶由市售的疏水染料制备，诸如Foron Blue SRP(Sandoz)和Resolin Blue BBLS(Bayer)。适合的聚合物标记可选自合成聚合物的范围，诸如聚苯乙烯、聚乙烯甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸和聚丙烯酰胺。使用的单体通常是水溶性的，且在水基表面活性剂中乳化，使得形成单体胶束，其然后通过加入乳化引发剂而引起聚合。产生大致球形聚合物颗粒。对于此聚合物颗粒，理想大小范围从大约0.05µm至大约0.5µm。根据示例性实施例，标记是金胶体，其中优选颗粒平均直径在0.02µm至0.25µm的范围中。

干燥的结合试剂可设在微流体装置的流路中，或在侧向流类型装置中在设在包括检测区域的多孔载体材料上游的多孔载体材料上。上游多孔载体材料可为大孔的。大孔载体材料应当低或非蛋白质结合，或应当可借助于诸如BSA或PVA的试剂容易地阻挡，以最小化非特定结合，且在大孔载体变得由液体样本弄湿之后便于标记的试剂的自由移动。大孔载体材料可由表面活性剂或溶剂预处理(如果必要)，以使其更亲水且促进快速摄取液体样本。此外，一种或多种糖(例如，蔗糖，海藻糖)可用于稳定和帮助移动标记的试剂。这些可作为溶液(其中，标记的试剂施加至多孔载体)的一部分方便地施加至流路且/或至金属载体材料。用于大孔载体的适合的材料包括塑料材料，诸如聚乙烯和聚丙烯或诸如纸或玻璃纤维的其他材料。在标记的结合试剂由可检测的颗粒标记的情况下，大孔载体可具有是颗粒标记的最大颗粒大小的至少十倍的孔隙大小。越大的孔隙大小使标记的试剂较好释放。

测试装置将方便地包括三个或更多个流路：用于各个分析物化验的相应流路。然而，可能的是，两种或更多种分析物化验可共享公共流路(可能地除了下文描述的可选的公共样本施加区域之外)。流路将通常包括毛细管通道或其他微流体流通道，或一个或多个多孔部件，诸如尿样本的水流体可沿其运输。

在一个实施例中，检测装置包括三个单独的侧向流化验带，对于每个分析物化验一个。在另一个实施例中，测试装置可包括两个侧向流化验带；带中的一者用于为分析物中的一者(例如，hCG)执行化验，且另一带用于为另外两种分析物中的一者执行相应化验。人们还可构想其中一个流路或侧向流测试带用于测试所有三种分析物的实施例。

具体而言，测试装置可包括样本施加区域。这是多孔(通常吸水)区域，含水样本(诸如尿)可施加至该区域。样本施加区域可为公共区域。即，施加至公共样本施加区域的液体样本可输送至两个或更多个不同化验流路。

通常，样本由用户直接排尿到样本施加区域上而施加至样本施加区域。

在优选实施例中，化验装置包括壳体，其容纳化验和化验试剂的大多数或所有功能构件。壳体方便地由防水、合成塑料材料形成，且优选大致不透明。不透明剂可加至塑料材料，以便实现期望的不透明水平。具体而言，用于形成壳体的适合的合成塑料材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯的共聚物、聚烯烃、聚丙烯、聚乙烯和丙烯腈。壳体可期望地由两个或更多个部分形成，它们连结在一起，其中化验装置构件的其余部分的多数(或全部)容纳在壳体的组装的部分内或之间。壳体的部分可由常规紧固器件(诸如卡扣配合动作)或通过塑料焊接等连结和紧固。

在优选实施例中，化验装置包括壳体，(通常具有上述特征)，且其中样本施加部分或区域延伸超过壳体，以便于尿样本施加至样本施加部分或区域。延伸超过壳体的样本施加部分或区域可在使用之前由可移除的盖覆盖。盖还可优选地由合成塑料材料形成，其可为不透明，或者透明或半透明的。通常，一旦样本施加至样本施加区域，盖就替换。

吸收剂“槽”可设在化验流路的远侧下游端部。公共槽可设在或槽可设在各个化验的远侧端部处。吸收剂槽可优选地包括高吸收性材料，诸如例如CF7 Whatman纸，且将提供足够吸收容量以将任何未结合标记从检测区域附近移除。作为此槽的备选方案，可足够的是具有一定长度的多孔固相材料，其延伸超过检测区域。提供高吸收性槽的优点在于，其从相应化验的流路移除或大致移除过量标记的结合试剂。这具有的效果在于，使相应区域附近的未结合的标记的结合试剂的程度最小化，且因此允许化验流路在可具有不同量的标记的结合试剂的装置中使用。

测试装置将方便地包括本领域的技术人员已知的其他特征以及常规自测试或家用测试怀孕测试装置中的公共点，包括(但不限于)，样本足够性指示器(例如，如 PCT/EP2013/061178中描述的那样)，“防淹没”板(例如，如WO2012/069610中公开的那样)，使用样本的流作为化验控制(例如，如EP 1484611、US 6194222中公开的那样)；“较早”确定阳性或阴性结果(例如，如EP 1484613、US 5679584中公开的那样)；自动“叫醒”电子装置(例如，在装置由样本润湿时自动启动，这完成电路)；以及使用数字化验过程计量(例如，如European Community Design Registration No. 1367304中的那样)或“颜色变化芯”等，其在样本施加至测试装置时对用户给出视觉指示和/或给出化验开始的视觉指示(例如，WO 2003/058245)。测试装置将有利地以防水包装展示给客户，包装可选地还包括干燥剂，诸如小袋硅胶。

化验将方便地支撑在一些种类的支撑件或背衬层上，以提供机械强度和适合的刚性程度。化验加支撑件可方便地称为且提供为测试棒。所有三种化验可在单个棒上，或两个、三个或甚至四个(即，多于一个棒用于一种化验)测试棒上。测试棒或多个棒可适于且构造成由用户插入测试装置，或测试棒或多个棒可更优选地形成测试装置的集成部分，测试装置由消费者与预插入或装载在测试装置中的测试棒一起购买。

化验的结果可由外部化验结果读出器件读出，或直接由用户读出，但更优选地，测试装置将包括集成化验结果读出器，以用于读出化验的结果。化验结果读出器优选读出所有三种分析物化验的结果。化验结果读出器将有利地包括电子构件，尤其是数字电子构件，诸如微处理器。通常(但不一定)，化验由光学器件(即，测量由检测区域反射和/或传输的光的量)读出，其中光学标记的试剂倾向于以与样本中的分析物的浓度成比例(直接或相反)的方式积累。备选地，化验可例如由磁性或电化学测量读出。显然，读出化验的方式可取决于用于标记化验试剂的标记的性质。

外部化验结果读出器件可包括专用结果读出装置(例如，类似于EP 1066530中描述的那样)。备选地，外部化验结果读出器可为“非专用的”，诸如移动电话或其他可携带电子装置(例如，平板计算机)，其优选设有相机，其中化验结果通过测量由视觉标记生成的信号强度来读出。

