EB1作为药物应答的生物标记物的用途的制作方法

微管是细胞骨架的组分之一，并且由α和β微管蛋白的异二聚体构成。微管靶向剂(MTA)是具有广谱活性的最有效的细胞毒性化学治疗剂。它们用于例如治疗血液恶性肿瘤和实体肿瘤，诸如肺癌、乳腺癌和前列腺癌。然而，由于血脑屏障不允许大多数临床相关的MTA穿过进入肿瘤所在的脑，所以用于治疗胶质母细胞瘤的用途受到限制。对MTA的抗性可以是固有的，或者可以在暴露于这类试剂之后获得。因此这类抗性会影响患者的存活率以及治疗方案的选择。已识别若干种潜在的抗性机制。这可能包括微管靶标本身或微管相关蛋白的缺陷，这些缺陷已知会改变其生物学特性并因此对MTA具有应答性。此外，其他细胞蛋白中的缺陷已被认为与对某些微管靶向剂的抗性相关联，诸如将药物主动泵出肿瘤细胞的外排性转运蛋白的过表达。标准的肿瘤治疗通常具有非常不完全且暂时的效果，它们仅缩小大体积肿瘤并且残余肿瘤易于复发，这主要是由于癌症干细胞(CSC)的小亚群中存在多种抗性机制。CSC寿命长并具有广泛的自我更新以及肿瘤形成和重新定殖的能力。胶质母细胞瘤(GBM)是成人神经胶质瘤中最常见且最具侵袭性的脑肿瘤。尽管有所进展，但有效的疗法有限，特别是在复发的情况下。GBM肿瘤由于在全脑内快速生长和高度侵袭性行为而导致死亡。现在有确凿证据表明，大多数恶性肿瘤细胞是由CSC产生的，这些CSC由于具有自我更新的能力以及对化疗和放射疗法的抗性，能够维持肿瘤并使其生长(ReyaT.,Stemcells,cancer,andcancerstemcells[干细胞、癌症和癌症干细胞],Nature[自然].2001；414:105-111；PardalR.,Applyingtheprinciplesofstem-cellbiologytocancer[将干细胞生物学的原理应用于癌症],Nat.Rev.Cancer[癌症自然评论],2002；3:895-902)。CSC在脑肿瘤中的识别为研究恶性神经元细胞或神经胶质源性肿瘤细胞的发展以及开发靶向这些细胞的疗法提供了强有力的工具。造成肿瘤进展、维持和复发的CSC的公认标志是其迁移能力(OrtensiB.,Cancerstemcellcontributiontoglioblastomainvasiveness[癌症干细胞对胶质母细胞瘤侵袭性的贡献],StemCellResearch&Therapy[干细胞研究与治疗],2013；4(1):18)。这是其浸润性和转移性行为的基本特性，该行为在临床上使得几乎不可能完全切除肿瘤。最近的实验数据清楚地表明GBMCSC造成GBM的侵袭性(OrtensiB.,Cancerstemcellcontributiontoglioblastomainvasiveness[癌症干细胞对胶质母细胞瘤侵袭性的贡献],StemCellResearch&Therapy[干细胞研究与治疗],2013；4(1):18)。当与匹配的CD133阴性的GBM肿瘤细胞相比时，来源于人类原代GBM、GBM异种移植物或GBM细胞系的富含干细胞标记物CD133的GBM细胞在体外和体内都展示出更大的迁移和侵袭潜力(YuS.,EnhancedinvasioninvitroandthedistributionpatternsinvivoofCD133+gliomastemcells[CD133+神经胶质瘤干细胞的增强的体外侵袭和体内分布模式],ChinMedJ.[中华医学杂志],2011；124:2599-2604；AnnabiB.,ModulationofinvasivepropertiesofCD133+glioblastomastemcells:aroleforMT1-MMPinbioactivelysophospholipidsignaling[CD133+胶质母细胞瘤干细胞的侵袭特性的调节：MT1-MMP在生物活性溶血磷脂信号传导中的作用],MolCarcinog.[分子致癌杂志]2009；48:910-919)。此外，已证实促侵袭性基因在CSC中得到上调，并且因此参与迁移和侵袭过程的蛋白质(例如，脱整联蛋白、金属蛋白酶)过表达(OrtensiB.,Cancerstemcellcontributiontoglioblastomainvasiveness[癌症干细胞对胶质母细胞瘤侵袭性的贡献],StemCellResearch&Therapy[干细胞研究与治疗],2013；4(1):18)。微管末端结合蛋白1(EB1)最初作为APC(腺瘤性结肠息肉)肿瘤抑制因子的结合配偶体被发现。EB1由MAPRE1基因编码，并且是参与调节微管动力学、细胞极性和有丝分裂期间的染色体稳定性的RP/EB家族的成员(DongX.,Oncogenicfunctionofmicrotubuleend-bindingprotein1inbreastcancer[微管末端结合蛋白1在乳腺癌中的致癌作用].JPathol.[病理学杂志]2010；220(3):361-9；WangY.,OverexpressionofEB1inhumanesophagealsquamouscellcarcinoma:promotingcellulargrowthprobablybyactivatingbeta-catenin/TCFpathway[EB1在人类食管鳞状细胞癌中的过表达：可能通过激活β-连环蛋白/TCF通路促进细胞生长].CancerRes.[癌症研究]2005；65:1304-1310)。EB1/MAPRE1已被分配人类基因命名委员会识别号HGNCID:6890和EntrezGeneID22919。对应于人类EB1蛋白和核酸的序列可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)参考号NM_012325(图10，SEQIDNo.1和2，NM_012325)获得。尽管作为APC的重要结合配偶体，但EB1在肿瘤形成中的一般作用尚未确定。然而，最近的报道表明EB1本身具有致癌功能。表达研究已证实EB1在乳腺癌(DongX.,Oncogenicfunctionofmicrotubuleend-bindingprotein1inbreastcancer[微管末端结合蛋白1在乳腺癌中的致癌作用].JPathol.[病理学杂志]2010；220(3):361-9)、胃癌、肝细胞癌、食管鳞状细胞癌(WangY.,OverexpressionofEB1inhumanesophagealsquamouscellcarcinoma:promotingcellulargrowthprobablybyactivatingbeta-catenin/TCFpathway[EB1在人类食管鳞状细胞癌中的过表达：可能通过激活β-连环蛋白/TCF通路促进细胞生长].CancerRes.[癌症研究]2005；65:1304-1310)中过表达，并且其表达水平与不良结果相关，包括降低的无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。在最近于109例原发性GBM患者组中执行的研究中也表明了这一点(BergesR.,End-binding1proteinoverexpressioncorrelateswithglioblastomaprogressionandsensitizestoVinca-alkaloidsinvitroandinvivo[末端结合蛋白1过表达与胶质母细胞瘤进展相关并且在体外和体内对长春花生物碱敏感]..Oncotarget.[癌症靶标].2014；第5卷(24):12769-87)。在所研究的GBM患者中，高EB1表达与不良OS(p<0.001)和不良PFS(p<0.001)相关。在WO2004103994中描述了用于治疗肿瘤性疾病和自身免疫性疾病的BAL27862。其前药(例如BAL101553)描述于WO2011012577中。现在出乎意料地发现EB1的存在与GBMCSC对BAL101553治疗的敏感性增加相关联。在第一方面，本发明提供了EB1作为用于预示脑肿瘤对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答的生物标记物的用途其中R表示苯基或吡啶基；其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰氨基、卤素以及硝基；并且其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代；R1表示氢或氰基-低级烷基；并且其中该前缀低级是指具有至多并包括最多4个碳原子的基团。尽管式I的化合物是微管去稳定剂，但与其他微管靶向剂(包括其他微管去稳定剂)相比，它们对细胞的表型具有不同的作用。此外，它们以不同于常规微管靶向剂的方式影响微管生物学，并且因此在对常规微管靶向剂有抗性的肿瘤模型中具有强效活性。参见WO2012098208、WO2012098207、WO2012098203、WO2012113802和WO2012130887的实例。因此，从关于常规微管靶向剂的信息不能预示特定基因的表达是否涉及或如何涉及式I的化合物的作用。优选地应答是针对治疗、即对使用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的治疗。优选地，应答是该脑肿瘤的CSC对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答。在一个实施例中，相对于标准值或一组标准值，从受试者采集的样品中的EB1的更高水平预示该脑肿瘤对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性，特别是该脑肿瘤中的CSC对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性。在另一个实施例中，相对于标准值或一组标准值，从受试者采集的样品中的CSC中的EB1的更高水平预示该脑肿瘤对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性，特别是脑肿瘤中的CSC对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性。在另一个实施例中，相对于标准值或一组标准值，从受试者采集的样品中的EB1的更低水平预示该脑肿瘤对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的抗性，特别是脑肿瘤中的CSC对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的抗性。在另一个实施例中，相对于标准值或一组标准值，从受试者采集的样品中的CSC中的EB1的更低水平预示该脑肿瘤对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性，特别是脑肿瘤中的CSC对该式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性。离体测量从受试者采集的样品中的EB1。优选地，该脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。优选地，该式I的化合物是BAL27862或其前药BAL101533。