一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用与流程

本发明属于色谱科学、细胞生物学及受体药理学等领域，涉及一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用。

背景技术：

细胞膜色谱是一种有效的从复杂体系中直接筛选识别目标组分的新技术。但由于中药具有多组分、多作用靶点的特殊性，单靶标细胞膜色谱柱在对复杂体系中目标组分进行筛选时，可能忽略同一组分与不同受体作用，对于不同组分与不同受体作用的筛选效率较低。

双靶标细胞膜色谱柱在保持原有单靶标细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了同时活性识别两种不同靶标的可能性，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”目标组分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新技术手段。

但目前关于双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法等技术还鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，该双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了活性识别的位点，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“双组分/多组分双作用靶标”成分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新的技术手段。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种双靶标细胞膜色谱柱，所述双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，所述双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相是由两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分别包裹大孔硅胶制成的。

所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由高表达ige受体的rbl-2h3细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由高表达mrgprx2受体的lad2细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。

所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由利用基因工程技术构建的高表达egfr受体的hek293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由利用基因工程技术构建的高表达fgfr4受体的hek293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。

所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别单组分单靶标、单组分双靶标以及多组分双靶标的目标组分方面的应用。

所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别药物中致敏组分及潜在致敏组分方面的应用。

所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别复杂体系中抗血管生成抑制剂方面的应用。

所述的双靶标细胞膜色谱柱的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养两种表达不同受体类型的细胞，当培养的两种细胞计数分别不低于10⁷个时，去除培养基，分别获得两种细胞；

2)将获得的两种细胞分别用tris-hcl混悬后置于细胞超声破碎仪中进行破碎，然后通过差速离心分离出两种细胞的细胞膜；

3)用pbs缓冲液将两种细胞的细胞膜分别配制成两种细胞膜悬液，在真空条件下将两种细胞膜悬液分别加入到已预先活化的大孔硅胶内，搅拌均匀后静置过夜，得到两种不同受体的细胞膜色谱固定相；

4)将得到的两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合均匀，用装柱机湿法装入柱芯中，即得到双靶标细胞膜色谱柱。

所述柱芯的长度为10mm，内径为3.0mm。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

现有的受体高表达细胞膜色谱柱均为单靶标细胞膜色谱柱，仅能用于研究配体与单受体之间的相互作用，且用于筛选目标组分时仅能够识别作用于单靶标的目标组分。本发明提供的双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，由于该双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，因此本发明提供的双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了活性识别的位点，显著提高了复杂体系中目标组分的筛选效率，不仅能够识别“单组分与单作用靶标靶”的目标组分，还能够识别“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”的目标组分，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“双/多组分双作用靶标”成分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新的技术手段。本发明对于药物的安全性评价和新药先导化合物的发现具有重要意义。

本发明提供的双靶标细胞膜色谱柱的制备方法，将两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分离出来后分别包裹大孔硅胶，制成两种不同受体的细胞膜色谱固定相，再将这两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合均匀后湿法装柱，即得到双靶标细胞膜色谱柱。该方法工艺简单，操作方便。制得的双靶标细胞膜色谱柱能够仿生“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”的相互作用，因此在研究配体与受体相互作用时，不仅能够研究配体与单受体的相互作用，还能够研究“单配体与双靶标”及“多配体与双靶标”之间的相互作用，为多元药物的作用过程分析提供了新的技术手段。

进一步的，在用于筛选药物的致敏组分时，由于致敏组分可通过ige-r和mrgprx2两种受体介导类过敏反应，因此现有的单靶标细胞膜色谱柱在筛选药物致敏组分时具有一定的局限性。本发明建立的ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱能够同时识别药物中能够作用于此两种受体的潜在致敏组分，可用于药物潜在致敏组分的筛选，对于药物的安全性评价具有重要的意义。

进一步的，酪氨酸激酶家族中的egfr和fgfr4是抗血管生成剂的靶受体，通过阻断其磷酸化过程而抑制瘤血管生成。本发明制备的egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱，能够用于中药等复杂体系中抗血管生成抑制剂的筛选，可同时对egfr和fgfr4的配体进行筛选，显著提高了筛选效率，与此同时也有助于发现同时作用于egfr和fgfr4的目标组分，对于多元药物的开发具有重要意义。

进一步的，本发明中双靶标细胞膜色谱柱选用的色谱柱规格为10mm(l)×3.0mm(i.d.)，较之现有的细胞膜色谱柱规格10mm(l)×2.0mm(i.d.)，提高了色谱柱的容量，提高了柱效，提高了复杂体系中微量组分的识别效率。

附图说明

图1为槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液在三种细胞膜色谱柱上的色谱图，其中a为ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱，b为ige-r细胞膜色谱柱，c为mrgprx2细胞膜色谱柱；

图2为丹参超临界提取物在egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱上的色谱图，包含保留组分r1&r2。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