无论是外部的还是形成集成化验装置/化验结果读出器的一部分，化验结果读出器可读出和解释化验结果，或可将化验结果数据传输至位于远程的装置，以用于解释化验数据。化验数据可实时传输至位于远程的装置。数据可经由因特网连接而传输，或可存储在存储器装置(诸如“闪速”驱动器等)上，其物理地输送至远程装置，或数据可由无线通信器件(例如，蓝牙、近场通信[NFC]等)传输。

微处理器可控制光学读出或其他化验读出构件的操作，且将方便地编程成带有或能够访问用于各种分析物的相关化验信号阀值，将实际化验信号值与预定阀值比较，且解释化验结果，以便确定怀孕测试的成果。

化验结果读出器因此包括用于读出化验的结果的必要构件。测试装置将有利地还包括化验结果显示器，以用于将怀孕测试的成果显示给用户。通常，显示器将包括LCD，但其他类型的显示器也是可能的(例如，使用“电子墨水”)。在那些实施例中，其中化验装置(或更特别地，其构件)需要功率源来操作，则化验装置将优选地设有集成功率源，诸如电池。非常小且便宜的电池容易市售获得。装置还可设有开关，以连接集成功率源且启用装置。

在备选实施例中，化验的结果可直接由读者以常规‘自测试’怀孕测试已知的方式读出，例如，由用户检查化验检测区域上的一个或多个窗口，以确定一个或多个(或所有)检测区域处存在或不存在可检测的信号。各个检测区域可在不透明壳体中设有单独的窗口，以允许用户检查检测区域。备选地，大窗口可适应两个或更多个(或所有)检测区域。通常，在此用户读出装置中，用户将直接检查侧向流或微流体化验的检测区域。在其他形式中，用户可参照颜色表或指示器来确定结果。方便地，检测装置将一起设有指令或指导，以用于读出化验结果(如果装置不对用户解释化验结果)。例如，可为用户提供打印的颜色表，以便于解释此直接读出的视觉测试。

与显示器组合的怀孕测试棒/化验结果读出器装置可称为“数字怀孕测试”，且此数字测试装置是市售的，且可适于以本公开的益处来提供根据本发明的测试装置。

微处理器将期望地编程以便引起化验结果读出构件读出化验的结果；解释化验结果；以及将结论向用户显示。

用于读出化验结果的构件将优选地包括至少一个光源，以及至少一个光电检测器。该至少一个光源优选是发光二极管(LED)。该至少一个光电检测器优选是光敏二极管或光敏晶体管。光源照亮化验上的检测区域，该区域倾向于在执行化验期间积累标记的物质，其方式取决于施加至化验的样本中关注的分析物的浓度。标记的物质可以以与分析物的浓度正相关的方式积累(即，分析物的浓度越大，则检测区域中积累的标记的量越大)。对于本领域技术人员公知的是，通常使用夹层化验形式。备选地，标记的物质的积累可与分析物的浓度负相关(即，分析物的浓度越大，则检测区域中积累的标记的量越小)。此负相关通常是竞争或抑制类型化验，该类型的化验通常在所关注的分析物是半抗原和/或太小以至于不能适应两种不同抗体的同时结合(例如，如在孕酮代谢物的情况下)时使用。

FSH和hCG都是异二聚分子，包括α和β子单元。FSH和hCG的α子单元基本上是相同的，使得针对α子单元的抗体结合至FSH和hCG两者。用于这两种分子的化验因此可潜在地使用公共试剂，其可为例如可动、直接标记的(即，可光学检测)抗体。相应检测区域可包括固定捕获抗体，其特定用于β子单元(其在FSH和hCG之间不同)。显然，这涉及夹层类型免疫学化验，但其他化验形式是公知的且可替代地使用。

可能的是，如果样本包含高的hCG水平(例如，因为样本由怀孕相对提前的被试者提供)，则特定用于公共α子单元的抗体可能由高的hCG水平‘淹没’，从而有效地降低可用于结合至FSH的抗体的量，且可能从而引起低估存在于样本中的FSH量。在实践中，这不太可能引起任何问题，因为如此高的hCG水平将几乎总是(>99.9%)由于怀孕，这将正确地检测且由测试装置解释，而不论任何FSH化验结果。还可能的是，对hCG化验使用双β子单元特定的抗体对，且对FSH化验使用双β特定的抗体对。该形式将否定在高分析物水平下看到的上述效果。

考虑到需要使成本最小，(尤其在装置在单次使用后弃置的那些实施例中)，优选使用单个光电检测器来检测从至少两种、优选三种不同化验的检测区域发出的光。将了解的是，光不是真的源自检测区域(其源自光源)，而是由检测区域反射和/或传输穿过其(如情况可能的那样)，使得显得从其发出。通常，但不一定，各个检测区域由相应光源(诸如LED)照亮。

单个光源(诸如LED)可用于至少两种不同化验(且如果可能，三种不同化验)的检测区域。然而，还可能提供多个LED。例如，LED可提供成照亮各个相应检测区域。在设有多个LED之处，这些可产生相同颜色照明，或可产生不同波长的照明。可存在其中LED(或其他光源)的数量等于或甚至超过检测区域的数量的实施例。备选地，可使用不同的几何结构，其中LED照亮两个检测区域，使得LED的数量少于检测区域的数量。

装置可通常使用参照区域，这是微流体或侧向流化验流路的一部分，其用于参照从检测区域获得的读数。使用参照区域对于本领域技术人员而言是公知的。具体而言，装置可使用‘共享’参照区域(如EP 2031376中公开的那样)，其中一个参照区域用于参照两个或更多个检测区域，其中的至少一者位于不同的流路上。

微处理器或计算机化控制可引起光源按顺序照亮一个或多个检测区域，以便区分由相应检测区域反射和/或传输穿过其的光。在一个实施例中，光源在不同时间发射不同波长的光，且光电检测器区分不同的波长。此外或备选地，光学挡板(固定或可调整)可用于控制由特定光源照亮的区域。可使用的该种类的光学布置的更多细节在例如EP 1484601、US 6055060以及US 5889585中公开。为了避免疑问，如本文使用的用语“光”不意在单独指电磁光谱中对人类观察者可见的那部分的辐射，且包含例如紫外和红外辐射。然而，构件在光谱的可见部分操作或对光谱的可见部分灵敏是优选的。

微处理器或计算机化控制器件将优选包括多个存储的分析物阀值，化验结果相对于其比较，以允许化验结果读出装置解释结果且将适当的结论(例如，怀孕或未怀孕)显示给用户。微处理器或控制器件将有利地以算法编程来测量测试结果，将它们与预定阀值比较，以及显示结论。