在另一个实施例中，本发明提供了EB1作为用于预示多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的应答的生物标记物的用途；其中离体测量从受试者采集的样品中的生物标记物EB1；其中相对于标准值或一组标准值，来自该受试者的该样品中的EB1的更高水平预示该多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的敏感性。在另一个实施例中，本发明提供了EB1作为用于预示多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的应答的生物标记物的用途；其中离体测量从受试者采集的样品中的生物标记物EB1；其中测量在该样品中的CSC中、优选表达CD133和/或A2B5的CSC中的该EB1水平；其中相对于标准值或一组标准值，来自该受试者的该样品中的这些CSC中的EB1的更高水平预示该多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的敏感性。本发明的另一方面提供了一种用于预示受试者中对通过给予式I的化合物进行的脑肿瘤的治疗的应答的方法，所述方法包括以下步骤：a)测量从该受试者获得的样品中的EB1水平以获得代表此水平的一个或多个值；以及b)将来自步骤a)的这些水平的该一个或多个值与标准值或一组标准值相比较，该比较预示了对该式I的化合物的应答性。以上实施例适用于本发明的这个方面。具体地，在一个实施例中，本发明提供了一种用于预示人类受试者中对通过给予BAL27862或BAL101533进行的多形性胶质母细胞瘤的治疗的应答的方法，所述方法包括以下步骤：a)离体测量从该人类受试者采集的样品中的EB1水平以获得代表此水平的一个或多个值；以及b)将来自步骤a)的这些水平的该一个或多个值与标准值或一组标准值相比较，该比较预示了对BAL27862或BAL101533的应答性；并且其中相对于标准值或一组标准值，来自该人类受试者的该样品中的EB1的更高水平预示该多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的敏感性。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于预示人类受试者中对通过给予BAL27862或BAL101533进行的多形性胶质母细胞瘤的治疗的应答的方法，所述方法包括以下步骤：a)离体测量从该人类受试者采集的样品中的这些CSC、优选表达CD133和/或A2B5的CSC中的EB1水平以获得代表此水平的一个或多个值；b)将来自步骤a)的这些水平的该一个或多个值与标准值或一组标准值相比较，该比较预示了对BAL27862或BAL101533的应答性；并且其中相对于标准值或一组标准值，来自该人类受试者的该样品中的这些CSC中的EB1的更高水平预示该多形性胶质母细胞瘤对BAL27862或BAL101533的敏感性。在另一方面，本发明提供了一种用于治疗脑肿瘤的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物，该治疗包括测量来自受试者的样品中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及如果该EB1水平高于标准值或一组标准值，则用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗受试者。以上实施例适用于本发明的这个方面。具体地，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗多形性胶质母细胞瘤的BAL27862或BAL101533，该治疗包括离体测量从人类受试者采集的样品中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及如果该EB1水平高于标准值或一组标准值，则用BAL27862或BAL101533治疗该人类受试者。在另一个实施例中，本发明提供了用于治疗多形性胶质母细胞瘤的BAL27862或BAL101533，该治疗包括离体测量从人类受试者采集的样品中的CSC、优选表达CD133和/或A2B5的CSC中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及在该样品中的CSC中的EB1水平高于标准值或一组标准值时用BAL27862或BAL101533治疗该人类受试者。在另一方面，本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的衍生物在制造用于治疗脑肿瘤的药物中的用途，该治疗包括测量来自受试者的样品中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及如果该EB1水平高于标准值或一组标准值，则用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗该受试者。以上实施例适用于本发明的这个方面。具体地，在一个实施例中，本发明提供了BAL27862或BAL101533在制造用于治疗多形性胶质母细胞瘤的药物中的用途，该治疗包括离体测量从人类受试者采集的样品中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及如果该EB1水平高于标准值或一组标准值，则用BAL27862或BAL101533治疗该人类受试者。在另一个实施例中，本发明提供了BAL27862或BAL101533在制造用于治疗多形性胶质母细胞瘤的药物中的用途，该治疗包括离体测量从人类受试者采集的样品中的CSC、优选表达CD133和/或A2B5的CSC中的EB1水平以获得表示此水平的一个或多个值，以及如果该样品中的CSC中的EB1水平高于标准值或一组标准值，则用BAL27862或BAL101533治疗该人类受试者。在另一方面，本发明提供了一种治疗对其有需要的受试者中的脑肿瘤的方法，所述方法包括a)从所述受试者的身体获得生物材料的样品；b)确定所述样品中的该EB1水平；以及c)如果所述样品中的该EB1水平高于标准值或一组标准值，则用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗该受试者。以上实施例适用于本发明的这个方面。具体地，在一个实施例中，本发明提供了一种治疗对其有需要的人类受试者中的多形性胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括a)从所述人类受试者的身体获得生物材料的样品；b)确定所述样品中的该EB1水平；以及c)如果所述样品中的EB1水平高于标准值或一组标准值，则用BAL27862或BAL101533治疗人类受试者。在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗对其有需要的人类受试者中的多形性胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括a)从所述人类受试者的身体获得生物材料的样品；b)确定所述样品中的CSC、优选表达CD133和/或A2B5的CSC中的EB1水平；以及c)如果所述样品中的CSC中的EB1水平高于标准值或一组标准值，则用BAL27862或BAL101533治疗人类受试者。在另一方面，本发明提供了一种用于预示脑肿瘤对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答的试剂盒，该试剂盒包括用于测量样品中的EB1水平所必需的试剂，并且优选还包括比较器模块，该比较器模块包括与样品中的EB1水平相比较的标准值或一组标准值。在一个优选的实施例中，试剂盒包括BAL27862和/或BAL101533在另一方面，本发明提供了一种用于预示脑肿瘤对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答的装置，该装置包括用于测量样品中的EB1水平所必需的试剂，并且优选还包括比较器模块，该比较器模块包括与样品中的EB1水平相比较的标准值或一组标准值。在一个优选的实施例中，装置包括BAL27862和/或BAL101533。在一个优选的实施例中，试剂盒或装置中的试剂包括包含EB1的检测剂的捕获试剂和检测试剂。特别优选地，捕获试剂是抗体。在另外的优选实施例中，试剂盒或装置包含用于测量样品中的EB1水平所必需的试剂以及用于识别和/或捕获CSC所必需的试剂。还优选地，当相对于标准值或一组标准值，EB1的水平更高时，预示脑肿瘤对用所述化合物进行的治疗敏感。在优选的实施例中，比较器模块分别表示使用试剂盒或装置的说明书。在一个替代性实施例中，比较器模块呈显示装置的形式。现将参考附图以举例的方式描述本发明的实施例。然而，本发明不应被理解为限于这些实施例。附图说明图1示出了GBM6和GBM9GBMCSC中的EB1表达水平。图2示出了对GBM6和GBM9CSC中的体外细胞迁移的抑制。定量分别表示为GBM6和GBM9的迁移细胞相对于100％对照细胞的百分比。示出来自至少三次独立实验的结果。星号指示各组之间统计上显著的差异，如下所示：**：p<0.005，***：p<0.001图3示出了稳定表达GFP的GBM6CSC的分析，其中EB1表达水平由shRNA抑制。图4示出了在6nM非细胞毒性浓度下GBM6CSC中的EB1下调对BAL27862的抗迁移效应的影响。示出来自至少三次独立实验的结果。星号表示与对照的或各组之间统计上显著的差异：p<0.05。图5示出了BAL27862以EB1表达依赖性方式对GBM6CSC的集落形成能力产生的影响。集落形成的百分比通过所形成的集落数量除以所接种细胞的原始数量×100来计算。示出至少3次独立实验的平均值和SEM。星号指示与对照的或各组之间统计上显著的差异，如下所示：*：p<0.05，**：p<0.005。图6示出了BAL27862以EB1表达依赖性方式对GBM6CSC的体外分化产生的影响。计算A2B5阳性细胞相对于对照组的细胞数量的百分比。图表表示至少3次独立实验的平均值和SEM。星号指示与未处理对照的统计上显著的差异(p<0.005)，ns：不显著。图7示出了BAL27862以EB1依赖性方式对CSC体外分化产生的影响。图表示出了至少3次独立实验的平均值和SEM。星号指示与未处理对照的统计上显著的差异(p<0.005)，ns：不显著。图8示出了在第45天对体内原位GBM6肿瘤的BAL101553活性。黑色阴影指示肿瘤的位置和大小。图9示出了BAL101553治疗对原位GBM6肿瘤中未分化CSC的比例的影响。图10示出了人类EB1的氨基酸序列(图10A)(GenBankAAC09471-SEQIDNO:1)和核酸序列(图10B)(GenBankU24166-SEQIDNO:2)。图11示出了来源于GBM10肿瘤的三种肿瘤中的EB1蛋白表达。示出用肌动蛋白作为加样对照的肿瘤提取物以及来源于用非靶向对照(NTC)siRNA或EB1siRNA处理的细胞的HeLa提取物的免疫印迹，从而证实EB1抗体的特异性。图12示出了EB1在来源于携带GBM10肿瘤小鼠血清的胞外囊泡(包括外泌体)中的表达。免疫印迹包括来源于用非靶向对照(NTC)siRNA或EB1siRNA处理的细胞的HeLa提取物，从而证实EB1抗体的特异性。CD9免疫印迹充当胞外囊泡(EV)的标记物，其中包括来自健康供体(Hu)的人类血清来源的外泌体和来自用非靶向对照(NTC)siRNA处理的细胞的HeLa提取物分别作为CD9阳性和阴性对照。