本发明涉及真菌毒素免疫层析时间分辨荧光试剂盒，具体涉及一种同步检测黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒、制备方法及其应用。
背景技术：
：真菌毒素是一类毒性很强的化学物质，是丝状真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物。真菌毒素广泛污染玉米、小麦、大米、花生等谷类作物和油料作物、饲料等多种农产品食品。黄曲霉毒素b1是由黄曲霉菌和寄生曲霉等产生的一类有毒的次生代谢产物，具有高度毒性和高致癌、致畸、致突变性的特性，对人类和动物危害极大。赭曲霉毒素a主要产生于曲霉属和青霉属一些产毒菌株，其毒性位居7种赭曲霉毒素(a、b、c、d等7种)之首，在自然界分布最广泛，对农产品的污染也最严重，是严重危害人类健康的真菌毒素之一；赭曲霉毒素a在食物中较稳定且不易分解，在霉变谷物、饲料等中最常见，现已被证明具有诱变性、免疫毒性，能引起免疫抑制，并具有致癌、致畸、致突变作用。玉米赤霉烯酮是由多种镰刀菌产生的一种非类固醇结构的真菌毒素，是我国饲料原料和全价饲料中超标率和检出水平最高的真菌毒素之一，对繁殖机能有毒害作用，还具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性，且对肿瘤的发生有显著相关性。伏马毒素b1主要产生于串珠镰孢、多育镰孢、轮状镰孢和其他镰孢菌，具有强神经毒性、肝毒性和致癌致畸性等，其毒性机理主要来源于伏马毒素b1对神经鞘脂类合成破坏和氧化应激。而我国小农户分散型的种植方式导致农产品中真菌毒素发生率高，且同一农产品真菌毒素混合污染的可能性大，因此迫切需要能快速、同步检测真菌毒素混合污染的检测技术，以实现对粮食及饲料中真菌毒素混合污染的同步、快速监测。现有对这些真菌毒素的检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法检测真菌毒素是最早研究建立的真菌毒素分析方法，主要用于真菌毒素定性分析，难以定量，检测试剂用量大、操作繁琐、并由于其它组分干扰严重导致准确性差，不能准确定量，对实验人员和周围环境污染危害较大。精密仪器分析法包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱及串联质谱联用法等方法，具有准确、灵敏等优点，但样品前处理过程复杂，检测时间长，所使用的仪器昂贵，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测。免疫分析方法克服了薄层层析法和仪器分析法的缺点，由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析试纸条由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，近年来在真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测上得到了广泛应用。但是由于灵敏度低、无法进行定量检测，在现场快速检测中无法满足快速定量检测的需求。而我国小农户分散型的种植方式导致农产品中真菌毒素发生率高，且混合污染的风险性更大，因此迫切需要能快速、同步检测多种真菌毒素混合污染的检测技术，以实现对粮食及饲料中真菌毒素混合污染的同步、快速监测。技术实现要素：本发明所要解决的问题是提供一种能同步检测黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒、制备方法及其应用。该免疫层析时间分辨荧光试剂盒可用于黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：同步检测黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶；其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括pvc衬底，衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和四条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述四条检测线上分别包被黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物，所述的伏马毒素b1单克隆抗体为由保藏编号为cctccno.c201636的杂交瘤细胞株fm7a11分泌产生的单克隆抗体；所述的杂交瘤细胞株fm7a11已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno.c201636。按上述方案，所述铕标记的单克隆抗体是按照以下方法制备得到：铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体：将黄曲霉毒素b1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体；1ml活化后的铕标记试剂可偶联黄曲霉毒素b1单克隆抗体：30μg-80μg。铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体：将赭曲霉毒素a单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体；1ml活化后的铕标记试剂可偶联赭曲霉毒素a单克隆抗体：40μg-90μg。铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合，振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体；1ml活化后的铕标记试剂可偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体：30μg-90μg。铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体：将伏马毒素b1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合，振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体；1ml活化后的铕标记试剂可偶联伏马毒素b1单克隆抗体：30μg-80μg。按上述方案，所述的活化方法为取铕标记试剂，用ph8.20.2mol/l的硼酸缓冲液中超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清液，用ph8.20.2mol/l的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15-30min。上述配制好的铕标记的单克隆抗体复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01mol/lph7.4的磷酸缓冲液中备用，使用时，取一定用量各铕标记的单克隆抗体放入样品反应瓶中，置于冷冻干燥机中冻干，得到各铕标记的单克隆抗体冻干品，备用。按上述方案，所述荧光试纸条中的吸水垫长10-16mm，宽3-5mm；检测垫长25-30mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽3-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为5-10mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为3-5mm；所述的样品反应瓶为1-2.5ml的西林瓶。按上述方案，所述包被黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为50-250ng；包被赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-300ng；包被伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为50-150ng，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50-150ng；所述样品反应瓶中铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg。按上述方案，所述的黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01％-0.30％的吐温-20水溶液。按上述方案，所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备：将黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物配制成浓度为0.10-0.50mg/ml的包被液，用线喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到4条检测线，然后于37-40℃条件下干燥60-120分钟；将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.5mg/ml的包被液，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，然后于37-40℃条件下干燥60-120分钟；(3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得荧光试纸条；按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物包被液、赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物包被液、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物包被液、伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10ml中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10ml中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