安神宝颗粒的多成分含量测定方法与流程

本发明属于中药制剂质量控制领域，涉及一种安神宝颗粒的多成分含量测定方法。
背景技术：
：安神宝颗粒补肾益精，养心安神。用于失眠健忘，眩晕耳鸣，腰膝酸软。是用于治疗失眠健忘的草本植物组方中成药,剂型为颗粒剂。本品精选邢台地区的酸枣仁与枸杞、北合欢，组方科学、配伍合理。本制剂现行的检测方法为安神宝制剂采用薄层鉴别、正丁醇提取物来进行质量控制，已经不符合现阶段药品检验技术的发展。随着我国药品生产质量控制水平的提高，国家食品药品监督管理局提出“国家药品标准提高行动计划”，以全面提升药品的质量控制水平。因此，建立一种能快速、准确、全面控制安神宝颗粒质量的方法，实现对它物质群的全面控制，具有重要的意义。枸杞的主要化学成分有枸杞多糖(LBP)、枸杞黄酮、甜菜碱(betaine)、类胡萝卜素及类胡萝卜素酯、维生素C、莨菪亭(scopoletin)、多种氨基酸及微量元素K、Na、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、P等成分[11]。此外，尚从枸杞中分离得到环肽(Cyclicpeptides)及枸杞素A—D[12]、脑甙脂类[13]等。其中，枸杞多糖为枸杞主要活性成分，具有增强免疫作用；甜菜碱、玉蜀黍黄素及玉蜀黍黄素二棕榈酸、脑甙脂类对四氯化碳引起的肝损害有保护作用；枸杞素A和B有抑制血管紧张肽转化酶的活性[1。酸枣仁含生物碱：酸枣仁碱(sanjoinine)A、B、D、E、F、G1、G2、Ia、Ib、K，还含酸枣仁环肽(sanjoinenine)。还含三萜类：白桦脂酸(betulinicacid)，白桦脂醇(betulin)，美洲茶酸(ceanothicacid)，麦珠子酸(alphitolicacid)，酸枣皂甙(jujuboside)A、B，以及胡萝卜甙(daucosterol)。又含黄酮类：斯皮诺素(spinosin)，酸枣黄素(zivulgarin)，6”'-芥子酰斯皮诺素(6”'-sinapoylspinosin)，6”'-阿魏酰斯皮诺素(6”'-feruloylspinosin)，6”'-对香豆酰斯皮诺素(6”'-p-coumaroylspinosin)，当药素(swer-tisin)，6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素(viceninⅡ)，芹菜素-6-C-[(6-O-对羟基苯甲酰)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖甙[apigenin-6-C-[(6-O-p-hydroxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside]等。还含苏氨酸(threonine)，缬氨酸(valine)，蛋氨酸(methionine)，亮氨酸(leucine)，异亮氨酸(isoleucine)，赖氨酸(lysine)，苯丙氨酸(phenylalanine)等17种氨基酸和钾、钠、钙、锌、铁、铜、锰等多种金属元素。又含阿魏酸(ferulicacid)，维生素C及植物甾醇，环磷酸腺苷(cyclicadenosine3',5'-monophosphate)等。藤合欢，养心安神；和血止痛。主心悸失眠；健忘多梦；牙痛；筋骨痛；腰腿麻木；跌打伤痛。主要化学成分为黄酮类化合物，如槲皮素、芦丁等。药品检验方法的选择，应根据"准确、灵敏、简便、快速"的原则，要强调方法的适用性，并注意吸收国内科研成果和国外先进经验；既要考虑当前国内实际条件，又要反应新技术的应用发展，进一步完善和提高检测水平。技术实现要素：本发明是为了提供一种安神宝颗粒的多成分含量测定方法。本发明针对安神宝颗粒现行质量标准未进行含量控制，提出了安神宝颗粒同时进行多成分的含量测定，将酸枣仁中具有安神功效的主要成分：酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，枸杞中具有确切镇静功效的成分：东莨菪内酯；藤合欢主要成分槲皮素作为含量测定参数，使安神宝颗粒的质量标准更具有整体性、特征性、和稳定性，并且对仪器、色谱柱、检测器、检测波长、色谱流动相、柱温进行了反复研究、优化，通过多指标成分的定量控制，能够综合反映安神宝颗粒的内在质量，提升制剂的质量控制水平，保证制剂多批次制剂的质量稳定一致性。本发明所述的多成分含量测定方法是在同一色谱条件下，同时对安神宝颗粒中所含的酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯、槲皮素三种化学成分进行液相色谱含量测定。本发明所述的多成分含量测定方法由以下步骤组成：一、色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱温：柱温35℃检测：蒸发光散射检测器进样量：10μl流动相梯度洗脱表：流动相：A为甲醇，B为0.5％冰醋酸二、对照品溶液的制备：分别精密称取酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯、槲皮素对照品适量，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液1.0ml置于同一个20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。三、供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，称定重量，加热回流6小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置烧瓶中，浓缩至约lml，加3mol/L盐酸溶液l0ml，水浴中加热水解2小时，立即冷却，移人分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，并入分液漏斗中，加氯化钠2g，用三氯甲烷强力振摇提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠2g，搅拌，滤过，容器用少量三氯甲烷洗涤，滤过，滤液合并，70℃以下浓缩至近干，立即加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。四、测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。