具体实施方式式I的化合物优选的式I的化合物包括其中R、Y和R1如下定义的那些化合物：或其药学上可接受的衍生物。特别优选的是其中R、Y和R1如下定义的化合物：或其药学上可接受的衍生物。一种特别优选的化合物是BAL27862：短语式I的化合物的“一种或多种药学上可接受的衍生物”中的术语一种或多种衍生物涉及其盐、溶剂化物和配合物，以及其盐的溶剂化物和配合物，以及其前药、多晶型物和异构体(包括光学异构体、几何异构体和互变异构体)以及其前药的盐。在一个更优选的实施例中，衍生物涉及其盐和前药以及其前药的盐。盐优选是酸加成盐。盐优选使用有机酸或无机酸由具有碱性氮原子的式(I)的化合物形成，尤其是药学上可接受的盐。适合的无机酸是例如氢卤酸(诸如盐酸)、硫酸、或磷酸。适合的有机酸是例如羧酸、膦酸、硫酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸(诸如谷氨酸或天冬氨酸)、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷羧酸、金刚烷羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、邻苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲烷-或乙烷-磺酸、2-羟基乙烷磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘-二磺酸、2-甲基苯磺酸、3-甲基苯磺酸或4-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-氨基磺酸、N-乙基-氨基磺酸或N-丙基-氨基磺酸、或其他的有机质子酸(诸如抗坏血酸)。根据本发明的化合物可以前药形式给予，该前药在人类或动物体内分解得到式I的化合物。前药的实例包括式I的化合物的体内可水解酯和酰胺。所考虑的特定前药是天然存在的氨基酸的酯和酰胺以及小肽(特别是由多达五个、优选二或三个氨基酸组成的小肽)的酯或酰胺，以及聚乙二醇化羟基酸、优选羟基乙酸和乳酸的酯和酰胺。前药酯由氨基酸的酸官能团或肽的C末端以及式I的化合物中的适合羟基基团形成。前药酰胺由氨基酸的氨基官能团或肽的N末端以及式I的化合物中的适合羧基基团形成，或者由氨基酸的酸官能团或肽的C末端以及式I的化合物中的适合氨基基团形成。特别优选地，前药酰胺由式I的R基团内存在的氨基基团形成。更优选地，前药是由如上所定义的式I的化合物的R基团内存在的氨基基团以及甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基基团形成的酰胺。甚至更优选地，式I的化合物是呈选自具有下式的化合物的前药形式：在一个特别优选的实施例中，根据本发明的式I的化合物是呈前药BAL101553：或其药学上可接受的盐、优选盐酸盐、最优选二盐酸盐的形式。本发明的前药可以如例如WO2012/098207第37至39页中所述来制备，该专利通过引用结合在此。疾病脑肿瘤(例如大脑肿瘤)包括但不限于胶质和非胶质肿瘤、星形细胞瘤(包括多形性胶质母细胞瘤和未指定的神经胶质瘤)、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、垂体肿瘤、松果体区肿瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET's)、髓母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、脊髓肿瘤(包括脑膜瘤、脊索瘤和遗传驱动的大脑肿瘤，包括神经纤维瘤、外周神经鞘膜肿瘤和结节性硬化)。优选地，脑肿瘤是指胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)。样品对来源于个体的生物组织样品离体进行EB1水平测量。样品可以是从体内分离的任何生物材料，例如像正常组织、肿瘤组织、细胞系、外周血(包括循环肿瘤细胞或CSC)、脑脊液(包括CSC)、淋巴液、细胞裂解液、组织裂解液、尿液以及抽出物。优选地，样品来源于正常组织、肿瘤组织、细胞系、外周血(包括循环肿瘤细胞或CSC)或脑脊液(包括CSC)。更优选地，样品来源于肿瘤组织或者源自外周血或脑脊髓液的癌症干细胞。甚至更优选地，样品来源于肿瘤组织或者源自外周血的CSC。在一个特别优选的实施例中，样品来源于肿瘤组织。例如，可以在新鲜的、冷冻的或福尔马林固定的/石蜡包埋的肿瘤组织样品中测量癌细胞和/或CSC中的EB1水平。或者，当样品来源于体液，例如血液(例如外周血)、血清和血浆、尿液、脑脊液或唾液时，可在样品中的胞外囊泡中测量EB1的水平。在样品经历涉及测量生物标记物水平的方法步骤之前，预先从个体获得样品。用于从个体获得样品的方法是本领域中已熟知的。从肿瘤移除样品的方法可涉及例如肿瘤切除术或活检，例如通过穿刺孔活检、组织芯活检或抽吸细针活检、内窥镜活检或表面活检。脑CSC常常扩散到脑中的不同部位并形成继发性病灶和转移。如此，它们可侵入它们的周围环境，并且从而也可破坏支持血脑屏障的结构。由于这种侵入过程，它们可进入血液循环系统，并且因此可以从外周血中识别/纯化(Watkins,S.Disruptionofastrocytes-vascularcouplingandtheblood-brainbarrierbyinvadinggliomacells[通过侵入神经胶质瘤细胞破坏星形胶质细胞-血管偶联和血脑屏障],NatureCommunications5[自然通讯5].2014；Articlenumber:4196[文章号：4196]；Diaz,M.,TransmigrationofNeuralStemCellsacrosstheblood-brainbarrierinducedbygliomacells[由神经胶质瘤细胞诱导的神经干细胞跨血脑屏障的转移].PLoSOne.[公共科学图书馆期刊]2013；8(4)；BeauchesneP.,Extra-NeuralMetastasesofMalignantGliomas:MythorReality[恶性神经胶质瘤的神经外转移：神话还是现实].Cancers.[癌症]2011；3:461-477)。血液样品可通过静脉穿刺收集并根据标准技术进一步处理。例如，循环肿瘤细胞和/或循环CSC也可基于例如以下从血液或脑脊液中获得：大小(例如ISET-上皮肿瘤细胞按大小的分离；通过基于预先形成的细胞簇大小的簇芯片)或免疫磁性细胞富集(例如新泽西州力登公司Veridex公司(Veridex,Raritan,NJ)；德国美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec,Germany)；RosetteSepTM、EasySepTM和RoboSepTM，法国干细胞技术公司(STEMCELLTechnologies,France))或荧光激活细胞分选(FACS)(例如BDStemflowKit，美国BD生物技术公司(BD-Biosciences,USA))或基于电介质特性的细胞分离(美国APOCELL公司(APOCELL,USA))。脑肿瘤材料(例如GBM材料)可从经历手术或肿瘤活检的患者获得。然后可以通过本领域中已知的方法进一步处理切除的GBM肿瘤材料，该方法包括但不限于将肿瘤材料置于在冰上的含有补充有10％-15％抗生素(青霉素/链霉素)的神经干细胞(NSC)基础培养基的管内。以下程序作为实例给出。将GBM肿瘤样品用无菌PBS/NSC基础培养基洗涤2-3次以去除血液和碎片。在无菌皮氏培养皿中，将洗涤过的肿瘤组织切成小片并用手术刀片切碎，将其转移至Falcon管内并用数毫升预先温热的0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃的水浴中胰蛋白酶化10-15分钟。在孵育期后，加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止酶促胰蛋白酶反应。通过在800rpm(110g)下离心5分钟将肿瘤细胞悬浮液沉淀下来。丢弃上清液，并且将沉淀重悬于1mL无菌NSC基础培养基中。通过轻轻吹打上下解离团块并将细胞悬浮液通过40微米细胞过滤器以去除小细胞碎片(Azari,H.,IsolationandExpansionofHumanGlioblastomaMultiformeTumorCellsUsingtheNeurosphereAssay[使用神经球分析法分离和扩增人多形性胶质母细胞瘤肿瘤细胞].J.Vis.Exp.2011；Oct30(56):e3633[可视化实验期刊2011；十月30(56):e3633])。作为替代性方法，将肿瘤组织解离成肿瘤细胞悬浮液也可使用可商购获得的试剂盒来执行，该试剂盒包括但不限于可从美国加利福尼亚州95602奥本的美天旎生物技术有限公司(MiltenyiBiotecInc.,Auburn,CA95602,USA)获得的“脑肿瘤解离试剂盒(TheBrainTumorDissociationKits)”。已知脑肿瘤(诸如与GBM相关的那些脑肿瘤)释放胞外囊泡进入血液，然后这些胞外囊泡可在体内周围循环(Arscott等人,IonizingRadiationandGlioblastomaExosomes:ImplicationsinTumorBiologyandCellMigration[电离辐射和胶质母细胞瘤外泌体：在肿瘤生物学和细胞迁移中的意义],TranslationalOncology[转移肿瘤学],2006；6:638-648)。胞外囊泡包括微囊泡和外泌体，并且通常是纳米大小的膜衍生囊泡。胞外囊泡含有反映起源细胞的分子信息(包括蛋白质和RNA)，包括肿瘤生物学的标志(Redzik等人,Glioblastomaextracellularvesicles:reservoirsofpotentialbiomarkers[胶质母细胞瘤胞外囊泡：潜在生物标记物的储库].PharmgenomicsPers.Med.[药物基因组个性化医学],2014；7:65-77；Capello等人,Exosomelevelsinhumanbodyfluids:Atumormarkerbythemselves[人体液中的外泌体水平：肿瘤标记物本身]？Eur.J.Pharm.Sci.[欧洲药物科学杂志],2016；96:93-98)，并且并且可在体液中获得，这些体液诸如血液(包括血清和血浆)、尿液、脑脊液和唾液。这提供了一种确定EB1是否存在于GBM肿瘤中的替代性方法。可以使用多种方案和可商购获得的试剂盒来分离胞外囊泡，包括：a)差速超速离心(Théry等人,Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids[从细胞培养上清液和生物体液中分离和表征外泌体].Curr.Prot.CellBiol.