在一个实施例中，微处理器或控制器件将首先确定hCG化验结果，且将其与预定较低hCG阀值比较。如果确定的hCG化验结果低于预定下hCG阀值，则可立即确定被试者未怀孕，且该结果通过显示器指示给用户(例如，形成词语未怀孕，或以任何语言的其等同物；或借助于直观符号，例如减号或零)。

然而，如果测量的hCG化验结果高于预定下阀值，则化验结果读出器可继续测量FSH化验的结果。如果FSH化验结果指示样本中的FSH浓度大于其预定阀值，则可确定被试者未怀孕，且这如上文描述的那样显示给用户。

然而，如果测量的样本中的FSH低于其相应预定阀值，则化验结果读出器可然后测量孕酮代谢物化验的结果(在该情况下，用于P3G的化验)。如果化验结果指示样本中的P3G浓度低于其相应预定阀值，则可确定被试者未怀孕。如果样本中的P3G浓度高于预定阀值，则被试者怀孕，且化验结果读出器将经由显示器将适当的结论显示给用户。

阀值可在本发明的装置中存储为绝对分析物浓度(即，按质量或IU每单位体积)，和/或为吸收率值，或以任何其他方便的方式。

在一个实施例中，对于hCG/FSH/孕酮分析物中的一种、两种或全部三种，装置可设有上阀值和下阀值。例如，在一个实施例中，装置可具有上hCG阀值和下hCG阀值。如果测量的hCG浓度超过上hCG阀值，则装置可断言被试者怀孕，而不需要分析FSH/孕酮化验的结果。如果明显hCG分析物化验结果将超过上阀值，此断言可由装置“较早”进行(例如，在化验达到平衡之前)。在其他实施例中，‘怀孕’结果仍通过检查FSH/孕酮化验的结果来确认。

如果hCG化验结果低于下hCG阀值，则装置可断言被试者未怀孕(有或无由FSH/孕酮化验结果的确认)。如果hCG化验结果高于下hCG阀值但不超过尚hCG阀值，则装置将需要FSH/孕酮化验结果，以便得出确定怀孕或未怀孕。装置可按顺序(例如，第一分析物，然后另一个，以任一顺序)或并行检查那些FSH/孕酮化验结果。

具体而言，对于FSH和/或孕酮化验，装置可具有上阀值或下阀值。可能的是，选择多个阀值中的哪个在特定情况下应用将取决于在其他两种化验检测的分析物的绝对或相对浓度，使得可应用“加权”或“补偿”方案。例如，确定成在上hCG阀值和下hCG阀值之间的中间范围的较高端部的hCG浓度可能“补偿”相对低的孕酮浓度，通过引起装置在得出怀孕/未怀孕确定中应用下孕酮阀值。相反地，低FSH和/或高孕酮例如可能补偿样本中的相对低的hCG浓度。

化验的测量和/或化验的解释可包括一个或多个数据处理步骤，其中化验数据经过一次或多次计算或其他类型的处理。此处理将方便地由数字电子装置(诸如微处理器等)执行，其将通常形成外部或集成化验结果读出器的一部分。例如，数据处理可包括计算比率。具体而言，处理步骤可包括计算FSH:孕酮代谢物的比率或反之亦然。比率可基于相对信号强度或基于由测量的信号强度或其他适合的相关参数得出的相应分析物的浓度的计算。更特别地，‘边界线’hCG信号强度或得出的hCG浓度可由FSH:孕酮代谢物(或反之亦然)比率的计算验证或检查。

此外，除了hCG、FSH和孕酮之外，装置可化验其他分析物。具体而言，这些其他分析物可能包括激素，诸如例如LH、hPL(人类胎盘催乳激素)和/或松弛素和/或雌激素或其代谢物。此激素的另一示例是甲状腺刺激激素(TSH)。TSH与hCG、FSH(和LH)相关，因为所有这些激素包括α子单元，其非常类似于其他激素的α子单元。TSH还包括β子单元，其对TSH而言是独特的。尽管浓度相当低，但尿中的TSH水平之前已经测量(例如，见Yoshida等, 1988 Endocrinol. Jpn. 35, 733-739)。该一种或多种额外分析物的浓度也可由装置考虑，以得出怀孕/未怀孕确定，可能地通过影响对于hCG/FSH/孕酮分析物中的一种或多种可应用的阀值的选择。可测量该一种或多种其他分析物与hCG、FSH和孕酮中的一种或多种的比率。具体而言，可测量TSH与hCG(或反之亦然)的比率。其他分析物的测量在下文描述的本发明的改进中尤其有用。

在上文描述的基本原理的改进中，可期望不仅对用户指示被试者是否怀孕，而且按从受精起过去的近似时间量的怀孕(如果怀孕)的程度(即，孕龄)。这可通过显示天数、或更优选地周数来指示。方便地，三个时间间隔中的一者可能显示：1-2周；2-3周；以及>3周。为了便于此，测试装置可有利地设有多个不同的hCG浓度阀值(或更准确地，hCG化验测试结果阀值)，其对应于从受精起的相应周数。实现此的方法在WO 2009/147437中公开。再次，为了便于该实施例，可期望测试装置能够在扩展范围上测试hCG浓度(例如，通过对于hCG包括相对高的灵敏度测试和相对低的灵敏度测试两者)，且实现此的适合方法在WO 2008/122796中描述。通过测量除hCG之外的其他分析物(例如，hPL(见WO2012/055355)和/或孕酮代谢物)可便于估计怀孕的孕龄。

在一些实施例中，将期望测量装置还包括某种控制功能。这在自测试装置中常规用以提供测试已经正确起作用的一些指示。

通常，控制功能将包括使用控制区域，其中如果足够样本施加至测试装置的样本施加区域，则标记的试剂将倾向于积累。常规地，标记的试剂将为标记的抗体或其他试剂，其以干燥的形式可释放地沉积在测试带的上游或近侧部分，且在由样本再水化时可动，且由在控制区域中固定的特定捕获剂捕获。控制指示是否足够样本已经施加至测试装置，且指示测试试剂是否已经获得其结合性质至合理程度，以及标记试剂是否可动至足够程度。

在实施例中，本发明涉及测试装置，其构造成在样本中确定第一标志物、第二标志物和第三标志物中的每一个的存在和/或量。

样本是从女性哺乳动物(例如，女性人类)获得的样本。样本通常是液体样本，例如，尿样本或基于血液的样本，诸如全血、血清或血浆。

第一标志物是指示女性中存在胚胎的标志物，例如hCG或此标志物的代谢物。hCG代谢物的示例包括，切断完整hCG、自由β hCG、切断自由β hCG、自由α hCG、β核心片段。指示胚胎存在的标志物的其他示例包括，可从母性起源分化的标志物(例如，基本仅由胚胎产生的标志物(例如HPL))，与由母体分泌的相同标志物不同的形式产生的标志物(例如，相比于垂体hCG，高糖基化hCG)，相比于不存在胚胎时，在存在胚胎时在母性循环中以增加量存在的标志物(胎盘生长因子(PlGF)、内皮糖蛋白(可溶类fms状酪氨酸激酶(sFlt))、血管内皮生长因子(VEGF)、AFP(α胎蛋白))。

