本发明涉及一种用于确定表面等离子体共振SPR生物传感器系统的仪器依赖参数的方法以及一种用于监测SPR生物传感器中的表面接合交互的方法。
背景技术：
能够实时监测分子交互的分析传感器系统（即，免标记系统）正获得越来越多的兴趣。这些系统常常基于光学生物传感器，并且通常称作交互分析传感器或生物特异交互分析传感器。一种有代表性的生物传感器系统是由GE Healthcare Life Sciences销售的Biacore®仪表，其将表面等离子体共振（SPR）用于检测样本中的分子之间的交互与固定在感测表面上的分子结构。通过Biacore®系统，有可能在无需使用标记的情况下实时地不仅确定样本中的特定分子的存在和浓度，而且还确定诸如例如分子交互的结合速率和解离速率常数的附加交互参数。在文献（参见例如Jonsson U.等人，BioTechniques 11: 620—627 （1991））中全面描述设备和理论背景。通常，该技术涉及配体到传感器芯片（流动池）的特殊光学传感器表面的固定，从而将传感器芯片与包含感兴趣分析物的样本流接触，并且然后测量产生于配体与分析物之间的接合的传感器芯片的表面光学特性的变化。对于关于SPR的另外的细节，还参照美国专利No. 5，313，264、美国专利No. 5，573，956和美国专利No. 5，641，640。
免校准浓度分析（CFCA）从在运行化验时作为评估变量所提供的扩散系数和分子重量的值以及所测量的质量传输性质来计算分析物浓度。评估基于将传感图数据拟合到交互动力学学模型，所述交互动力学学模型包含质量传输分量。从所提供的扩散系数、流动池特性和分子重量来计算质量传输参数。通过设置为全局拟合变量的分析物浓度，能够确定分析物的未知浓度。
由基于SPR的生物传感器系统所执行的包括CFCA的测量使用取决于所使用的芯片、流动池特性和其他仪器特性的系统依赖常数，并且允许将所测量响应单位转换为质量单位。
技术实现要素：
本发明的目的是改进在表面等离子体共振（SPR）生物传感器系统中执行的测量的测量精度。
这在根据利要求1的方法中实现。由此对于每个特定仪器、流动系统和传感器表面来调整所使用的常数的仪器依赖部分，并且能够实现更准确测量。
在从属权利要求中描述不同的实施例。
附图说明
图1是示出本发明的一个实施例的方法步骤的流程图。
具体实施方式
免校准浓度分析CFCA能够描述为通过使用基于SPR的生物传感器系统来测量活性浓度（即能够接合到与传感器表面所附连的目标的分子的浓度）的方法。
蛋白质的活性浓度通过蛋白质与其接合配偶体（partner）的交互来定义，并且能够与总蛋白质浓度不同，如果分子的一些不能接合的话。如果蛋白质具有若干不同接合位点，则能够对每个接合位点建立活性浓度。在当前Biacore®评估软件中，活性浓度称作免校准浓度分析（CFCA）。
在典型实验中，交互配偶体（配体）附连到传感器表面，以及其浓度被测量的感兴趣分子（分析物）在明确定义的流动池中采用恒定层流来传递。在这种途径中，仅测量能够接合到固定配体的分析物小部分的浓度。配体与分析物之间的接合是由（i）分析物从块体到表面的扩散以及（ii）分析物到配体接合所组成的二步过程。如果扩散速率比分子之间的接合速率要慢得多，则络合物形成的速率受到传输速率的限制，以及对于相反情况，络合物形成的所观测的初始速率对应于本征反应速率。
质量传输系数km描述高度h的流动池中具有扩散系数D的分子到传感器表面的通量，如由等式1所述：
在实际SPR检测系统中，有效长度与流动池长度不同，并且km定义为：
其中，α是从流动池入口到检测区中心的距离，以及β是检测区长度。
浓度计算所要求的分析物的扩散系数能够以实验方式获得或者使用Hydropro程序从三维结构（如果可用的话）来获得。基于斯托克斯定律（Stoke’s law）和爱因斯坦-萨瑟兰（Einstein-Sutherland）方程的经验公式（等式3）也能够用来评估D，但是分析物的相对摩擦比f/f0和溶剂的粘度η必须为已知。对于典型的基于水的缓冲剂，能够假定水的粘度。
η0是在20℃的溶剂的粘度。
为了使传输系数与SPR生物传感器系统（在这个示例中为Biacore®）响应相关并且允许实际流动速率的特定输入，引入tc作为传输系数。
tc=形状因子×f(1/3)×G×MW×km (4)
通过表达G（具有单位g/m2的表面浓度，以RU计，其中1 RU等于10-6 g/m2），并且通过将形状因子设置为0.81，建立与km的关系，并且
G最初假定100 nm葡聚糖层来计算。但是，葡聚糖层的延伸可随固定化水平而变化，并且在芯片类型之间变化。因此，存在G因子的计算中的一些不定性，并且用户可需要改变它的某种灵活性。形状因子允许这种灵活性，并且已经根据经验确定了在Biacore®评估软件中使用的当前值0.81。