[细胞生物学新方案],2006；3.22.1-3.22.29)；b)化学沉淀(例如，来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔英杰公司(Invitrogen,ThermoFischer,Waltham,MAUSA)的总外泌体分离试剂盒(TotalExosomeIsolationKits)；来自美国帕洛阿尔托的SBI系统生物公司(SBISystemBiosciences,PaloAlto,USA)的ExoQuickTM外泌体沉淀溶液(ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution)；来自爱沙尼亚塔林的汉莎生物医学公司(HansaBioMed,Tallinn,Estonia)的Exo-Prep)；以及c)使用例如ELISA免疫板(例如来自汉莎生物医学公司)、免疫珠(例如来自汉莎生物医学公司)和来自比利时勒芬的JSR生命科学公司(JSRLifeSciences,Leuven,Belgium)的ExoCapTM的免疫亲和捕获(Zarovni等人,Integratedisolationandquantitativeanalysisofexosomeshuttledproteinsandnucleicacidsusingimmunocaptureapproaches[使用免疫捕获方法对外泌体穿梭蛋白和核酸的整合分离和定量分析].Methods[方法学],2015；87:46–58)。胞外囊泡中的EB1核酸(优选RNA)和/或蛋白质的水平可以通过如下所述的标准技术来测量。癌症干细胞(CSC)样品中的CSC可以通过本领域已知的方法来识别，这些方法包括基于识别CSC标记物的方法，例如使用免疫组织化学或流式细胞术，以及基于选择CSC所特有的但分化的癌细胞所不具有的特性的方法，例如选择具有多能特性和/或能够在体外培养条件下繁殖的细胞。可用于识别CSC的CSC标记物是ALDH1、CD24、CD44、CD90、CD133、Hedgehog-Gli活性、α6-整联蛋白、ABCB5、β-连环蛋白活性、CD26、CD29、CD166、LGR5、CD15、巢蛋白、CD13、ABCG2、CD117、CD20、CD271、c-Met、CXCR4、Nodal-激活素、α2β1-整联蛋白和Trop2，同时CD15、CD90、CD133、α6-整联蛋白、巢蛋白和A2B5可对多形性胶质母细胞瘤中的CSC具有特异性(MedemaJP.,Cancerstemcells:Thechallengesahead[癌症干细胞：未来的挑战],NatureCellBiology[自然细胞生物学].2013；15:338-344)。本发明特别感兴趣的是CD133和/或A2B5。(TchoghandjianA等人,A2B5cellsfromhumanglioblastomahavecancerstemcellproperties[来自人胶质母细胞瘤的A2B5细胞具有癌症干细胞特性].BrainPathol.[大脑病理学研究]2010；1:211-21)。以下程序作为识别从个体采集的样品中的脑CSC的实例给出。将脑肿瘤细胞悬浮液以300,000个细胞/孔接种到预先涂覆聚DL-鸟氨酸的6孔板中的干细胞容许培养基中(5mg/mL胰岛素、0.1mM腐胺、100mg/mL转铁蛋白、2.10-8M孕酮(法国巴黎的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Paris,France))、50mg/mL青霉素-链霉素(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔英杰生命技术公司)以及包括10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，西格玛奥德里奇公司)、20ng/mL表皮生长因子(EGF，美国明尼苏达州明尼阿波里斯市的R&D系统公司(R&Dsystems,Minneapolis,MN,USA))和B27(英杰生命技术公司(InvitrogenLifeTechnologies))在内的生长因子)。在4天后，将细胞胰蛋白酶化，将其悬浮于含有HBSS缓冲液的阻断溶液(法国巴黎的美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec,Paris,France))中，并与A2B5-APC和CD133-PE抗体(美天旎生物技术公司)一起孵育10分钟。然后将细胞用10％多聚甲醛固定20分钟，并使用流式细胞术(FACSCaliburTM，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BDBiosciences,SanJose,CA,USA))进行分析。使用CellQuestPro软件(BD生物科学公司)获取每个样品总共100'000个事件，并使用FlowJoTM软件和Dean-Jet-Fox模型分析来分析数据。或者，球体形成测定也可以用于识别CSC，因为CSC具有在体外生长并形成球体的能力。为此，将细胞以30'000个细胞/25cm3烧瓶的密度铺板于3.5mLCSC容许培养基中并保持在5％CO2/95％O2气氛中。球体的数量和大小每周使用10×放大率和校准的千分尺标线进行两次评定。或者，可以通过将脑肿瘤细胞重悬于10％的DMEM-FCS中并与抗A2B5小鼠IgM抗体(1/2稀释的细胞上清液，美国维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA))在4℃下一起孵育30分钟；随后洗涤并与磁性微珠标记物的小鼠特异性IgM大鼠抗体在4℃下一起孵育30分钟来识别样品中的脑CSC。如通过A2B5对照-免疫染色所评定的，可以使用平均纯度为93％(从85％至98％范围内)的MACS柱进行阳性磁性细胞分离(MACS，法国巴黎的美天旎生物技术公司)。或者，可以基于在细胞上荧光标记抗体与CSC标记物的结合(例如，抗A2B5和抗CD133抗体)使用来自任何可商购获得的来源(例如，伯乐公司(Bio-Rad)[美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)])的BenchtopS3TM细胞分选仪；贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)[美国加利福尼亚州布雷亚(Brea,CA,USA)])的MoFloTM细胞分选仪；BD生物科学公司的FACSDivaTM细胞分选仪)的FACS(荧光激活细胞分选仪)将脑CSC从样品中分离。样品比较根据本发明的个体可以是需要治疗的人类或动物。优选地，个体为人类。生物标记物EB1在从人类或动物体内采集、优选从人体内采集的一个或多个样品中离体进行测量。一个或多个样品在样品经历涉及测量生物标记物水平的方法步骤之前从人类或动物体内预先获得，优选从人体内预先获得。生物标记物通常是用作生物应答指示剂，优选用作对给定治疗的敏感性的指示剂的物质，该给定治疗在本申请中是使用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的治疗。在此已经发现，CSC中更高的EB1水平预示对本发明的化合物的应答性，或者换句话说，CSC中的更低水平预示对本发明的化合物的抗性。在一个优选的实施例中，样品中相对于标准值或一组标准值更高的EB1水平预示应答性。如在此所用，相对于标准水平或一组标准水平增加或相对高或者高或更高水平意指样品中生物标记物的量或浓度相对于该标准水平或该组标准水平在样品中可检测地更多。这包括相对于标准至少约1％的增加或更高水平，优选相对于标准至少约5％的增加。更优选地，这是相对于标准至少约10％的增加或更高水平。更特别优选，这是相对于标准至少约20％的增加或更高水平。例如，这种增加或更高水平可包括但不限于相对于标准至少约1％、约10％、约20％、约30％、约50％、约70％、约80％、约90％或约100％或>100％的增加。在一个优选的实施例中，样品中相对于标准值或一组标准值更低的EB1水平预示抗性。如在此所用，相对于一个标准水平或一组标准水平减少或相对低或者低或更低的水平意指样品中生物标记物的量或浓度相对于该标准水平或该组标准水平在样品中可检测地更少。这包括相对于标准至少约1％的减少或更低的水平，优选相对于标准至少约5％的减少。更优选地，这是相对于标准至少约10％的减少或更低的水平。更特别优选地，这是相对于标准至少约20％的减少或更低的水平。例如，这种减少或更低的水平可包括但不限于相对于标准至少约1％、约10％、约20％、约30％、约50％、约70％、约80％、约90％或约100％的减少。因此，减少还包括样品中不存在可检测的EB1。优选地，以下在样品中更高的EB1水平i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或一组标准值的；或ii)在治疗开始后采集并且与治疗开始前从同一个体采集的样品相比较的；或iii)相对于来自正常细胞、组织或体液的标准值或一组标准值的；预示脑肿瘤对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性，优选脑肿瘤的CSC对该化合物或衍生物的敏感性。更优选地，以下在样品中更高的EB1水平i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或一组标准值的；或ii)在治疗开始后采集并且与治疗开始前从同一个体采集的一个或多个样品相比较的；预示脑肿瘤对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的敏感性，优选脑肿瘤的CSC对该化合物或衍生物的敏感性。特别优选地，一个或多个样品中相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或一组标准值更高的EB1水平预示了敏感性。在一个优选的实施例中，对于情况i)，其中一个或多个样品中的测量值是相对于来自具有与有待和它比较的样品相同的肿瘤组织型的个体的样品的标准值或一组标准值相比较的，该标准值或该组标准值由来自具有该癌症类型的个体群体的样品建立。只要样品的来源在标准样品与有待比较的样品之间是一致的，则来自这些标准个体的样品可例如来源于肿瘤组织或来源于循环肿瘤细胞或来源于CSC。在另一个优选的实施例中，对于情况ii)，其中比较在治疗开始之后采集的一个或多个样品中的测量值并且将其与治疗开始前从同一个体采集的一个或多个样品相比较，优选测量该测量值以预示获得性抗性。将样品与来自相同生物来源的细胞或组织相比较。然后对获得性抗性的预示将指示应停用使用该化合物的治疗。生物标记物因此用于监测使用化合物进一步治疗是否可能产生所需的应答(例如异常细胞的减少)，或者细胞是否变得对这种治疗无应答或有抗性。在又一个优选的实施例中，对于情况iii)，其中一个或多个样品中的测量值是相对于来自正常细胞、组织或体液的标准值或一组标准值相比较的，该标准值或该组标准值可由正常(例如非肿瘤)细胞、组织或体液样品建立。这类数据可以从个体群体中收集，以便开发标准值或一组标准值。该标准值或该组标准值由可来自细胞系或动物肿瘤模型的预先获得的样品或优选来自至少一个人类个体以及更优选来自平均数个个体(例如，n＝2至1000或更多)的生物材料来离体建立。该标准值或该组标准值然后可与相同细胞系或相同个体对使用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的治疗的应答数据相关。根据这种相关性，可以建立比较器模块，例如呈相对标度或评分系统的形式，任选地包括截断值或阈值，该比较器模块指示与对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答水平谱相关联的生物标记物水平。