本发明提供一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法。贴壁生长的受体高表达细胞通过消化、差速离心制备得到细胞膜，然后将细胞膜与硅胶充分混合，利用大孔硅胶的吸附作用及细胞膜的流动性将细胞膜包裹在硅胶表面，得到细胞膜色谱固定相。将两种不同受体高表达的细胞膜色谱固定相混合均匀，得到两种受体类型的混合固定相，再通过湿法装入色谱柱中，构成一种双靶标细胞膜色谱柱。该双靶标细胞膜色谱柱增加了活性识别的位点，能够识别筛选出“单组分单靶标”、“单组分双靶标”及“多组分双靶标”目标组分，显著提高复杂体系中目标组分的筛选效率，并为多元药物的开发提供新的技术手段。

本发明中双靶标细胞膜色谱柱的制备方法包含以下操作：

1)细胞膜色谱固定相的制备

将培养的细胞计数不低于(10⁷个)，利用0.25％胰蛋白酶消化，3000g4℃条件下离心10min，去除培养基取沉淀物，加入10mmol/l的pbs缓冲液重新混悬并于3000g4℃条件下离心10min，吸取细胞表面残留的培养基，重复3次，将培养好的细胞分离出来。然后用5ml50mmol/l的tris-hcl混悬细胞置于细胞超声破碎仪中将细胞破碎，1000g4℃条件下离心10min，取上清置于离心管中12000g4℃条件下离心10min，沉淀即为细胞膜，利用10mmol/l的pbs清洗细胞膜1次。再将细胞膜悬液在真空条件下加入到0.05g已预先活化的大孔硅胶内，置于磁力搅拌器上于4℃条件搅拌30min，保证细胞膜与硅胶充分混匀后静置过夜，利用细胞膜的流动性及大孔硅胶的吸附作用，使细胞膜与大孔硅胶充分包裹，即得细胞膜色谱固定相。

2)双靶标细胞膜色谱柱的建立

将两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合均匀，利用rpl-zd10装柱机湿法装入10mm(l)×3.0mm(i.d.)的柱芯中，即得双靶标细胞膜色谱柱。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

药物类过敏反应是临床不良反应中最常见且危害严重的现象。通常，引发类过敏反应的受体为ige-r和mrgprx2。本发明制备ige-r和mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱可以全面的筛选药物中潜在致敏组分，避免单靶标细胞膜色谱柱筛选带来的假阴性，对药物的安全性评价具有重要意义。ige-r和mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱的制备，包含以下操作：

1)ige-r与mrgprx2细胞膜固定相的制备

rbl-2h3细胞高表达ige受体，lad2细胞高表达mrgprx2受体，本发明选取rbl-2h3和lad2细胞制备ige-r和mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱。分别选取对数生长期的rbl-2h3细胞和lad2细胞，对细胞进行计数，当每种细胞数目不低于10⁷时，应用0.25％胰蛋白酶将贴壁生长的rbl-2h3和lad2细胞分别消化下来，并置于不同的离心管中，于4℃条件下1000g分别离心10min，去除上清的培养液，分别沉淀rbl-2h3和lad2细胞，加入生理盐水重新混悬后于4℃条件下1000g离心10min，洗去细胞表面残留的培养基，生理盐水清洗过程重复2次。之后向得到的两种细胞中分别加入5ml50mm的tris-hcl溶液，置于细胞超声破碎仪。将细胞膜和细胞器的悬液于1000g4℃条件下离心，此时取离心管中上清液于12000g4℃条件下离心10min，沉淀即为细胞膜，沉淀用生理盐水重悬，并再次于12000g4℃条件下离心20min，将得到的细胞膜清洗1次。最后分别将得到的细胞膜沉淀用5ml的生理盐水混悬，并将细胞膜悬液在真空条件下分别加入到0.05g已预先活化的大孔硅胶内，置于磁力搅拌器上于4℃条件搅拌30min，保证细胞膜与硅胶充分混匀后静置过夜，利用细胞膜的流动性及大孔硅胶的吸附作用，使细胞膜与大孔硅胶充分包裹，得到rbl-2h3细胞膜固定相和lad2细胞膜固定相。第二日将两种固定相混合得到rbl-2h3和lad2混合固定相。

2)ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱制备

将得到的rbl-2h3和lad2混合细胞膜色谱固定相混合后利用rpl-zd10装柱机湿法装入10mm(l)×3.0mm(i.d.)的柱芯中，即得ige-r与mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱。

3)ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱的效果验证

本发明选取选择性作用于ige-r的化合物槲皮素及选择性作用于mrgprx2的化合物环丙沙星用于验证ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱。

槲皮素对照溶液的配制：取槲皮素标准品约0.0100g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10ml，得约1mg/ml的槲皮素储备溶液。

环丙沙星对照溶液的配制：取环丙沙星标准品约0.0100g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10ml，得约1mg/ml的环丙沙星储备溶液。