质量传输限制MTL的程度取决于若干参数的组合，包括流动池尺寸、流动速率、表面上的自由接合位点的密度、交互的动力学常数以及扩散系数。对于给定分析物-配体对和流动池，MTL通过自由未占据配体的高浓度来促进，其预期在高固定化和低响应水平发生。此外，在这些条件下，与1:1交互方案偏离的络合物接合的影响能够忽略。
MTL的程度能够从传输限制（等式6）和动力学（等式7）条件下观测的初始接合速率来估计：
，以及 （6）
传输限制的程度能够从下式估计：
对于传输限制情况，ka×Rmax>>tc，以及MTL接近1
对于动力学情况，ka×Rmax<<kt，以及MTL接近0
这些关系能够用来估计特定交互的CFCA的可能性，但也是不实际的，因为交互的结合速率常数必须为已知，并且情况不始终是这样。
根据本发明，提供一种用于确定表面等离子体共振SPR生物传感器系统的仪器依赖参数的方法。图1是示出本发明的一个实施例的方法步骤的流程图。该方法包括下列步骤：
S1：识别用于校准步骤中的适当分析物。所述分析物需要具有已知分子重量、已知扩散常数、已知折射率增量和已知浓度。所述分析物还需要接合到在生物传感器系统中使用的芯片。分析物能够接合到芯片本身或者接合到附连到芯片的接合配偶体（配体）。
S3：根据使用所识别分析物和芯片的已知方法通过使用SPR生物传感器系统来测量活性浓度。所述已知方法包括使用仪器依赖常数，所述仪器依赖常数不适合于每个特定仪器、芯片和流动池组合。
S5：将分析物的已知浓度与在步骤S3中所测量的活性浓度进行比较。
S7：根据在步骤S5中所检索的差来调整在用于测量活性浓度的已知方法中使用的仪器依赖常数。
在本发明的一个实施例中，该方法还包括从在步骤S7中所检索的所调整的仪器依赖常数来计算常数（其将响应转换为质量单位）的步骤。
在本发明的一个实施例中，该方法还包括从在步骤S7中所检索的所调整的仪器依赖常数来计算连接到流动池、芯片和其他仪器连接量的其他常数的步骤。
在本发明的一个实施例中，识别适当分析物的步骤还包括分析物需要具有接合配偶体的已知亲和力和已知动力学常数。此外，在本发明的一个实施例中，在用于上述计算的计算算法中使用质量传输常数。
在本发明的一个实施例中，步骤S3包括通过称作免校准浓度分析CFCA的方法来测量活性浓度。此外，在本发明的一个实施例中，将响应转换为质量单位的所计算常数是称作G的常数以及称作形状因子的常数，其均用于计算免校准浓度分析所需的传输系数。
此外，根据本发明，提供一种用于监测SPR生物传感器中的表面接合交互的方法。所述方法包括下列步骤：
- 根据上述步骤S1-S7来确定用于当前使用的特定仪器、芯片和流动池组合的仪器依赖参数；
- 将在步骤S7中所检索的这个新仪器依赖常数用于确定SPR相关响应。
在本发明的一个实施例中，在步骤S7中所检索的新仪器依赖常数被用于确定分析物的浓度。
在步骤S7中所检索的新的仪器/系统/芯片依赖常数还能够用于其他目的，像统一从不同系统所检索的信号。
免校准浓度分析被用来在无需标准的情况下确定浓度。该方法适用于流动池中和传感器表面上存在的质量传输限制的条件。
流动池中和传感器表面上的事件能够描述如下：
宏分子微粒（例如块体（Abulk）中的蛋白质）到芯片表面上的分子（B）的接合是二步过程。在第一步骤，来自块体的蛋白质被传输到具有质量传输系数km的表面（Asurf），以及在第二步骤中，Asurf与B之间的接合采用关联常数ka和解离常数kd进行，并且形成络合物AB。
如果Abulk到传感器表面的传输比Asurf到B的接合要慢，则质量传输限制发生，并且能够测量活性浓度。
实验规程包括对至少两个宽分隔流动速率的响应的监测以及采用适当模型的评估。
从这种实验所获得的曲线（即，传感图）的接合相采用质量传递项（kt）来拟合到双分子交互模型，其中活性浓度（Conc）是拟合参数：
总响应：
AB + RI
在这个模型中，质量传输常数kt的值作为常数被引入，其根据下式计算：
如果我们将这个公式中的参数编组为蛋白质依赖和仪器依赖的，则我们获得：
或者：
对于SPR生物传感器系统的所提出校准，我们将需要：
模型系统，满足质量传输限制条件，其中分析物具有明确定义浓度以及Constanalyte，即分子重量和扩散系数。
在校准规程中，实验将采用与在CFCA中相同的方式来执行，但是实验数据将采用质量传递项（kt）来拟合到双分子交互模型，其中浓度（Conc）为常数，以及kt是拟合的。然后从下式计算Constinstr
备选地，浓度采用与在CFCA中相同的方式来拟合，以及计算的浓度于是与分析物的真实明确定义浓度进行比较。差为“仪器误差”，以及能够调整Constinstr。
满足对校准物（即，质量传输限制条件以及明确定义浓度和Constanalyte）的要求的模型系统的候选是例如具有其交互配偶体的认证维生素标准（具有明确定义浓度的分析物）。