应答水平谱可包括对化合物的治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性至低敏感性)以及对治疗活性的抗性。在一个优选的实施例中，此比较器模块包括预示对治疗的敏感性的截断值或一组值。例如，如果使用免疫组织化学方法测量样品中的EB1水平，则标准值可呈评分系统的形式。这种系统可考虑存在EB1染色的细胞百分比。该系统还可考虑单个细胞中的相对染色强度。然后可将EB1水平的该标准值或该组标准值与指示个体或组织或细胞系对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的治疗活性的应答(尤其是敏感性)的数据相关。然后这类数据可形成比较器模块的一部分。应答是细胞系、或优选个体、或更优选个体的疾病对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的活性、优选治疗活性的反应。应答水平谱可包括对化合物的活性、优选治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性至低敏感性)以及对活性、优选治疗活性的抗性。应答数据可例如在以下方面进行监测：客观应答率、疾病进展时间、无进展存活率和总体存活率。癌性疾病的应答可通过使用癌症治疗领域技术人员所熟知的标准来评估，这些标准例如但不限于，实体肿瘤应答评估标准(RECIST)指南，来源：EisenhauerEA,TherasseP,BogaertsJ,SchwartzLH,SargentD,FordR,DanceyJ,ArbuckS,GwytherS,MooneyM,RubinsteinL,ShankarL,DoddL,KaplanR,LacombeD,VerweijJ.Newresponseevaluationcriteriainsolidtumors:revisedRECISTguideline(version1.1)[实体肿瘤中新的应答评估标准：修订的RECIST指南(版本1.1)].EurJCancer[欧洲癌症杂志].2009；45:228-47；高级神经胶质瘤的RANO标准，来源：WenPY,MacdonaldDR,ReardonDA,CloughesyTF,SorensenAG,GalanisE,DegrootJ,WickW,GilbertMR,LassmanAB,TsienC,MikkelsenT,WongET,ChamberlainMC,StuppR,LambornKR,VogelbaumMA,vandenBentMJ,ChangSM.Updatedresponseassessmentcriteriaforhigh-gradegliomas:responseassessmentinneuro-oncologyworkinggroup[高级别神经胶质瘤的更新的应答评估标准：神经肿瘤学工作组的应答评估].JClinOncol.[临床肿瘤学杂志]2010；28(11):1963-72；卵巢癌应答的CA-125Rustin标准，来源：RustinGJ,QuinnM,ThigpenT,duBoisA,Pujade-LauraineE,JakobsenA,EisenhauerE,SagaeS,GrevenK,VergoteI,CervantesA,VermorkenJ.Re:Newguidelinestoevaluatetheresponsetotreatmentinsolidtumors(ovariancancer)[回复：实体肿瘤(卵巢癌)中评估治疗应答的新指南].JNatlCancerInst.[国家癌症研究所杂志]2004；96(6):487-8；以及前列腺癌应答的PSA工作组2标准，来源：ScherHI,HalabiS,TannockI,MorrisM,SternbergCN,CarducciMA,EisenbergerMA,HiganoC,BubleyGJ,DreicerR,PetrylakD,KantoffP,BaschE,KellyWK,FiggWD,SmallEJ,BeerTM,WildingG,MartinA,HussainM；ProstateCancerClinicalTrialsWorkingGroup[前列腺癌临床试验工作组].Designandendpointsofclinicaltrialsforpatientswithprogressiveprostatecancerandcastratelevelsoftestosterone:recommendationsoftheProstateCancerClinicalTrialsWorkingGroup[具有进展性前列腺癌和阉割的睾酮水平的患者的临床试验的设计和终点：前列腺癌临床试验工作组的建议].JClinOncol.[临床肿瘤学杂志]2008；26(7):1148-59。敏感性与存在以下一个或多个的可观察和/或可测量的减少或者存在相关联：异常细胞、优选癌性细胞的数量的减少或者不存在异常细胞、优选癌性细胞；对于癌性疾病：肿瘤大小的减小；进一步肿瘤生长的抑制(即，减缓到一定程度并且优选停止)；肿瘤标记物(诸如PSA和CA-125)的水平的减少，癌细胞浸润到其他器官(包括癌症扩散到软组织和骨中)内的抑制(即，减缓到一定程度并且优选停止)；肿瘤转移的抑制(即，减缓到一定程度并且优选停止)；与特定癌症相关联的一种或多种症状的缓解；以及降低的发病率和死亡率。在一个优选的实施例中，敏感性意指存在以下标准中的一个或多个的可观察和/或可测量的减少或者不存在以下标准中的一个或多个：肿瘤大小的减小；进一步肿瘤生长的抑制，癌细胞浸润到其他器官内的抑制；以及肿瘤转移的抑制。在一个更优选的实施例中，敏感性是指以下标准中的一个或多个：肿瘤大小的减小；进一步肿瘤生长的抑制，癌细胞浸润到其他器官内的抑制；以及肿瘤转移的抑制。上述敏感性标准的测量是根据癌症治疗领域技术人员熟知的临床指南，诸如上面列出的用于测量癌性疾病应答的那些指南。应答也可通过评定细胞增殖和/或细胞死亡来在体外建立。例如，对细胞死亡或增殖的影响可通过以下成功建立的测定中的一种或多种在体外评定：A)使用Hoechst33342染料进行核染色，从而提供关于细胞凋亡的标志的核形态学和DNA片段化的信息。B)膜联蛋白V结合测定，该测定反映质膜外脂质双层的磷脂酰丝氨酸含量。此事件被认为是凋亡的早期标志。C)TUNEL测定(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定)，用于通过经由标记核酸末端测量DNA片段化来评估经历凋亡或坏死的细胞的荧光方法。D)测量细胞代谢活性的MTS增殖测定。活细胞具有新陈代谢活性，而呼吸链受损的细胞在此测试中显示降低的活性。E)结晶紫染色测定，其中对细胞数量的影响通过对细胞组分进行直接染色来监测。F)通过掺入溴脱氧尿苷(BrdU)监测DNA合成的增殖测定。可以直接确定对生长/增殖的抑制影响。G)涉及膜不可渗透的荧光单体花青核酸染色的YO-PRO测定，该测定允许分析垂死(例如凋亡)细胞而不干扰细胞活力。对细胞数量的总体影响也可以在细胞透化后进行分析。H)细胞周期分布的碘化丙啶染色，该染色显示细胞周期不同阶段之间分布的改变。可以确定细胞周期停滞点。I)非贴壁依赖性生长测定，诸如集落生长晕测定，这些测定评定单细胞悬浮液在软琼脂中生长成集落的能力。在与体外确定相关的一个优选实施例中，敏感性意指存在异常细胞的增殖率降低和/或异常细胞的数量减少。更优选地，敏感性意指存在癌性细胞的增殖率降低和/或癌性细胞的数量减少。异常细胞、优选癌性细胞的数量减少可通过多种程序性和非程序性细胞死亡机制发生。细胞凋亡、胱天蛋白酶非依赖性程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡是程序性细胞死亡的实例。然而，本发明的实施例中涉及的细胞死亡标准并不认为限于任何一种细胞死亡机制。在与体外抗性确定相关的一个优选实施例中，抗性意指不存在异常细胞的增殖率降低和/或异常细胞的数量减少。更优选地，抗性意指不存在癌性细胞的增殖率降低和/或不存在癌性细胞的数量减少。异常细胞、优选癌性细胞的数量减少可通过多种程序性和非程序性细胞死亡机制发生。细胞凋亡、胱天蛋白酶非依赖性程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡是程序性细胞死亡的实例。然而，本发明的实施例中涉及的细胞死亡标准并不认为限于任何一种细胞死亡机制。EB1术语EB1在本文中用于包括所有先前提到的同义词，并且在适当时是指核酸和蛋白质水平上的这种实体。核酸水平指例如mRNA、cDNA或DNA，并且术语蛋白质包括翻译的多肽或蛋白质序列及其翻译后修饰形式。EB1(人类EB1)的蛋白质序列的优选实例列出于SEQ.IDNO:1中。然而，术语EB1还包括此序列的同源物、突变体形式、等位基因变体、同型物、剪接变体以及等效物。优选地，它还包括此序列的人类同源物、突变体形式、等位基因变体、同型噁、剪接变体以及等效物。更优选地，它包括与所述序列具有至少约75％一致性、特别优选至少约85％一致性、特别优选至少约95％一致性并且更特别优选约99％一致性的序列。在一个特别优选的实施例中，EB1是核酸或蛋白质水平上的实体，EB1在蛋白质水平上由SEQIDNO:1或与此序列具有至少95％一致性、优选至少99％一致性的序列来表示。在一个特别优选的实施例中，EB1由SEQ.ID.NO:1表示。EB1(人类EB1)的cDNA核酸序列的一个优选实例可通过由SEQIDNO:2表示的NCBI参考序列U24166获得。然而，术语EB1还包括修饰、所述序列的更多简并变体、所述序列的互补序列以及与所述序列之一杂交的寡核苷酸。这类修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。更优选地，它包括与所述序列具有至少约75％一致性、尤其优选至少约85％一致性、特别优选至少约95％一致性并且更特别优选约99％一致性的序列。在又一个特别优选的实施例中，EB1是核酸或蛋白质水平上的实体，该EB1在核酸水平上由SEQIDNO.2或与此序列具有至少95％一致性、优选至少99％一致性的序列来表示。在一个特别优选的实施例中，EB1由SEQ.ID.NO:.2表示。EB1的水平EB1的水平可在蛋白质水平上或在核酸水平上(例如RNA或cDNA)进行检测。EB1的水平可通过技术人员熟知的技术手段在样品中进行测定。它可以在转录或翻译水平下进行测定。在一个优选的实施例中，测量样品中的EB1核酸、优选EB1mRNA的水平。本领域已知的适用于测量核酸水平下EB1的水平的基因表达分析方法的实例包括但不限于，i)使用能够与mRNA杂交的标记探针；ii)使用涉及基于EB1基因序列的一个或多个引物的PCR，例如使用利用标记探针(例如荧光探针)的定量PCR方法，诸如定量实时PCR；iii)微阵列；IV)RNA印迹V)基因表达的连续分析(SAGE)、READS(消化的cDNA的限制酶扩增)、差异显示和测量微小RNA。在一个优选的实施例中，测量蛋白质水平下的EB1的水平。本领域已知的适用于测量蛋白质水平下的EB1的水平的蛋白质表达分析方法的实例包括但不限于，i)免疫组织化学(IHC)分析，ii)蛋白质印迹iii)免疫沉淀iv)酶联免疫吸附测定(ELISA)v)放射免疫测定vi)荧光激活细胞分选(FACS)vii)质谱法，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI，例如MALDI-TOF)和表面增强激光解吸/电离(SELDI，例如SELDI-TOF)。