100ml中含有卵清蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g，0.5g吐温-20(tween20％)；上述免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线(t)荧光强度与质控线(c)荧光强度的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线荧光强度的比值(t/c)分别与黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1的含量；按上述方案，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(t/c)分别与黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：(1)配制得到系列梯度浓度的黄曲霉毒素b1、伏马毒素b1、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮标准溶液；(2)将适量上述各梯度的黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6-10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线(t)和质控线(c)的荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线荧光强度的比值(t/c)；(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(t/c)与黄曲霉毒素b1、伏马毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮的关系曲线。本发明的有益效果：(1)快速、同步定量检测黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮和伏马毒素b1。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒能在一条试纸条上实现对黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮和伏马毒素b1的同步、快速定量检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、灵敏度高，各真菌毒素的检测之间无干扰，简单、快速。(2)灵敏度高。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒对检测溶液中黄曲霉毒素b1的最低检测限为0.06ng/ml，赭曲霉毒素a的最低检测限为0.5ng/ml，玉米赤霉烯酮的最低检测限为1ng/ml，伏马毒素b1的最低检测限为0.2ng/ml，该检测限能满足欧盟对食品中这4种真菌毒素的限量要求。附图说明图1为本发明提供的黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒中免疫层析时间分辨荧光试纸条的结构示意图。图中：1吸水垫、2检测垫、3样品垫、4质控线、5黄曲霉毒素b1检测线、6赭曲霉毒素a检测线、7玉米赤霉烯酮检测线、8伏马毒素b1检测线。具体实施方式实施例1黄曲霉毒素b1单克隆抗体的获得黄曲霉毒素b1单克隆抗体由保藏编号为cctccno.c201014的杂交瘤细胞株3g1分泌产生，具体根据授权号为zl201210117614.9的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株3g1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的balb/c小鼠，收集小鼠的腹水，纯化处理后获得黄曲霉毒素b1单克隆抗体。其中，纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μl，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/l和ph值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节该混合液的ph值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/ml，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/l磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的黄曲霉毒素b1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141ml醋酸加水定容至100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100ml所得；实施例2赭曲霉毒素a单克隆抗体的获得；赭曲霉毒素a单克隆抗体由保藏编号为cctccno.c201329的杂交瘤细胞株1h2分泌产生，具体根据申请号为201310115921.8的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株1h2注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的balb/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得赭曲霉毒素a单克隆抗体。所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μl，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/l和ph值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节该混合液的ph值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/ml，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的赭曲霉毒素a单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100ml所得；实施例3玉米赤霉烯酮单克隆抗体的获得玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为cctccno.c201328的杂交瘤细胞株2d3分泌产生，具体根据申请号为201310115825.3的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株2d3注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的balb/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μl，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节该混合液的ph值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/ml，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100ml所得；实施例4伏马毒素b1单克隆抗体的获得杂交瘤细胞株fm7a11的筛选1.抗原合成及动物免疫购买市售的伏马毒素b1标准品进行完全抗原合成，具体合成步骤如下:将2mg的fb1标准品粉末与2mg的edc分别溶于500μl的0.01mol/lpbs溶液，得到edc溶液和fb1溶液，将4mg/ml(溶液为0.01mol/lpbs)的edc溶液逐滴加入溶解好的fb1溶液中，室温下轻轻搅拌10分钟。将5mg/ml(溶液为0.01mol/lpbs)的bsa溶液逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌反应4小时。透析3天。最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明fb1-bsa完全抗原制备成功。购买6周龄balb/c小鼠6只，免疫实验室合成的伏马毒素完全抗原fb1-bsa。第一次免疫将伏马毒素完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的伏马毒素完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三次与第四次免疫分别与上一次免疫间隔两周，免疫方式与第二次相同。四次免疫剂量相同，仅为100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接elisa法监测小鼠血清效价，并用间接竞争elisa法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前量的2倍。2.细胞融合于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即peg(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死待融合小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞sp2/0以5：1的个数比混合，用rpmi-1640基础培养液洗混合细胞，1200rpm，离心5min。弃去上清，控干，加入1mlpeg，融合1分钟，缓慢加入rpmi-1640基础培养液，离心，弃上清，沉淀即为融合细胞，用20ml完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80ml半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，2ml/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1％hat的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)rpmi-1640基础培养液，1％(重量百分数)l-谷氨酰胺，1％(体积百分数)hepes，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(hfcs)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即hat和甲基纤维素购于sigma-aldrich公司。