第二标志物是指示女性中的卵泡生成或其他卵泡生长活动的标志物，例如FSH、LH或抑制素B或此标志物的代谢物。FSH及其代谢物的示例包括自由β FSH和蛋白分解退化的产物。

第三标志物是指示与女性的怀孕的维持相关而分泌或产生的母性因子的标志物，例如，孕酮，或此标志物的代谢物，例如P3G。其他此标志物包括其他子宫内膜生长因子，例如非结合雌三醇/雌二醇的雌激素的形式，以及孕酮引起的结合蛋白质的分解形式。

第一、第二和第三标志物中的每一个可与其他标志物中的每一个不同。第一、第二和第三标志物中的每一个包括其异构体，例如，在其糖基化类型方面不同的异构体，从而产生更多酸和碱形式。

测试装置可构造成在第一标志物的量超过第一阀值的情况下确定存在怀孕。可进行存在怀孕的确定，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物和第三标志物中的至少一者的存在或量。可进行存在怀孕的确定，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。第一阀值可在使用测试装置之前确定。例如，第一阀值可在制造测试装置时确定。可确定第一阀值，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物和第三标志物中的至少一者的存在或量。可确定第一阀值，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。在示例性实施例中，测试装置构造成在第一标志物的量超过第一阀值的情况下确定存在怀孕，第一阀值在使用装置之前确定，且进行第一阀值的确定和怀孕的确定中的每一者，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。

测试装置可构造成在第二标志物的量低于第二阀值(或不存在)的情况下确定不存在怀孕。可进行不存在怀孕的确定，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物和第三标志物中的至少一者的存在或量。可进行不存在怀孕的确定，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。第二阀值可在使用测试装置之前确定。例如，第二阀值可在制造测试装置时确定。可确定第二阀值，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物和第三标志物中的至少一者的存在或量。可确定第二阀值，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。在示例性实施例中，测试装置构造成在第二标志物的量低于第二阀值(或不存在)的情况下确定不存在怀孕，第二阀值在使用装置之前确定，且进行第二阀值的确定和不存在怀孕的确定中的每一者，而不使用或参照从女性获得的样本中的第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量。

在实施例中，测试装置构造成，如果第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值和/或(ii)等于或小于第一阀值，则进一步基于第二标志物和第三标志物来确定存在或不存在怀孕。测试装置可构造成，仅在第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值和/或(ii)等于或小于第一阀值的情况下才进一步基于第二标志物和第三标志物确定存在或不存在怀孕。测试装置可构造成，仅在第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值且(ii)等于或小于第一阀值的情况下才进一步基于第二标志物和第三标志物确定存在或不存在怀孕。

例如，测试装置可构造成(1)(a)如果第一标志物的量超过第一阀值，则确定存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物和/或第三标志物的存在或量的情况下如此，和/或(b)如果第一标志物低于第二阀值，则确定不存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物和/或第三标志物的存在或量的情况下如此，以及(2)如果第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值和/或(ii)等于或小于第一阀值，则确定存在或不存在怀孕，且仅进一步基于第二标志物和第三标志物如此。

在实施例中，测试装置构造成(1)(a)如果第一标志物的量超过第一阀值，则确定存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物和/或第三标志物的存在或量的情况下如此，和/或(b)如果第一标志物低于第二阀值，则确定不存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物和/或第三标志物的存在或量的情况下如此，以及(2)如果第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值和/或(ii)等于或小于第一阀值(A)，则仅在(x)第二标志物不存在或第二标志物的量低于第三阀值且(y)第三标志物的量超过第四阀值的情况下才确定存在怀孕。在前一句中阐述的实施例的从句(2)下，如果(x)第二标志物的量超过第三阀值或(y)第三标志物的量低于第四阀值，则确定不存在怀孕。

在示例性实施例中，测试装置构造成(1)(a)如果第一标志物的量超过第一阀值，则确定存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量的情况下如此，且(b)如果第一标志物低于第二阀值，则确定不存在怀孕，且在不使用或参照第二标志物、第三标志物或其任何组合的存在或量的情况下如此，以及(2)如果第一标志物的量(i)等于或大于第二阀值和/或(ii)等于或小于第一阀值(A)，则仅在(x)第二标志物不存在或第二标志物的量低于第三阀值且(y)第三标志物的量超过第四阀值的情况下才确定存在怀孕。在前一句中阐述的实施例的从句(2)下，如果(x)第二标志物的量超过第三阀值或(y)第三标志物的量低于第四阀值，则确定不存在怀孕。

第二阀值低于第一阀值。例如，第二阀值可比第一阀值低至少大约5 mIU/ml、至少大约7.5 mIU/ml、至少大约10 mIU/ml、或至少大约12.5 mIU/ml。第一阀值可为大约25 mIU/ml或更小、大约20 mIU/ml或更小、大约15 mIU/ml或更小、或大约12.5 mIU/ml或更小。第二阀值可为至少大约1.5 mIU/ml或更大、大约2 mIU/ml或更大、大约2.5 mIU/ml或更大、或大约5 mIU/ml或更大。

确定存在标志物可包括确定不存在标志物。确定的标志物的量可为绝对量，例如样本的每单位体积的标志物的量，相对量，例如标志物的量相对于肾功能的标志物(例如肌氨酸酐)的量，和/或标志物的量相对于除了第一标志物、第二标志物或第三标志物中的其他的任一者之外的标志物的量。例如，第一标志物、第二标志物或第三标志物中的任何或所有的量可相对于其他标志物(诸如，另一不同的激素)的量来确定。

本发明的各种特征现在将通过示范性示例且参照附图进一步描述，在附图中：

图1是根据本发明的装置的一个实施例的分解视图；

图2-5示出了用于在根据本发明的装置的不同实施例中使用的化验测试带的各种形式；且

图6示意性示出了在根据本发明的装置中使用的算法/逻辑树的一个实施例。

示例

示例1

在初始实验中，尿hCG、尿FSH以及尿P3G在119位处于近更年期和后更年期(PP，年龄41-90)的未怀孕志愿者中测量，该群人中总共50个样本具有[hCG] >2.5mIU/ml，以及来自72位怀孕志愿者，她们(年龄21-40)从EMP(预期错过经期)前7天至EMP后3天成功怀孕。样本在可获得处测试，得到总共589个早期怀孕样本(“EPS”)，其中434个具有[hCG] >2.5mIU/ml，如由PerkinElmer^® Delfia^®化验评估的那样。