本发明所述的多成分含量测定方法研究是经过大量筛选试验得到的最佳方案，以下试验研究为本发明的优选过程，色谱条件与系统适应性试验：安神宝颗粒配方为酸枣仁、枸杞、藤合欢，其中，酸枣仁中主要成分为酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，枸杞主要成分为甜菜碱、东莨菪内酯，藤合欢主要成分为黄酮类成分，槲皮素、山奈酚等，为了减少试验操作，提高检测的效率，我们针对主要成分进行了研究，力图同时测定上述主要成分。酸枣仁皂苷类成分的化学研究和含量测定报道较多，归纳起来主要的分析方法有比色法、薄层扫描法和高效液相色谱法，其中以高效液相色谱法测定较为准确，但由于酸枣仁皂苷A和B的紫外吸收很弱，因此，用常规的HPLC-UV方法虽有文献报道，但检测灵敏度很低。反相高效液相色谱——蒸发光散射检测法(RP-HPLC-ELSD)是近年来常用的适合于没有紫外吸收成分的检测方法，同时对于有紫外吸收的成分同样可以适用。甜菜碱含量测定有分光光度法、薄层扫描法、非水滴定法和高效液相色谱法等。高效液相色谱法作为一种现代分离分析技术，已逐渐应用于中药化学成分的分离分析和含量测定，在植物甜菜碱含量测定方面的应用也日益广泛，但由于甜菜碱结构中无共轭体系，仅能用折射仪检测或在低紫外吸收波长(190～220nm)测定，条件要求较高，且灵敏度或选择性均不够理想。因此，一般采用的高效液相色谱法都是对甜菜碱提取物进行柱前衍生后测定的，此法破坏了甜菜碱提取物的原始成分。Young等[31]报道采用NH2柱未经衍生可直接测定北方枸杞甜菜碱的含量，方法快速、简便东莨菪内酯不溶于水，在甲醇中溶解。通用方法是用乙醇提取出东莨菪苷，采用酸水解，再提取东莨菪内酯进行检测，一般检测波长为298nm。槲皮素的检测波长大致在256nm，通常采用甲醇提取进行检测。1、检测波长的研究确定综合几个主要成分的紫外检测波长各不相同，并且紫外检测背景干扰比较大，为了更好同时适用多个成分的检测，我们采用蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)，对紫外吸收没有要求，适用于大多数的成分检测。2、流动相的研究对照品溶液的配制：分别精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素对照品适量，加甲醇溶液分别配制成1.0mg/mL的溶液，作为对照品溶液。首先采用以下流动相进行预实验，色谱柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ，柱温35℃，流速1.0ml/min，蒸发光散射检测器检测,结果如下：①流动相为：0.5％冰醋酸-甲醇(32：68)，分别进样酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素对照品对照品溶液，检出酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、槲皮素，东莨菪内酯及槲皮素出峰时间过早无法分离。②流动相为：水-甲醇-乙酸(45:50:5)，分别进样酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素对照品对照品溶液，检出酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、槲皮素，槲皮素出峰时间过早无法分离，枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B出峰时间过长，峰形不符合要求。③流动相为：甲醇-水-冰醋酸(32:68:0.16)，分别进样酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素对照品对照品溶液，检出槲皮素、其他峰形不符合要求。根据以上试验结果，同时检测多成分需要进行梯度洗脱，分离各类成分。3、流动相梯度洗脱研究对照品溶液制备：分别精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素对照品适量，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液1.0ml置于同一个20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。①预实验：流动相：A为甲醇，B为0.5％冰醋酸时间流动相A％流动相B％02987496121882152080222377323268423562509010梯度洗脱峰的存在时因为流动相比例在变化过程中有一个临界比例，达到那个比例的时候流动相的吸收值就会出现较大的变化，干扰样品的检测，几个对照品的出峰均产生干扰。我们尝试改变梯度斜率来让它改变位置和峰型。②调整梯度系统梯度系统改为渐变系统，减少流动相吸收值的突然变化对对照品出峰的干扰。时间流动相A％流动相B％0-52-1098-905-15109015-2510-2090-8025-35208035-4520-3080-7045-5030-3570-6550-709010峰形改善，其中酸枣仁皂苷A、槲皮素峰形良好，酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱出峰时间处于流动相梯度改变区间，达不到基线分离。继续调整流动相各区间的梯度。图2③确定梯度系统时间流动相A％流动相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5030-4570-5550-60455560-809010峰形改善，峰形改善，酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、东莨菪内酯、甜菜碱、槲皮素出峰时间均处于流动相配比稳定区间，达到基线分离。图34、供试品溶液制备研究梯度系统用对照品进行研究，由于样品中杂质众多，样品精制方法决定了杂质是否对待测成分产生干扰，我们进行了供试品溶液精制方法研究。①精密秤取样品2g至10ml的容量瓶中，超声提取20min，放至室温，用甲醇定容，充分摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，作为供试品溶液1。②精密秤取样品2g于索氏提取器中，加50ml石油醚，水浴加热提取2小时，弃取石油醚，再用50ml甲醇索氏提取3小时，收集甲醇提取液，回收甲醇并定量转移至10ml的容量瓶中，用甲醇定容，充分摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，作为供试品溶液2。