3.细胞株的筛选及克隆待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用hat液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接elisa方法，筛选出抗伏马毒素而不抗载体蛋白bsa的阳性孔；第二步采用间接竞争elisa法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用伏马毒素b1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦ic50值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株fm7a11。抗伏马毒素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株fm7a11抗体可变区序列测定(1)提取总rna：采用天根公司的总rna提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株fm7a11的总rna；(2)合成cdna：以步骤1获得的总rna为模板，oligo(dt)15为引物，按照superscripttm-2ii反转录酶说明书进行反转录，合成cdna第一链；引物oligo(dt)15由invitrogen购得；(3)pcr法克隆可变区基因：根据genbank中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cdna为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。pcr程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收dna片段，连接在载体pmd18-t中，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-caggtsmarctgmaggagtcwg-3’(22mer)和5’-caggggccagtggatagacagatggggg-3’(28mer),其中s、m、r和w为兼并碱基，m＝a/c，r＝a/g，s＝g/c，w＝a/t，轻链可变区引物为5’-gacatcaagatgacccagtctcca-3’(24mer)和5’-ccgttttatttccagcttggtccc-3’(24mer)。得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长379bp，序列如seqidno:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由126个氨基酸组成，序列如seqidno:3所示。轻链可变区编码基因序列长348bp,序列如seqidno:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由116个氨基酸组成，序列如seqidno:4所示。5.抗伏马毒素b1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定将实施例1获得的抗伏马毒素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株fm7a11注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的balb/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μl，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/l和ph为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/l的氢氧化钠溶液调节该混合液的ph至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/ml，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/l、ph为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/lpbs透析两天，再改用pb透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗伏马毒素b1单克隆抗体；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100ml所得。用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株fm7a11分泌的抗伏马毒素b1单克隆抗体的亚型为igg2b。用常规非竞争酶联免疫吸附法(elisa)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到3.2×105，即抗体稀释3.2×105倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争elisa测定其对伏马毒素b1灵敏度为0.32ng/ml。对伏马毒素b2、b3的交叉反应率为4.3％和12.8％。与黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素的交叉反应率均小于0.1％。实施例5取200μl铕标记荧光微球，加入1ml0.2mol/lph8.2的硼酸缓冲液中，300w超声处理40秒，然后缓慢加入40ul15mg/ml的碳二亚胺，室温振荡20min后，17000g离心15分钟，收集沉淀，用0.2mol/lph8.2的硼酸缓冲液复溶，将活化的荧光微球复溶于5ml0.01mol/lph8.2的硼酸缓冲液中，加入1mg/ml抗体(黄曲霉毒素b1单克隆抗体35ul、赭曲霉毒素a单克隆抗体45ul、玉米赤霉烯酮单克隆抗体55ul、伏马毒素b1单克隆抗体40ul)，4℃振荡反应12h后，17000g离心10分钟，含1％bsa的0.2mol/lph8.2的硼酸缓冲液复溶，4℃振荡反应4h，17000g离心10min收集沉淀，复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.2mol/lph8.2的硼酸缓冲液中，即得铕标记的真菌毒素抗体，置于4℃保存备用。同步检测黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染同步检测的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染同步检测免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒，它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条、含有铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体冻干品、铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体冻干品、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品、铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括pvc衬底，pvc衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm；(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁成长16mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被：将黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.25mg/ml的溶液，于距硝酸纤维素膜上沿10mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线i，每厘米检测线i上所需黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100ng；将赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物(ota-bsa)用包被缓冲液配制成0.35mg/ml的包被液，于距检测线i4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线ii，每厘米检测线ii上所需赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物的包被量为160ng；将玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.4mg/ml的包被液，于距检测线ii4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线iii，每厘米检测线iii上所需玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng；将伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.25mg/ml的包被液，于距检测线iii4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线iv，每厘米检测线iv上所需伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为150ng；然后于37℃条件下干燥120分钟；质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.30mg/ml的包被液；于距检测线i5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为90ng，然后于40℃条件下干燥120分钟；所述的包被缓冲液为：将1mg兔抗鼠多克隆抗体，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至10ml所得；所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。