分析这些结果显示了，使用至少2.5mIU/ml的尿hCG阀值水平与10mIU/ml或更少的FSH阀值以及至少4µg/ml的P3G阀值结合来限定怀孕，可以以100%阳性预测来判断真正怀孕(在未怀孕人群中没有错误的阳性)。如由本研究建立的用于限定怀孕的三种分析物的阀值水平可能随较大数据集而变化，但结果显示，通过结合FSH和P3G使用hCG，源自怀孕的hCG可与源自垂体的近更年期和后更年期hCG区分。

使用这些阀值的结果在下面的表1中展示。

表1中的结果非常重要。它们示出了，在A组中，非常灵敏的hCG测试(检测少至2.5mIU/ml的hCG)，在与用于FSH和孕酮代谢物(P3G)的测试组合时，在统计学上大量女性样本中给出零错误阳性率，而成功地识别B组中的所有怀孕被试者。

示例2

在本发明的一个实施例中，怀孕测试装置将包括侧向流免疫化验，其构造成

两带硝化纤维(NC)形式，其中hCG夹层化验安排在第一带上。FSH夹层化验和竞争性P3G化验安排在具有两个不同捕获区域的第二单独的带上。两个带将经由接触多孔介质(其将接触两个硝化纤维带)的公共样本施加区域同时运行。装置将响应于所关注的分析物的量而数字地测量NC捕获区域上的信号响应(限制的标记)。取决于分析物的水平，内置算法将在显示屏上对终端用户给出数字显示的响应(怀孕/未怀孕和/或孕龄)。

可能的算法的示例在图6中示意性示出。将注意的是，图6中展示的算法仅为一个实施例，且可使用许多其他实施例。还将注意的是，图6中展示的绝对分析物浓度纯粹是示范性的，且可能使用其他分析物阀值。

示例3

参照图1，其示出了根据本申请的装置的一个实施例的分解视图，该装置包括由合成塑料材料形成的两部分壳体。壳体具有顶部部分2和底部部分4。壳体由不透明塑料材料形成，诸如聚碳酸酯或聚丙烯。如果必要，可包括不透明剂。

在壳体内是功率源，诸如小的扣式电池6，其将电功率传递至安装在印刷电路板组件(PCBA)8上的构件。具体而言，这些包括一个或多个LED和光敏二极管以及液晶显示器10。安装在PCBA 8上的构件包括读出在安装于壳体内的两个侧向流化验带上执行的化验的结果所必需的构件。带12中的一者用于执行hCG化验，且另一带14用于执行FSH和孕二醇-3-葡糖苷酸(P3G)化验两者。

壳体的顶部部分2和底部部分4协作以围绕前述构件形成大致不可渗透湿气的密封。尿样本借助于采样芯16到达侧向流化验带12、14。采样芯16的一个端部区域与化验带12、14中的每一个的相邻端部区域液体流连通(使得采样芯用作公共样本施加区域)。

采样芯16的相对端部区域突出穿过且超过壳体的一个端部中的孔口，从而允许样本施加至采样芯。采样芯的突出部分由可移除的盖18保护，盖18的形状和尺寸确定成以便与由此待接收的壳体的端部协作，且与其形成良好的紧密配合接合。

在示出的实施例中，为了将尿样本施加至采样芯16，用户移除盖18且直接排尿到芯上。芯由吸收性材料制成且因此样本吸收到芯中且通过被动方式沿芯流动且到化验带12、14中。可选地，用户替换盖18。为了协助样本流到化验带中且沿其流动，化验带在其远侧端部(即，离采样芯16较远的端部)与高吸收性材料制成的“槽”垫20液体流连通。

侧向流化验以常规方式进行，导致标记的结合试剂以与分析物浓度相关的方式(成比例或成反比，如情况可能的那样)积累在测试带12、14上的检测区域处，其由安装在PCBA 8上的化验读出构件检测和读出。微处理器(ASIC等)分析且解释读数，且将化验结果显示在LCD 10上，其经由在壳体的顶部部分2中的适合位置处形成的窗口或孔口21对用户可见。

重要的是，在使用之前，侧向流测试带12、14保持干燥，且为此原因，PCBA设有用于干燥剂22的容器，干燥剂22从壳体的内部吸收湿气。

示例4

参照图2，该示例涉及其中两个不同的侧向流化验带与根据本发明的装置组合使用或形成其集成部分的实施例。

在图2中，带30中的一者用于执行对hCG的高灵敏度化验。另一个带32用于执行对FSH和P3G两者的化验。尿样本从公共采样部件(为了清楚而省略)进入两个化验带30、32，且在由箭头34指出的方向上沿带流动。在其近侧端部(即，首先由尿样本遇到的那个端部)，两个带具有玻璃纤维结合垫36，且朝远侧端部，两个带与高吸收性“槽”38液体流连通，“槽”38促进样本沿化验带流动。除了“槽”38，两个带还包括成对配准孔40。这些便于带在装置内的定位，具体而言，使得化验带可由装置的化验读出构件正确地读出。注意，成对配准孔40不是对称的，因此带不会无意地彼此交换。

参照带30，结合垫36装载有结合至金溶胶(42)的可动抗α hCG子单元单克隆抗体。该结合物在结合垫上干燥，且在由样本润湿时释放。

检测区域44包括固定单克隆抗体，其特定用于hCG的β子单元。因此，样本中存在的任何hCG结合标记的结合物，且以本领域技术人员熟悉的方式在检测区域与‘捕获’抗hCG β抗体形成夹层。

由虚线限制的区域46指示参照区域，化验结果读出器件用其校准化验读数。相同参照区域46可用于校准hCG化验读数以及还有用于带32上的FSH和P3G化验获得的读数两者(即，可使用公共参照区域)。

参照带32，玻璃纤维结合垫具有两种不同的结合物48：一种是结合至抗FSH α子单元单克隆抗体的金溶胶，且另一种是结合至抗P3G α单克隆抗体的金溶胶。(在该示例中，抗hCGα和抗FSHα是相同抗体克隆)。

在FSH检测区域50，固定抗FSH β子单元单克隆抗体用作捕获抗体，而在P3G检测区域52，固定P3G-卵清蛋白结合物用作捕获分子。

各个化验带30、32的主体由硝化纤维形成，如由参照标号54指出的那样。

尽管在该实施例中，P3G检测区域52示为在FSH检测区域50下游，但可构想，两个检测区域的相对位置可为相反的。

进一步的变型是其中hCG和P3G化验在一个带上执行且单独的带用于FSH化验的形式。

示例4A

可构想另一种化验形式。这与图2中绘出的基本相同且在示例4中描述，除了在该变型中，沉积在结合垫36上的可动结合物中的一者是标记有P3G-卵清蛋白结合物(而非抗P3G mAb)，且P3G检测区域52处的固定捕获分子是固定抗P3G mAb。在该布置中，样本中的P3G与标记的结合物竞争来在检测区域52处结合至捕获抗体。