涉及以上一些方法的抗体可以是单克隆或多克隆抗体、抗体片段和/或各种类型的合成抗体，包括嵌合抗体、DARPS(设计的锚蛋白重复序列蛋白)或DNA/RNA适体。抗体可被标记以使该抗体在与一种或多种另外的种类反应之后能够检测到或能够检测，这些另外的种类例如使用得到标记的或能够产生可检测结果的第二抗体。对EB1有特异性的抗体可例如从BD生物科学公司和细胞信号传导有限公司(CellSignalingTechnology,Inc.)商购获得，或者可以经由技术人员熟知的常规抗体生成方法来制备。蛋白质分析的优选方法是流式细胞术(FACS)、ELISA、荧光显微镜检术、质谱技术、免疫组织化学以及蛋白质印迹，更优选地是FACS、蛋白质印迹法和免疫组织化学。在FACS中，荧光标记的抗体或探针用于结合悬浮液中的完整细胞(固定的或天然的)上的特异性细胞蛋白或抗原，其中来自结合细胞抗原的可检测标记的信号强度对应于单细胞中表达的蛋白质的量并且可以被定量。在荧光显微镜检术中，使用荧光标记的抗体或探针结合特异性细胞蛋白(抗原)，其中蛋白质的量和位置可以通过来自可检测标记的信号检测和测量。在蛋白质印迹(也称为免疫印迹)中，可以使用标记抗体来评定蛋白质水平，其中来自可检测标记的信号强度对应于蛋白质的量，并且可以例如通过密度测定来定量。免疫组织化学同样使用标记抗体或探针来检测生物标记物的存在和相对量。它可以用于评定存在生物标记物的细胞的百分比。它也可以用于评定生物标记物在单个细胞中的定位或相对量；后者被认为是染色强度的函数。ELISA代表酶联免疫吸附测定，因为它使用连接到抗体或抗原的酶来检测特异性蛋白质。通常如下执行ELISA(但是存在方法学的其他变化)：使用识别生物标记物的第一抗体涂覆固体基底诸如96孔板。然后通过对生物标记物有特异性的第二抗体识别结合的生物标记物。这可以直接连接到酶或者可以使用连接到酶的第三抗免疫球蛋白抗体。加入底物并且该酶催化反应，从而产生特定的颜色。通过测量这种颜色的光密度，可以确定生物标记物的存在和量。优选测量CSC中的EB1水平。这可以通过直接观察样品中的CSC中的EB1水平，或者通过在测量EB1水平之前富集样品中的CSC来完成。例如，可使用免疫组织化学、FACS或者通过用同时使CSC和EB1共同特别可视化的试剂染色进行的免疫荧光、或通过首先用使CSC可视化的试剂染色并且然后用使EB1可视化的试剂染色进行的免疫荧光来直接测量CSC中的EB1水平。生物标记物的用途在一个优选的实施例中，生物标记物用于预示个体中的疾病对如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的固有敏感性。在另一个优选的实施例中，生物标记物用于预示个体中的疾病对如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的获得性抗性。生物标记物可用于选择患有或易患有疾病、优选癌症的个体，以使用如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗。这种生物标记物的水平可用于识别对使用这类药剂的治疗可能应答或不应答或者继续应答或不继续应答的患者。可对患者进行分层以便避免不必要的治疗方案。具体地，生物标记物可用于识别其一个或多个样品相对于一个标准水平或一组标准水平显示更高EB1水平的个体，于是然后可选择这类个体以使用如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗。生物标记物也可用于帮助确定治疗方案，关于给药的量和时间表。另外，生物标记物可用于帮助选择有待给予个体的药物组合，包括一种或多种式I的化合物或其药学上可接受的衍生物以及另外的一种或多种化学治疗(细胞毒性)剂。此外，生物标记物可用于帮助确定个体中的疗法策略，该疗法策略包括式I的化合物或其药学上可接受的衍生物是否与靶向疗法、内分泌疗法、生物制剂、放射疗法、免疫疗法或手术介入或这些疗法的组合结合给予。EB1也可与其他生物标记物结合使用以预示对式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答并确定治疗方案。它还可以与化学敏感性测试结合使用以预示敏感性并确定治疗方案。化学敏感性测试涉及将式I的化合物直接应用于从个体采集的细胞以确定细胞对化合物的反应，该个体例如患有血液恶性肿瘤或可接近实体肿瘤的个体，这些肿瘤例如包括但不限于乳腺癌和头颈癌或黑素瘤。治疗方法在一些方面，本发明还涉及一种治疗方法和用于治疗方法中的EB1，其中首先相对于一个标准水平或一组标准水平或治疗前起始水平建立EB1的水平，并且然后分别在所述样品中的EB1水平高于标准值或一组标准值或者相对于治疗前起始水平降低时，给予如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物。如本领域技术人员熟知的，式I的化合物或其药学上可接受的衍生物可以药物组合物的形式给予。适合的组合物和剂量例如披露于WO2004/103994A1第35-39页中，该专利通过引用明确地结合在此。特别优选用于肠内给予(诸如经鼻、经颊、经直肠或特别是口服给予)以及用于胃肠外给予(诸如静脉内、肌内或皮下给予)温血动物(尤其是人类)的组合物。更具体地，优选用于静脉内给予或口服给予的组合物。在一个实施例中，特别优选用于口服给予的组合物。这些组合物包括活性成分和药学上可接受的载体。组合物的实例包括但不限于含有1mg活性成分、98mg甘露醇和1mg硬脂酸镁或者5mg活性成分、94mg甘露醇和1mg硬脂酸镁的硬胶囊。在一方面，本发明还涉及一种治疗肿瘤性或自身免疫性疾病、优选癌症的方法，该方法通过首先增加个体中的EB1水平、然后用如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物治疗该个体来进行，该个体具有与一个标准水平或一组标准水平或者治疗前初始水平相比更低的EB1水平的样品。EB1的水平可通过直接或间接的化学或遗传手段来增加。这类方法的实例是使用药物的治疗，该治疗导致EB1表达增加以及病毒、质粒或肽构建体、或抗体或siRNA或反义物的靶向递送以上调EB1水平。例如，病毒或质粒构建体可用于增加细胞中的EB1表达。然后可用式I的化合物或其药学上可接受的衍生物来治疗个体。式I的化合物或其药学上可接受的衍生物可以单独给予或与一种或多种其他治疗剂结合给予。可能的组合疗法可采取以下形式：固定组合，或者本发明的化合物与交错或彼此独立给予的一种或多种其他治疗剂的给予，或者固定组合与一种或多种其他治疗剂的组合给予。除此之外或另外地，式I的化合物或其药学上可接受的衍生物可以与化学疗法(细胞毒性疗法)、靶向疗法、内分泌疗法、生物制剂、放射疗法、免疫疗法、手术介入或这些疗法的组合结合给予以用于肿瘤疗法。如上所述，在其他治疗策略的背景下长期疗法与辅助疗法同样可行。其他可能的疗法是在肿瘤消退之后维持患者状态的疗法或甚至例如在处于风险中的患者中的化学预防疗法。试剂盒和装置在一方面，本发明涉及一种试剂盒，并且在另一方面，涉及一种用于预示优选个体中的疾病对如上所定义的式I的化合物或其药学上可接受的衍生物的应答的装置，该装置包含永不测量样品中的EB1水平所必需的试剂。优选地，这些试剂包括包含EB1的检测剂的捕获试剂和检测试剂。试剂盒和装置还可优选包含比较器模块，该比较器模块包含与样品中的EB1水平相比较的标准值或一组标准值。在一个优选的实施例中，比较器模块包括在使用试剂盒的说明书中。在另一个优选的实施例中，比较器模块呈显示装置的形式，例如颜色条带或数字编码材料，该显示装置被设计为放置在样品测量读数的旁边以指示抗性水平。该标准值或该组标准值可如上所述来确定。就EB1而言，试剂优选地是选择性结合EB1的抗体或抗体片段。适合的样品是组织、肿瘤组织或CSC样品、固定且石蜡包埋的或冷冻的组织、肿瘤组织或CSC样本的切片，以及血液、脑脊液和其他体液来源的样品(包括循环肿瘤细胞和CSC)。优选地，试剂是呈结合EB1的一种特异性第一抗体以及结合第一抗体的第二抗体的形式，并且该第二抗体自身被标记以用于检测。第一抗体也可被标记以用于直接检测。试剂盒或装置还可任选地含有一种或多种洗涤溶液，与其他生物标记物相比，该洗涤溶液选择性地允许结合的生物标记物在洗涤后保留在捕获试剂上。然后可以将这类试剂盒用于ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术(FACS)、免疫荧光显微镜检术、免疫组织化学或其他免疫化学方法中以检测生物标记物的水平。基于非抗体的特异性探针也可用于检测EB1的水平，这些探针例如药物亲和应答靶标稳定性(DARTS)或适体。在另一个优选的实施例中，试剂还可以是能够测量样品中的EB1核酸水平的那些试剂。适合的样品是组织、肿瘤组织或CSC样品、固定且石蜡包埋的或冷冻的组织、肿瘤组织或CSC样本的切片，以及血液、脑脊液和其他体液来源的样品(包括循环肿瘤细胞和CSC)。优选地，试剂包含用于与样品中的EB1核酸杂交的标记探针或引物。基于PCR扩增技术或标记探针的检测的适合检测系统允许定量样品中的EB1核酸。这可以如下完成：i)在样本本身上原位，优选在石蜡包埋或冷冻的样本的切片中，ii)在来自肿瘤、组织或血液和脑脊液来源的样本(包括循环肿瘤细胞和CSC)的提取物中，其中适合的试剂选择性地富集核酸。试剂盒或装置能够通过基于探针本身或附接至引物的报告基因的特定物理化学特性的方法来测量和定量i)与样本原位杂交的标记探针的量或者ii)基于引物的扩增产物的量。类似地，试剂盒和装置可含有选择性结合CSC的试剂。如上所述，这类试剂可靶向CSC标记物。此外，装置可包括成像装置或测量装置(例如但不限于荧光的测量)，这些装置进一步处理所测量的信号并将它们转换成比较器模块中的标度。在本说明书中，词语“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解为暗示包括所述条目或条目组，但不排除任何其他条目或条目组。实验方法学来自患者的肿瘤样品在知情同意后从手术前未接受化学疗法或放射疗法的患者获得胶质母细胞瘤(GBM)样品(世界卫生组织，IV级)。在手术后将初级新鲜GBM样品收集在补充有0.5％胎牛血清(FCS)，塞吉蓬图瓦兹的吉毕科-英杰公司(Gibco-Invitrogen,CergyPontoise))、1％青霉素-链霉素和1％丙酮酸钠(吉毕科-英杰公司)的杜氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)(法国圣奥班的生命技术公司(Lifetechnologies,SaintAubin,France))中。在4小时内，将肿瘤洗涤、切开、使用麦基文(McIlwain)组织切块机自动切片并且用5mg/mL的胰蛋白酶(法国巴黎的西格玛奥德里奇公司)和200U/mL的DNA酶(西格玛奥德里奇公司)在37℃下酶促解离10分钟。通过加入DMEM10％FCS来停止反应。过滤悬浮液并将所收集的细胞离心。然后计数细胞并且台盼蓝染色(西格玛奥德里奇公司)证实超过80％的细胞活力。然后将细胞重悬于DMEM-FCS10％中直到它们基于A2B5+抗原表达进行分离。