③取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，称定重量，加热回流6小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置烧瓶中，浓缩至约lml，加3mol/L盐酸溶液l0ml，水浴中加热水解2小时，立即冷却，移人分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，并入分液漏斗中，加氯化钠2g，用三氯甲烷强力振摇提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠2g，搅拌，滤过，容器用少量三氯甲烷洗涤，滤过，滤液合并，70℃以下浓缩至近干，立即加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液3。色谱条件：流动相：流动相：A为甲醇，B为0.5％冰醋酸，流速1ml/min，蒸发光散射检测器，进样量10μl。梯度洗脱：时间流动相A％流动相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5030-4570-5550-60455560-809010结果：供试品溶液1由于无除杂步骤，杂质峰对待测峰产生严重干扰。供试品溶液2除杂不完全，杂质峰仍有干扰。供试品溶液3由于加入水解除杂步骤，甜菜碱无出峰，槲皮素、酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯出峰良好，无干扰，酸枣仁皂苷B出峰与杂质峰部分重叠，达不到分离。调整梯度系统，增加30％A流动相的冲洗时间。结果如上：甜菜碱无出峰，槲皮素、酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯出峰良好，无干扰，酸枣仁皂苷B出峰与杂质峰部分重叠，达不到分离。综上所述，安神宝颗粒多成分检测方法确定为：一、色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱温：柱温35℃检测：蒸发光散射检测器进样量：10μ流动相梯度洗脱表：流动相：A为甲醇，B为0.5％冰醋酸时间流动相A％流动相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5530-4570-5555-65455565-809010二、对照品溶液的制备：分别精密称取酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯、槲皮素对照品适量，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液1.0ml置于同一个20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。三、供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，称定重量，加热回流6小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置烧瓶中，浓缩至约lml，加3mol/L盐酸溶液l0ml，水浴中加热水解2小时，立即冷却，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，并入分液漏斗中，加氯化钠2g，用三氯甲烷强力振摇提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠2g，搅拌，滤过，容器用少量三氯甲烷洗涤，滤过，滤液合并，70℃以下浓缩至近干，立即加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。四、测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。图4附图说明图1：预实验一液相色谱图图2：预实验二液相色谱图图3：预实验三液相色谱图图4：确定实验条件液相色谱图具体实施方式下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。实施例1：安神宝颗粒中所含的酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯、槲皮素三种化合物的高效液相色谱含量测定。一、色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱温：柱温35℃检测：蒸发光散射检测器进样量：10μ流动相梯度洗脱表：流动相：A为甲醇，B为0.5％冰醋酸时间流动相A％流动相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5530-4570-5555-65455565-809010二、对照品溶液的制备：分别精密称取酸枣仁皂苷A、东莨菪内酯、槲皮素对照品适量，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液1.0ml置于同一个20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。三、供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，称定重量，加热回流6小时，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置烧瓶中，浓缩至约lml，加3mol/L盐酸溶液l0ml，水浴中加热水解2小时，立即冷却，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，并入分液漏斗中，加氯化钠2g，用三氯甲烷强力振摇提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加无水硫酸钠2g，搅拌，滤过，容器用少量三氯甲烷洗涤，滤过，滤液合并，70℃以下浓缩至近干，立即加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。四、测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。当前第1页1 2 3