示例5

参照图3(其中相似构件共享图2中使用的参照标号)，在该实施例中，所有3种化验在单个化验带上执行。玻璃纤维结合垫36装载有公共抗hCGα和抗FSHα金溶胶结合物以及抗P3G金溶胶结合物(相应地，42、48)。

hCG检测区域44包括固定抗hCG β mAb。FSH检测区域50包括固定抗FSH β mAb，且P3G检测区域52包括固定P3G-卵清蛋白结合物。

如之前的那样，检测区域的相对位置可改变。此外，如在示例4A中的那样，可动P3G试剂可为标记有P3G-卵清蛋白结合物的金溶胶，且P3G检测区域52可包括固定抗P3G抗体。

可容易构想出又一个变型，其中可动结合物可包括结合至相对于hCG的β子单元特定的单克隆抗体的第一金溶胶，以及结合至相对于FSH的β子单元特定的单克隆抗体的第二金溶胶。相应检测区域包括固定的抗hCGα和抗FSHα抗体。另一个潜在的变型在于，在可动结合物以及作为不可动捕获抗体中均使用抗FSH β子单元抗体，只要两个抗体结合至不同抗原决定部位且因此不因结合至hCG而与彼此干扰或竞争。FSH也可以类似方式化验，其在可动结合物上以及作为固定捕获抗体使用抗FSH β子单元特定的抗体。

示例6

在图4中示意性示出的该示例中，为各个化验提供单独的侧向流化验带。hCG在带100上化验，FSH在带102上化验，且P3G在带104上化验。相似的构件与图2共享相同的参照标号。

样本经由公共采样部件(为了清楚而省略)施加至所有三个化验带。公共‘槽’垫38朝各个化验带的远侧端部成液体流接触。相对于图2，在该实施例中，各个化验带100、102、104具有其自身的参照区域46。此外，各个化验带具有程序控制区域60，其指示化验是否已经正确地执行至结合试剂已经保留其结合性质的程度。

示例7

又一个实施例在图5中示出。这也使用三个化验带。然而，三个化验带中的两者用于测量hCG水平，因此其中一个带110是高灵敏度hCG化验(用于检测低的hCG水平)，其中一个带112是低灵敏度hCG化验(用于检测高的hCG水平)，且第三带114用于FSH和P3G两者的化验。相似的构件由与图2共用的参照标号指示。

为了降低带112上的hCG化验的灵敏度，结合垫36不仅装载(42’)结合至抗hCGα mAb的可动金溶胶，而且装载自由(未标记)抗hCG β mAb，其结合至样本中存在的hCG，且因此与位于检测区域44处的固定抗hCG β竞争。因此，在样本中hCG分析物的水平高时，化验系统不被充溢。在该情况下，未标记的抗hCG β单克隆抗体用作“清除”剂。清除剂不需要是抗体，而是可能为结合至hCG且阻止(间接地)标记的试剂沉积在检测区域处的任何未标记的介质。清除剂可例如在流路上/中固定，或可与标记的结合物混合(以可动形式)。

使用高和低灵敏度hCG化验两者允许装置在扩展的浓度范围上准确地测量hCG，且该布置在装置不仅能够显示被试者怀孕的结果而且能够对用户指示被试者已经怀孕多久(例如，按从受精的周数)量估计的那些实施例中有用。

尽管前面的示例示出了使用各种侧向流化验格式，但将明显的是，类似化验布置可使用基于微流体的化验，或基于侧向流和微流体两者的化验。

示例8

该示例描述产生适合用于在如图4中所示的根据本发明的装置中使用的侧向流化验带的步骤。

产生化验试剂：

A. 制备金溶胶标记的抗体：

1. P3G化验

方法：

硼酸盐缓冲液(20ml, 20mM, pH 8.5)加入80nm金溶胶溶液(20ml, A₅₅₀nm=OD 6.85, BBI International)以给出在10mM硼酸盐缓冲液中包含OD 3.425的金溶胶的最终溶液。

抗P3G抗体的溶液(Clone # 5806:2, Alere San Diego, 40ml, 160µg/ml 在10mM 硼酸盐缓冲液中)在室温在磁性搅拌器上与金溶胶溶液快速混合。

30min混合之后，610µl的65.6mg/ml β-酪蛋白溶液加入反应混合物，且在室温继续混合另外30min。

β-酪蛋白在反应混合物中的最终浓度为0.5mg/ml。

溶胶溶液倒到离心管(50ml)中，且将溶液离心(4000g, 10min, 15^℃)。

倒出明显的上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理。

溶胶溶液转移至微量离心管中，且离心(4000g, 7min, 15^℃)。

小心地移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，加入洗涤缓冲液(1ml, 0.5mg/ml β-酪蛋白在10mM 硼酸盐缓冲液中)以重新悬浮溶胶。在重新悬浮之后，溶液被离心(4000g, 7min, 15^℃)。

小心地移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，加入洗涤缓冲液(1ml, 0.5mg/ml β-酪蛋 在10mM 硼酸盐缓冲液中)以重新悬浮溶胶。在重新悬浮之后，溶液被离心(4000g, 7min, 15^℃)。

移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，溶胶在小体积的存储缓冲液(0.5mg/ml BSA在PBS+叠氮化物[PBSA]中)中重新悬浮，且最终体积调整至 2ml。尽管初始实现在存储缓冲液中使用0.5mg/ml BSA，但发现的是，BSA的存在干扰P3G化验。随后，因此，替代BSA，在存储缓冲液中使用0.5mg/ml酪蛋白。在本发明的实施例中，其中P3G化验构件可能与其他化验的构件接触(例如，其中P3G化验和hCG和/或FSH化验在单个化验流路或侧向流带上执行)，则其他化验也将有必要避免使用BSA，以防止P3G化验受影响。

通过在550nm处测量吸收率来确定溶胶制备的最终OD。

2. hCG化验和FSH化验：

方法：

硼酸盐缓冲液(20ml, 20mM, pH8.5)加入80nm金溶胶溶液(20ml, A₅₅₀nm=OD 6.85, BBI International)以给出在10mM硼酸盐缓冲液中包含OD 3.425的金溶胶的最终溶液。

抗hCG抗体的溶液(Clone # 3299:4, Alere San Diego, 40ml, 20µg/ml 在10mM 硼酸盐缓冲液中)在室温在磁性搅拌器上与金溶胶溶液快速混合。

30min混合之后，610µl的65.6mg/ml β-酪蛋白溶液加入反应混合物，且在室温继续混合另外30min。β-酪蛋白在反应混合物中的最终浓度为0.5mg/ml。

溶胶溶液倒到离心管(50ml)中，且溶液离心(4000g, 10min, 15^℃)。

倒出上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理。

溶胶溶液转移至微量离心管中，且离心(4000g, 7min, 15^℃)。

小心地移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，加入洗涤缓冲液(1ml, 0.5mg/ml β-酪蛋白在10mM 硼酸盐缓冲液中)以重新悬浮溶胶。在重新悬浮之后，溶液被离心(4000g, 7min, 15^℃)。