基于A2B5+抗原表达的GBMCSC分离将从肿瘤分离的细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水、0.5％牛血清白蛋白(BSA；西格玛奥德里奇公司)、2mMEDTA(西格玛奥德里奇公司)中，并在4℃下与封闭试剂(法国巴黎的美天旎生物技术公司)一起孵育10分钟。然后加入抗A2B5微珠并在4℃下孵育15分钟。洗涤细胞并使用MACS柱进行阳性磁性细胞分离(MACS，法国巴黎的美天旎生物技术公司)。如通过荧光显微镜检术进行的A2B5对照-免疫染色所评定的，平均纯度是大约93％(从85％至98％范围内)。从来源于室下区(GBM6)和皮层(GBM9)的两个多形性胶质母细胞瘤肿瘤中分离A2B5+细胞。GBM6和GBM9细胞的培养将GBM6或GBM9细胞以30'000个细胞/25cm3烧瓶的密度铺板在3.5mL作为干细胞容许培养基的DMEM/F12培养基(生命技术公司(Lifetechnologies))中并保持在5％CO2/95％O2中，该DMEM/F12培养基补充有激素(5mg/mL胰岛素、0.1mM腐胺、100mg/mL转铁蛋白、2.10-8M孕酮；全部来自西格玛奥德里奇公司)、50mg/mL青霉素-链霉素(生命技术公司)以及生长因子，这些生长因子包括10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，西格玛奥德里奇公司)、20ng/mL表皮生长因子(EGF，法国里尔的R&D系统公司(R&Dsystems,Lille,France))和B27(生命技术公司)。培养物每周进料两次，并且球体每两周解离一次。细胞转染从西格玛奥德里奇公司获得特异性敲低人类EB1(NM_012325)的shRNA质粒和阴性shRNA对照质粒(非靶标shRNA对照载体)。使用lipofectamineTM2000系统(生命技术公司)转染细胞。为了建立稳定的克隆，在转染后24小时，在含有2μg/mL嘌呤霉素(西格玛奥德里奇公司)的培养基中选择shRNA转染的细胞和相关对照克隆。在使用lipofectamineTM2000系统(英杰公司)用peGFP-N3载体(法国圣日耳曼昂莱的克隆技术公司(Clonetech,SaintGermainenLaye,France))转染并用0.6mg/mL遗传霉素(生命技术公司)选择之后，获得稳定的GFP细胞系。EB1免疫印迹分析将GBMCSC在裂解缓冲液(Tris50mMpH8.0、NaCl250mM、Triton-x1001％、SDS0.1％以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(均来自西格玛奥德里奇公司))中裂解。将30μg总蛋白裂解液装载到12％SDS-PAGE凝胶上。将硝酸纤维素膜(法国马尔讷拉科凯特的伯乐公司(Bio-Rad,MarneslaCoquette,France))在含有0.1％吐温(西格玛奥德里奇公司)pH7.4的PBS(生命技术公司)中用5％牛乳(粉末)封闭1小时，并且然后在相同溶液中与小鼠抗EB1抗体(克隆5，法国勒蓬德克莱的BD生物科学公司(BDBiosciences,LepontdeClaix,France))(1/1000)和小鼠α-微管蛋白抗体(克隆DM1A，西格玛奥德里奇公司)一起孵育。然后将膜在PBS-5％牛乳中洗涤15分钟三次，并且然后与抗小鼠过氧化物酶缀合的第二抗体(美国巴尔的摩的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch,Baltimore,USA))一起孵育1小时，接着在PBS中洗涤15分钟三次。然后使用化学发光检测试剂盒(法国伊夫林圣康坦的密理博公司(Millipore,SaintQuentinenYvelines,France))检测结合的抗体。使用G:BOX(法国伊夫林圣康坦的Syngene/Ozyme公司)记录信号并使用ImageJ软件进行定量。细胞毒性测定将细胞(5000个细胞/孔)接种在先前涂覆聚-DL-鸟氨酸(西格玛奥德里奇公司)的96孔板(10μg/mL)中并允许生长24小时，然后用BAL27862处理。在72小时后通过使用磺酰罗丹明B测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司)来测量细胞的生长抑制。使用微板读取器(LabsystemsMultiscan，法国伊夫特河畔维勒邦的赛默公司(Thermo,VillebonsurYvette,France))分析细胞密度，并用GraphPad5.0统计软件(美国拉荷亚(LaJolla,USA)的GraphPad软件)执行EC50分析。执行至少三次独立实验。集落形成存活测定使细胞在先前涂覆聚-DL-鸟氨酸(西格玛奥德里奇公司)的6孔板(1000个细胞/孔)中生长并且在用BAL27862处理72小时后孵育高达5天。用20％甲醇中的1％结晶紫溶液(西格玛奥德里奇公司)对集落进行染色。计数具有超过50个细胞的集落。执行至少三次独立实验。细胞迁移测定将干细胞(50'000个)倒在处于DMEM中的跨孔(transwell)迁移小室(0.8μm过滤器，BD)的上侧。将小室的下侧用补充有10％FCS的DMEM填充。使细胞转移5小时，并且然后去除小室。未迁移的细胞停留在过滤器上部并用棉签去除；将过滤器下侧的细胞用1％戊二醛(西格玛奥德里奇公司)固定，并用20％甲醇中的1％结晶紫溶液(西格玛奥德里奇公司)染色。在洗涤并干燥之后，以10×放大率对每种条件下6个视野的照片进行成像，并计数转移的细胞。GBM6脑肿瘤CSC的FACS分析将GBM6细胞以300'000个细胞/孔接种到涂覆聚-DL-鸟氨酸的6孔板(10μg/mL)(西格玛奥德里奇公司)的干细胞容许培养基(5mg/mL胰岛素、0.1mM腐胺、100mg/mL转铁蛋白、2.10-8M孕酮、50mg/mL青霉素-链霉素以及包括10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/mL表皮生长因子(EGF)和B27在内的生长因子)中。在一天后，将细胞用BAL27862处理72小时。然后，将细胞胰蛋白酶化，悬浮于含有封闭溶液(美天旎生物技术公司)的汉克斯(Hanks)平衡盐溶液(HBSS)缓冲液(生命技术公司)中，并与A2B5-APC(克隆105HB29，参考号130-093-582)和CD133-PE(克隆293C3，参考号130-090-853)抗体(美天旎生物技术公司)一起孵育10分钟。然后将细胞用10％多聚甲醛(西格玛奥德里奇)固定20分钟，并使用流式细胞术(FACSCaliburTM，BD生物科学公司)进行分析。对每个样品计数总共100'000个事件，并用CellQuestPro软件(BD生物科学公司)记录数据并使用FlowJo软件(加利福尼亚州圣卡洛斯的树星有限公司(TreeStarInc.,SanCarlos,CA))和Dean-Jet-Fox模型分析来分析这些数据。自我更新能力确定将GBM6细胞接种在先前涂覆聚-DL-鸟氨酸(西格玛奥德里奇公司)的6孔板(150,000个细胞/孔)中。在24小时后，将细胞用BAL27862处理或不处理72小时。在处理结束时，去除上清液并收获细胞，将其解离成单细胞并接种在96孔板(1-5个细胞/孔)中。在八天后，在倒置光学显微镜(莱卡DMI4000B)(法国圣若里奥兹的莱卡公司(Leica,SaintJorioz,France))下将球体计数。执行三次独立实验。原位GBM6异种移植物将大约100'000个GBM6GFPsh0或shEB1细胞定向性地注射到6周龄无胸腺裸鼠的室下区(前囟前0.5mm，距皮层表面侧向-1mm并且深-2.1mm)。将移植的小鼠用25mg/kgBAL101553(在神经胶质瘤植入后30天、33天和36天三次)或用媒介物(对照)静脉内治疗。在植入后四十五天，处死每组三只动物以进行肿瘤体积分析(通过三维脑重建)或进行FACS分析。三维脑重建为了分析肿瘤体积，将小鼠麻醉并用4％多聚甲醛灌注。将脑移出并在4℃下在4％多聚甲醛中固定2天，然后冲洗并保存在PBS中直到解剖。使用振动切片机(莱卡公司)遵循矢状轴将脑完全切成50-100μm厚的切片。每个脑共获得60个切片。通过使用莱卡DMLB荧光显微镜、莱卡DC300F数字照相机和莱卡FW4000成像软件(莱卡公司)执行GFP注射的细胞和肿瘤的绘图和分析。使用FreeD软件获得三维脑重建(AndreyP.,Free-D:anintegratedenvironmentforthree-dimensionalreconstructionfromserialsections[Free-D：由连续部分进行三维重建的集成环境].JournalofNeuroscienceMethods[神经学方法杂志].2005；145(1-2):233-244)。简言之，基于Franklin和Paxinos图谱的数字化脑切片(包括脑室和胼胝体)被仪器化以定位这些切片内的EGFP细胞。使用六十个数字化矢状切片来构建整个小鼠脑。来自原位GBM6肿瘤的脑肿瘤癌症干细胞的FACS分析在麻醉后，用PBS灌注动物，并且去除脑并将其储存在含有2％FBS的HBSS缓冲液中。将细胞在酶混合物(DNA酶I(瑞士罗特科鲁兹的罗氏公司(Roche,Rotkreuz,Switzerland))、胶原酶D(罗氏公司)和胶原酶V(西格玛奥德里奇公司)，使用GentleMACS解离器(美天旎生物技术公司))中解离。通过加入含有10％FCS的DMEM来停止反应。过滤悬浮液并将细胞重悬于40％Percoll(西格玛奥德里奇公司)中。在离心后，去除髓磷脂并将细胞重悬于含有2％FCS的HBSS缓冲液中。将细胞在含有2％FCS的HBSS中与A2B5-APC和CD133-PE抗体一起孵育10分钟。然后将细胞用10％多聚甲醛固定20分钟，并使用流式细胞术进行分析。对每个样品计数总共100'000个事件，并用CellQuestPro软件记录数据并使用FlowJo软件选择Dean-Jet-Fox模型分析来分析这些数据。GBM10侧翼肿瘤提取和从来源于携带肿瘤小鼠的血清中分离胞外囊泡(包括外泌体)根据标准程序将携带大(250-420mg)GBM10侧翼肿瘤的雌性无胸腺裸鼠(无胸腺Ncr-nu/nu)安乐死，并且通过心脏穿刺将最大量的血液抽取到涂覆硅酮的BD血液收集管(美国马里兰州斯帕克斯的BD诊断公司(BDDiagnostics,Sparks,MD,USA))中。根据制造商的说明将血清从血液中分离出来并储存在-80℃下直到使用。将血清样品在25℃水浴中解冻，然后离心(30分钟，2000×g，4℃(具有微升转子45的贺力氏(Heraeus)PrimoR离心机；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司赛默科学公司(ThermoScientific,ThermoFisherScientific,Waltham,MAUSA))以去除细胞和碎片。将来自两只小鼠的澄清血清合并并将其用于使用总外泌体分离试剂盒(英杰公司)根据制造商的说明书进行的胞外囊泡分离。将沉淀悬浮在50μL2×SDS样品缓冲液(0.125MTrispH6.8、4％SDS、20％甘油)中，并且通过PierceTM660nm蛋白质测定(赛默科学公司)根据制造商的说明书确定蛋白质浓度。将样品储存在-80℃直到使用。紧接着在处死后，使用标准程序解剖来自相同小鼠的GBM10侧翼肿瘤，在液氮中急速冷冻并储存在-80℃直到使用。