槲皮素和环丙沙星混合对照溶液的配制：分别精密吸取1ml上述配制的槲皮素和环丙沙星置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，得浓度分别为0.1mg/ml的混合对照溶液。

色谱条件：

液相：lc-2030c-3d高效液相色谱仪

流动相：10mmol/l的pbs缓冲液

流速：0.2ml/min

色谱柱：ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱

ige-r细胞膜色谱柱

mrgprx2细胞膜色谱柱

样品：槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液

柱温：37℃

检测波长：254nm

检测结果如图1所示：其中a为槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液在ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱上的色谱图，槲皮素和环丙沙星均能在双靶标细胞膜色谱柱上保留；b为槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液在ige-r细胞膜色谱柱上的色谱图，仅槲皮素在ige-r细胞膜色谱柱上保留；c为槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液在mrgprx2细胞膜色谱柱上的色谱图，仅环丙沙星在mrgprx2细胞膜色谱柱上保留。

上述结果表明本发明所制备的双靶标细胞膜色谱柱能够同时识别两种受体的配体，提高筛选效率。ige-r&mrgprx2双靶标细胞膜色谱柱用于药物致敏组分识别时能够避免单靶标细胞膜色谱柱造成的假阴性，显著提高了致敏组分的筛选效率和筛出率。

实施例2

酪氨酸激酶家族中的egfr和fgfr4是抗血管生成剂的靶受体，通过阻断其磷酸化过程而抑制瘤血管生成。本发明制备egfr和fgfr4双靶标细胞膜色谱柱，用于中药等复杂体系中抗血管生成抑制剂的筛选，同时对egfr和fgfr4的配体进行筛选显著提高了筛选效率，与此同时也有助于发现同时作用于egfr和fgfr4的目标组分，对于多元药物的开发具有重要意义。egfr和fgfr4双靶标细胞膜色谱柱的制备，包含以下操作：

1)egfr与fgfr4双靶标细胞膜色谱柱的制备

实验室前期利用基因工程技术分别构建了egfr受体高表达的hek293细胞和fgfr4受体高表达的hek293细胞，本发明选取egfr和fgfr4受体高表达的两种hek293细胞制备egfr和fgfr4双靶标细胞膜色谱柱。egfr与fgfr4细胞膜固定相及双靶标细胞膜色谱柱的制备与前述ige-r与mrgprx2细胞膜固定相及双靶标细胞膜色谱柱的制备完全相同，仅用egfr和fgfr4受体高表达的两种hek293细胞代替rbl-2h3和lad2细胞。

2)egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱的效果验证

本发明选取选择性作用于egfr的化合物吉非替尼及选择性作用于fgfr4的化合物pd173074用于验证egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱。

吉非替尼对照溶液的配制：取吉非替尼标准品约0.0100g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10ml，得约1mg/ml的吉非替尼储备溶液。

pd17304对照溶液的配制：取pd17304标准品约0.0100g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10ml，得约1mg/ml的pd17304储备溶液。

吉非替尼和pd17304混合对照溶液的配制：分别精密吸取1ml上述配制的吉非替尼和pd17304置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，得浓度分别为0.1mg/ml的混合对照溶液。

色谱条件基本与ige-r和mrgprx2双靶标细胞膜色谱相同：

色谱柱：egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱

egfr细胞膜色谱柱

fgfr4细胞膜色谱柱

样品：吉非替尼和pd17304混合对照溶液

检测结果：吉非替尼和pd17304的混合对照溶液在egfr&fgfr4均有保留；吉非替尼仅在egfr细胞膜色谱柱上保留；pd17304仅在mrgprx2细胞膜色谱柱上保留。上述结果表明egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱用于筛选目标组分时能同时识别两种受体的配体，提高筛选效率和筛出率。

3)筛选结果的验证

利用egfr&fgfr4双靶标细胞膜色谱柱从中药中筛选发现新型酪氨酸酶抑制剂，从丹参超临界提取物中发现保留组分，如图2所示，保留组分r1&r2。经鉴定保留组分为丹酚酸c，丹参酮i，丹参酮iia，隐丹参酮。将筛选出的成分分别进行mtt分析，对于egfr和fgfr4高表达hek293细胞的ic50值如表1所示.吉非替尼和隐丹参酮对于egfr受体高表达细胞抑制率高，选择性作用于egfr；pd17304和丹参酮iia对fgfr4的抑制率高，选择性作用于fgfr4；丹酚酸c和丹参酮i对于egfr和fgfr4受体的抑制作用相近，表明丹酚酸c和丹参酮i能够同时作用于egfr和fgfr4。表明双靶标细胞膜色谱柱不但能识别“单组分单靶标”的目标组分，还能够识别“单组分双靶标”及“多组分双靶标”目标组分，对于多元药物的开发意义重大。

表1：丹参超临界提取物中的保留组分对egfr和fgfr4受提高表达细胞抑制作用的ic50值

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。