小心地移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，加入洗涤缓冲液(1ml, 0.5mg/ml β-酪蛋白 在10mM 硼酸盐缓冲液中)以重新悬浮溶胶。在重新悬浮之后，溶液被离心(4000g, 7min, 15^℃)。

移除上层清液，且丸状溶胶被旋涡处理且声波处理，溶胶在小体积的存储缓冲液(0.5mg/ml BSA在PBSA中)中重新悬浮，且最终体积调整至2ml。

通过在550nm处测量吸收率来确定溶胶制备的最终OD。

B. 制备将在硝化纤维上固定的试剂：

尽管下面的示例描述卵清蛋白的P3G结合物的制备和使用，但可构想，可使用P3G的其他蛋白质或合成聚合结合物。P3G的蛋白质结合物包括但不限于，牛血清白蛋白、免疫球蛋白G、明胶和β-酪蛋白。聚合载体的代表性示例包括聚烯丙基胺、聚乙烯醇、聚赖氨酸以及聚乙烯亚胺。

P3G化验：

制备卵清蛋白的P3G结合物(10:1的P3G对卵清蛋白摩尔比率)

方法

制备NHS激活的P3G酯(10mg P3G, 10% DMSO比例)。

可溶于水的碳二亚胺EDC用于制备NHS激活的P3G酯。在比P3G(2.0136 x 10^-5摩尔P3G)摩尔过量EDC(1.1x)和NHS(1.5x)的情况下执行反应。

执行反应的总体积为600µl。

通过将48mg的EDC溶解在3.39ml的DMSO(99.7% 额外干燥, Acros, Cat#3484400)中，来制备14.153mg/ml的EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐, Thermo Scientific, Cat#77149, M.W.=191.7)溶液。

通过将29mg的NHS溶解在2.5ml的DMSO中，来制备11.6mg/ml的NHS(N-羟基丁二酰亚胺,Sigma Aldrich,Cat#130672,M.W.= 115.09)溶液。

在玻璃小瓶中称出10mg的P3G(5β-孕烷-3α, 20α-葡糖苷酸二醇, P3G, Sigma, Cat#P3635, M.W.= 496.63)，且上面制备的300µl的EDC和300µl的NHS溶液加入，以给出是P3G的1.1x的EDC以及1.5x的NHS的反应混合物。在暗处在室温搅拌反应混合物4小时，且允许反应在20^℃整夜(近似16小时)进行。

干燥的DMSO(400µl)加入上面的溶液，以将溶液的总体积补足至1000µl。

假设P3G将100%转化成P3G-NHS酯，则在1000µl中将有2.0136 x 10^-5摩尔激活的酯。因此，100µl的该溶液将包含2.0136 x 10^-6摩尔。

制备P3G-卵清蛋白结合物

使用100µl的激活的酯(2.0136 x 10^-6摩尔)。

通过将92.4mg的卵清蛋白溶解在20.858ml的PBS，来在PBS(PBS片, Sigma, Cat#P4417)缓冲液中制备4.43mg/ml的卵清蛋白(Sigma, Cat#A5503 >98%, MW = 44000)溶液，且2ml的该溶液用于10倍制备。

就在加入NHS激活的P3G溶液(100µl)之前，DMSO(100µl)加入卵清蛋白溶液。因此，DMSO在反应混合物中的最终浓度维持在10%(v/v)。

反应溶液在室温下搅拌3.5小时。在3.5小时反应之后，通过将1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH 7.4(100µl)加入该溶液来停止反应。

P3G-卵清蛋白然后离心且移除明显的上层清液，且在与PBSA预平衡的PD-10柱(GE Healthcare,Cat#17-0851-01)上净化。

-结合物溶液(2.5ml)施加至平衡柱的顶部，且所有溶液允许排出到胶体床上。

-洗脱缓冲液(PBSA,3ml)然后施加至柱，且穿过的流收集到干净玻璃器皿中。该穿过的流包含净化的P3G-卵清蛋白结合物。

0.7的消光系数(A₂₈₀^0.1%)用于确定蛋白质浓度。P3G-卵清蛋白结合物然后浓缩至3mg/ml，以用于在硝化纤维上固定。

1. hCG化验：

在固定到硝化纤维上之前，抗β-hCG抗体(Clone#3468:2,Alere San Diego)在PBSA中稀释至3mg/ml。

2. FSH化验：

在固定到硝化纤维上之前，抗β-FSH抗体(Clone#5948:2,Alere San Diego)在PBSA中稀释至3mg/ml。

C. 制备特定结合物质以及使其定位和固定的手段：

方法

1. P3G化验：

1.1制备PVA阻挡缓冲液(pH 9)(三羟甲基氨基甲烷碱20mM(Sigma),PVA 1% w/v (PVA 80%水解, 9-10K MW (Sigma),Tween 20 0.05% w/v(Sigma)&NaCl 150mM (Sigma))。

1.2通过将2% w/v的蔗糖(Sigma)加入47.5ml的PVA阻挡缓冲液，再加上2.5ml的乙醇(Sigma)，来制备PVA阻挡溶液。

1.3白色背衬的硝化纤维(Whatman)片使用压切机切成35cm*40mm的条，且在条的一个端部以6mm的节距冲孔(可使用许多不同尺寸的节距，然后，对于展示的示例，使用6mm孔节距)。

1.4设定生物点描绘器来在卵清蛋白条的期望的地点处以3mg/ml的浓度以1μl/cm的标绘速率标绘P3G-卵清蛋白结合物。

1.5在标绘之后，条在55^℃下干燥，且使用PVA阻挡溶液阻挡，且然后在密封的箔袋中与干燥剂在室温存储整晚。

2. hCG化验：

包括的步骤1.1至1.3跟随区段.C.1。

设定生物点标绘器来在卵清蛋白条的期望的地点处以3mg/ml的浓度以1μl/cm的标绘速率标绘3468抗体。

在标绘之后，条在55^℃下干燥，且使用PVA阻挡溶液阻挡，且然后在密封的箔袋中与干燥剂在室温存储整晚。

3. FSH化验：

包括的步骤1.1至1.3跟随区段.C.1。

设定生物点标绘器来在卵清蛋白条的期望的地点处以3mg/ml的浓度以1μl/cm的标绘速率标绘5948抗体。

在标绘之后，条在55^℃下干燥，且使用PVA阻挡溶液阻挡，且然后在密封的箔袋中与干燥剂在室温存储整晚。

D. 制备金溶胶标记的结合试剂(以用于实施例1的示例)以及使其固定的手段：

方法

1. P3G化验：

在区段.A.1中制备的5806涂覆的溶胶结合物，在离心分离机中旋转下来，且移除上层清液。所得的丸状物被旋涡处理且声波处理，且然后丸状物在金溶胶结合物喷射缓冲液中重新构成至金的期望的OD(在该示例中OD80)。在以下示例中使用的金溶胶结合物喷射缓冲液(pH 7.6)包含10mM三羟甲基氨基甲烷(Sigma)，5% w/v蔗糖(Sigma)以及0.5%(w/v)BSA*(Proliant Biologicals, SKU#68700)。然而，也可使用的喷射缓冲液的其他示例可在稀释溶液中具有额外物质，且可具有上面示例中列出的较高或较低水平的组分。(随后改变至0.5% w/v蔗糖)。