将冷冻的肿瘤放置在每45mg肿瘤含有1mL提取缓冲液(50mMHepespH7.4、150mMNaCl、5mMEGTA、1mMEDTA、1％NP-40、1mMDTT、1mMPMSF和2×蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物[赛默科学公司])的gentleMACSM管(美天旎生物技术公司)中。在gentleMACS解离器(美天旎生物技术公司)中使用梯度速度程序将肿瘤解离40秒。将肿瘤提取物在冰上孵育30分钟，并且随后在4℃下以10,000rpm(具有微升转子45的贺力氏PrimoR离心机；赛默科学公司)离心30分钟。保留上清液并如上确定蛋白质浓度。将样品储存在-80℃直到使用。GBM10侧翼肿瘤和胞外囊泡(包括外泌体)分析通过如下siRNA转染制备EB1免疫印迹对照：在转染前，将1.2×106个HeLa细胞(美国维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心；参考号CCL-2)铺板在75cm2组织培养瓶中7小时。使用20nM非靶向对照(NTC)siRNA(美国科罗拉多州拉斐特的Dharmacon通用电气医疗公司(DharmaconGEHealthcare,Lafayette,CO,USA)；参考号D-001810-10-20)或EB1siRNA(Dharmacon通用电气医疗公司；参考号L-006824-00)使用1000μLopti-MEM(吉毕科)和60μL转染试剂(荷兰芬洛的凯杰公司(QIAGEN,Venlo,Netherlands))根据制造商的说明书对细胞进行瞬时转染。将细胞在具有5％CO2的潮湿气氛中在37℃下再培养72小时，之后收集到2×SDS样品缓冲液中。向来源于携带GBM10肿瘤小鼠血清的胞外囊泡、来源于健康供体的人类血清的对照外泌体(汉莎生物医学公司；参考号HBM-PES-30/2)和以2×SDS样品缓冲液制备的HeLa细胞裂解物中补充有用于还原条件的0.2MDTT和0.02％溴酚蓝以及1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(赛默科学公司)。对于非还原性条件(仅为CD9免疫印迹所需要)，省略DTT。通过将三份肿瘤裂解物与一份4×Laemmli样品缓冲液(伯乐公司)和355mM最终浓度的2-巯基乙醇(西格玛公司)混合来制备肿瘤提取物。将所有样品在95℃下煮沸5分钟。将蛋白质(分别是对于肿瘤提取物为20μg、对于HeLa细胞提取物10μg以及对于来源于健康供体人类血清的胞外囊泡或对照外泌体为30μg或10μg，以用于EB1或CD9免疫印迹)通过SDS/PAGE分离并转移至PVDF膜(TurboTM，伯乐公司)。在用PBS/0.1％(v/v)吐温20中的5％牛乳在室温封闭1小时后，将膜在4℃下用以下第一抗体探测过夜：抗EB1(西格玛公司；参考号E3406)、抗CD9(美国加利福尼亚州苗比达的生物视野公司(BioVision,Milpitas,CA,USA)；参考号A1500-50)或抗肌动蛋白(德国达姆施塔特的默克集团密理博公司(Millipore，MerckKGaA，DarmstadtGermany)；参考号MAB1501)。将膜在室温下与山羊抗兔IgG-HRP第二抗体(美国宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA，USA)；参考号111-035-144)或山羊抗小鼠IgG-HRP第二抗体(杰克逊免疫研究公司；参考号115-035-146)一起孵育，并且使用ECL主要蛋白质印迹检测试剂(美国伊利诺州芝加哥的通用电气医疗公司(GEHealthcare，Chicago，IL，USA))将装饰蛋白可视化。使用FUSIONSOLOS仪器和FUSION-CAPT软件(法国马恩拉瓦莱的VilberLourmat公司(VilberLourmat，MArne-la-Valée，France))来记录信号。具体实例实例1：BAL27862对GBM6和GBM9CSC的细胞毒性活性的比较BAL27862对GBM6和GBM9CSC的细胞毒性活性的浓度-应答曲线显示BAL27862对两个细胞系均具有可比较的细胞毒性活性，其中EC50为大约20nM(参见表1)：表1EC50+/-SEMGBM620.8+/-1.3nMGBM921.7+/-0.8nM数据来自至少三次独立实验。实例2：GBM6和GBM9GBMCSC中的EB1蛋白表达水平在GBM6相对于GBM9CSC中的EB1表达水平的免疫印迹确定表明GBM6细胞表达比GBM9更高的EB1蛋白水平(参见图1)。归一化为α微管蛋白水平，GBM6表达比GBM9细胞高17.9倍的EB1蛋白的量。实例3：BAL27862在GBM6中比在GBM9CSC中更有效地抑制体外细胞迁移GBM6和GBM9细胞的跨孔迁移测定使用两种不同的BAL27862浓度来执行，这两种浓度定义为非细胞毒性(6nM)和细胞毒性(20nM)(参见实例1)。正如所料，细胞毒性浓度(20nM)在相似程度上显著抑制两种细胞系的迁移，这指示在此浓度下对细胞具有一般的细胞毒性。然而，在6nM非细胞毒性浓度下，GBM6细胞显示对细胞迁移的统计上显著的抑制，而GBM9细胞不响应(参见图2)。这指示与GBM9相比，GBM6迁移可以通过低的非细胞毒性浓度的BAL27862来特异性抑制，这是与更高的EB1水平相关联的现象。实例4：EB1表达水平受到shRNA转染抑制的稳定表达GFP的GBM6CSC的分析通过免疫印迹测试用shRNA(shEB1)、非靶向对照shRNA(sh0)转染的稳定表达GFP的GBM6细胞和未处理的GBM6的EB1表达水平(参见图3)。将所测量的信号归一化至α微管蛋白表达。与对照GBM6细胞相比，用shEB1稳定转染的GBM6细胞显示EB1表达水平降低69％。实例5：EB1下调使GBM6CSC对非细胞毒性BAL27862浓度的抗迁移效应不敏感性在6nMBAL27862浓度下测量的细胞迁移在表达EB1的对照细胞中显示统计上显著的细胞迁移抑制，而在EB1下调的GBM6细胞中，BAL27862处理的抑制作用显著降低(参见图4)。这表明EB1蛋白涉及BAL27862在GBMCSC中的抗迁移作用。实例6：BAL27862以EB1表达依赖性方式抑制GBM6CSC的集落形成能力在用DMSO对照或者3nM、6nM和10nMBAL27862(非细胞毒性浓度)孵育72小时之后，评估GBM6GFPsh0(正常EB1水平)和GBM6GFPshEB1(下调的EB1水平)的集落形成能力(参见图5)。值得注意的是，BAL27862仅在表达EB1的细胞中以统计上显著的方式在6nM和10nM的亚毒性剂量下损害GBM6CSC的集落形成能力。这指示在集落形成测定中BAL27862的活性需要EB1。实例7：BAL27862以EB1表达依赖性方式促进体外干细胞分化。在BAL27862处理后，A2B5阳性GMB6细胞数的FACs分析显示6nMBAL27862处理仅在表达EB1时(GBM6GFPsh0细胞)具有显著抑制(参见图6)。相比之下，对A2B5呈阳性且对EB1表达呈阴性的GBM6细胞(GBM6GFPshEB1，EB1下调的细胞)对6nMBAL27862较不敏感。由于A2B5表达的丧失与分化相关联，这表明BAL27862以EB1表达依赖性方式诱导GBM6CSC的分化。实例8：BAL27862以EB1表达依赖性方式促进体外干细胞分化。在GBM6野生型和GBM6GFPsh0细胞(具有正常EB1水平)中，BAL27862(6nM)处理以剂量依赖性方式在统计上显著地干扰球体形成(参见图7)。然而，EB1下调(GBM6GFPshEB1细胞)抑制BAL27862在GBM6CSC中的抑制活性。由于形成球体的能力的丧失与分化相关联，这表明BAL27862以EB1表达依赖性方式诱导GBM6CSC的分化。实例9：BAL101553(BAL27862的前药)对表达EB1的原位GBM6肿瘤具有增加的活性将在第0天接收定向性植入室下区的GBM6GFPsh0(正常EB1表达水平)或GBM6GFPshEB1(EB1下调)细胞的小鼠在第30/33/36天用25mg/kgBAL10155静脉内处理或者用媒介物对照处理，并且在第45天处死，以取出脑。将小鼠脑处理成连续矢状切片，然后通过使用荧光显微镜来分析并记录这些连续矢状切片。将从单个切片拍摄的照片用于三维重建。在表达EB1的肿瘤中与媒介物处理相比BAL101553处理导致肿瘤质量(大小)和肿瘤扩散明显降低，这指示BAL101553对肿瘤生长和体内肿瘤细胞迁移的抑制作用(参见图8)。然而，BAL101553的这种作用在EB1阴性肿瘤中最小，这与体外数据一致，在体外数据中EB1表达与BAL27862对CSC的活性正相关。实例10：BAL101553处理降低原位GBM6肿瘤中未分化CSC的比例将在第0天接收定向性植入室下区的GBM6GFPsh0(正常EB1表达水平)或GBM6GFPshEB1(EB1下调)细胞的小鼠在第30/33/36天用25mg/kgBAL10155静脉内处理或者用媒介物对照处理，并且在第45天处死，以取出脑。将小鼠脑解离成单细胞悬浮液，通过使用抗A2B5抗体对A2B5阳性GBMCSC进行染色，并且通过FACS分析。计算A2B5阴性GBM6细胞与A2B5阳性GBM6细胞的比例。表达EB1的GBM6肿瘤的BAL101553处理将肿瘤细胞的比例转变为强烈倾向于A2B5阴性细胞(80％阴性相对于20％阳性)，这与对照相比是明显的转变(40％阴性相对于60％阳性)(参见图9)。相比之下，在EB1下调的GBM6肿瘤中，在BAL101553处理时，A2B5阳性细胞的比例反而增加(大约从60％至80％)，这指示与表达EB1的肿瘤相比，在EB1下调的脑肿瘤中未分化GBM6CSC的含量更高。实例11：来源于表达EB1的携带GBM10肿瘤小鼠的胞外囊泡(包括外泌体)对EB1蛋白呈阳性通过EB1表达的免疫印迹来分析从携带大GBM10侧翼肿瘤的小鼠分离的肿瘤和胞外囊泡。使用来源于来自健康供体的人类血清的对照外泌体和作为胞外囊泡(外泌体)标记物的CD9来证实胞外囊泡(包括外泌体)的有效分离(Zarovni等人,Integratedisolationandquantitativeanalysisofexosomeshuttledproteinsandnucleicacidsusingimmunocaptureapproaches[使用免疫捕获方法对外泌体穿梭蛋白和核酸的整合分离和定量分析].Methods[方法学],2015；87:46–58；Théry等人,MolecularCharacterizationofDendriticCell-derivedExosomes:SelectiveAccumulationoftheHeatShockProteinhsc73[树突细胞来源的外泌体的分子特征：热休克蛋白hsc73的选择性积累].TheJournalofCellBiology[细胞生物学杂志],1999:3:599-610)。提取的肿瘤的EB1表达的免疫印迹在三个单独的肿瘤中显示一致的表达(图11)。使用来源于用EB1siRNA处理的细胞的HeLa提取物来证实抗体对EB1的特异性，与对照非靶向siRNA对照(NTC)提取物相比，该HeLa提取物显示显著的EB1降低(图11)。此外，从携带肿瘤小鼠的血清获得的胞外囊泡(包括外泌体)也显示含有EB1蛋白，这指示该胞外囊泡可能是GBM肿瘤EB1表达分析的有用替代来源(图12)。当前第1页1 2 3