G041微孔玻璃纤维(Surewick^®)切成26mm * 35cm且装载到生物点喷射钻机上。

生物点喷射钻机设定成在琉璃纤维上的期望地点处以5806涂覆的溶胶结合物灌注/注入玻璃纤维。在该示例中，玻璃纤维以OD80结合物的4次连续经过来喷射，其中在各次喷射经过时以1.65μl/cm的标绘速率。

金溶胶注入的玻璃纤维在55^℃下干燥，且在密封的箔袋中与干燥剂在室温存储整晚。

2. hCG化验：

用于hCG化验的金溶胶灌注/注入的玻璃纤维条以与上面相同的方式制备，除了在这里使用3299涂覆的金溶胶(见区段A.2)，且溶胶结合物的OD是OD111。在这里引用的示例中，玻璃纤维以金结合物以1.65μl/cm的标绘速率的2次经过来喷射。

3. FSH化验：

对于FSH化验，使用OD62金结合物以1.65μl/cm的标绘速率的2次连续经过，来在玻璃纤维喷射3299涂覆的金溶胶(见区段A.2)。剂量条以与上面示例相同的方式干燥和存储。

E. 化验带构造/产生：单个带化验芯片构造的示例(每个芯片/带一种化验)

方法

1. P3G化验：

在运动学通用层合机模块组件单元的辅助下将P3G化验构件组装到化验芯片(带)中。

背衬层合体(Ferrisgate)放置到运动学卡压盘上，且具有固定的P3G-卵清蛋白的背衬硝化纤维条(区段C.1)在预定位置处附连至背衬层合体。

5806溶胶结合物注入的玻璃纤维的条(区段D.1)附连至背衬层合体，其中在硝化纤维条上重叠2mm。

辊子簇确保芯片的所有构件与背衬层合体的良好接触。

条然后使用生物点切机切成6mm独立芯片，且在箔袋中与干燥剂一起存储，直到准备供使用。

2. hCG化验：

hCG化验构件以与P3G化验相同的方式组装，除了使用以3468固定的硝化纤维条(区段C.2)以及以3299金溶胶结合物灌注的玻璃纤维条(区段D.2)。

条然后使用生物点切机切成6mm独立芯片，且在箔袋中与干燥剂一起存储，直到准备供使用。

3. FSH化验：

FSH化验构件以与P3G化验相同的方式组装，除了使用以5948固定的硝化纤维条(区段C.3)以及以3299金溶胶结合物灌注的玻璃纤维条(区段D.3)。

条然后使用生物点切机切成6mm独立芯片，且在箔袋中与干燥剂一起存储，直到准备供使用。

示例9

在该示例中，在根据本发明的装置中使用的示范性算法上提供其他信息。

本发明的化验装置，相比于常规自测试怀孕测试，在预期经期的那天之前提供较高怀孕检测率，而保留怀孕的特异性。实现这不仅通过对hCG具有较高灵敏度，而且通过测量FSH以及一种或多种孕酮代谢物，以便在非常低的hCG浓度下保留怀孕的特异性；在一些后更年期和近更年期女性中可见到升高水平的hCG，这在过于灵敏的hCG测试的情况下会生成错误的阳性结果。FSH用作怀孕的排除，这是由于高水平与近更年期和后更年期状态相关联，而孕酮代谢物(例如，P3G)用作怀孕的归入，这是由于升高的水平在怀孕中看到。

在该概念的一个简单实施例中，装置可能如下面表2中概述的那样起作用。在该示例中，化验的孕酮代谢物是P3G：

示例2

*构想的是，其中出现冲突的FSH和孕酮代谢物化验结果的情况的可能性非常低。装置将通常编程成在此情况下断言“未怀孕”结果，且/或可指示用户在稍后阶段再次测试。

所有的测试指定为化验的测试，且按检测的浓度表达。对于形成可见线的强度的测试，对于线的强度随增加的化验浓度而降低的竞争化验，逻辑必须反转。

改进的性能可能通过使用更加详细的算法来实现：FSH的水平或孕酮代谢物的水平的重要性(权重)可取决于hCG的水平，且/或用于测试FSH和孕酮代谢物的阀值可取决于hCG的水平。在更复杂的情况下，FSH阀值可取决于hCG浓度，且孕酮代谢物阀值可取决于FSH水平(且反之亦然)。

算法在图6中示意性示出。参照该图，算法/逻辑树考虑包括两个侧向流测试带的本发明的测试装置的实施例。第一带用于执行对hCG的化验，且第二带用于执行对FSH的化验和对P3G的化验。

在逻辑树中，化验结果读出器首先检查hCG化验结果，且将该化验信号与对应于2.5mIU/ml的hCG浓度的预定信号值比较。如果化验结果小于2.5mIU/ml阀值，则读出器可立即指示测试被试者“未怀孕”(跟随该图中的“<”符号)。[然而，总体化验的成果(即，“怀孕”或“未怀孕”)可不一定指示至用户，直到所有三种分析物化验的结果已经确定]。备选地，如果在尿样本中确定的hCG浓度等于或大于2.5mIU/ml阀值，则读出器继续检查FSH化验结果(第二化验带上的第一测试线或检测区域)。由于高于2.5mIU/ml的hCG浓度可能由于非怀孕相关的来源，故仅基于hCG化验结果“较早”确定化验的总体成果可能不太可能。

FSH化验具有10mIU/ml的阀值。如果在样本中确定的FSH浓度等于或大于10mIU/ml阀值，则化验装置/读出器断言测试的结果为“未怀孕”。相反，如果样本中的FSH浓度高于10mIU/ml阀值，则化验装置/读出器继续检查检查P3G化验结果。

P3G化验结果从第二侧向流化验带上的第二测试线或检测区域读出。如果P3G化验指示样本中的P3G浓度小于4µg/ml，则断言被试者“怀孕”。

对于本领域技术人员将明显的是，对于特定实施例选择的精确信号值或阀值浓度将至少部分地取决于使用的化验的特定特性(例如，试剂、流基质、结合物的浓度等)，使得上面标识的阀值可能在其他实施例中略微不同，但相对量将大体上相同。

此外，该图示出了化验装置/读出器件按顺序检验或检查hCG、FSH和P3G化验的结果。将明显的是，相应化验结果可以以任何顺序或大致同时检验。此外，“较早”确定一种或两种化验结果可允许确定总体化验结果的成果(即，“怀孕”或“未怀孕”)，而不一定需要已知所有三种分析物化验的结果，只要分析物的浓度远远高于(或低于，如适当的那样)相关阀值浓度。