(3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长12mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于40℃条件下干燥4小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；所述的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100ml所得；(4)荧光试纸条的组装：在pvc衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得；见图1。所述的样品反应瓶的获得：将上述配制好的复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01mol/lph7.4的磷酸缓冲液中的铕标记的黄曲霉毒素b1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素a单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的伏马毒素b1单克隆抗体，各取一定量放入样品反应瓶中，置于冷冻干燥机中冻干，得到铕标记的单克隆抗体冻干品，备用。所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.25μg，铕标记的抗赭曲霉毒素a单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg，铕标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，铕标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg。所述黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染同步检测免疫层析时间分辨荧光检测试剂盒在样品黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1检测中的应用：取经确认的阴性饲料样品20g加入100ml70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2分钟，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1ml，加入5ml样品稀释液稀释滤液，混匀，得到空白基质溶液；用空白基质溶液配置黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1分别对应为以下浓度梯度的黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合标准溶液6个，黄曲霉毒素b1(0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml)、伏马毒素b1(0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml)、赭曲霉毒素a(0ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml)、玉米赤霉烯酮(0ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml)。标准溶液每个浓度点重复5次，用多毒素检测试纸条进行检测：将上述标准品溶液150μl加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：615nm)，读取检测区域的荧光信号强度值，计算5次重复平均值。以标准系列浓度值自然对数(lnc)和t线的荧光信号强度值/c线的荧光信号强度值(t/c)绘制标准曲线，标准曲线公式如y＝a*lnc+b，5种检测对象的标准曲线参数如下表所示：abr2检测限/ng/ml黄曲霉毒素b1-1.4253.5240.9910.06伏马毒素b1-1.7503.4480.9890.2赭曲霉毒素a-1.5944.7880.9890.5玉米赤霉烯酮-1.7505.7510.9791取待检饲料样品20g加入100ml70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2分钟，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1ml，加入5ml样品稀释液稀释滤液，混匀；取待检饲料样品检测液150μl加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测获得各荧光试纸条4条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(t/c)，然后将其分别代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(t/c)与黄曲霉毒素b1浓度、赭曲霉毒素a浓度、玉米赤霉烯酮浓度、伏马毒素b1浓度的关系曲线，得该样品中的黄曲霉毒素b1含量为5.4μg/kg、赭曲霉毒素含量为0μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为0μg/kg、赭曲霉毒素含量为0μg/kg。实施例6与实施例5不同的是：免疫层析时间分辨荧光试纸条中吸水垫长14mm，宽3mm；检测垫长30mm，宽3mm；样品垫长16mm，宽3mm，相邻各垫的交叠长度为2mm；所述荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为10mm，每相邻两条检测线之间的间距为3.5mm。所述包被黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为125ng；包被赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的赭曲霉毒素a-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为250ng；包被伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为150ng，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为75ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，铕标记的抗赭曲霉毒素a单克隆抗体冻干品的含量为0.25μg，铕标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，铕标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体冻干品的含量为0.23μg。所述黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1混合污染同步检测免疫层析时间分辨荧光检测试剂盒在样品黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、伏马毒素b1检测中的应用：取经高效液相色谱法确认的含多毒素的玉米样品(黄曲霉毒素b1含量为3.5μg/kg、赭曲霉毒素含量为2.6μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为42μg/kg、伏马毒素b1含量为8.1μg/kg)，取25g加入100ml70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2分钟，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1ml，加入4ml样品稀释液稀释滤液，混匀；取待检玉米样品检测液150μl加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测获得各荧光试纸条4条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(t/c)，然后将其分别代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(t/c)与黄曲霉毒素b1浓度、赭曲霉毒素a浓度、玉米赤霉烯酮浓度、伏马毒素b1浓度的关系曲线，得该样品中的黄曲霉毒素b1含量为3.2μg/kg、赭曲霉毒素含量为2.5μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为45μg/kg、伏马毒素b1含量为8.5μg/kg。序列表＜110＞中国农业科学院油料作物研究所＜120＞同步检测伏马毒素b1等四种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用＜160＞4＜210＞1＜211＞379bp＜212＞dna＜213＞小鼠＜400＞1caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagag50cctgtccatcacttgcactgtctctgggctttcattaaccagctatggtg100tacactgggttcgtcaggccccaggaaagggtctggagtggctgggagta150atttggggtggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagact200gagcatcagcaaagacaactccaggagccaagttttcttaagaatgaaca250gtctgcaaattgatgacacagccatgtactattgtgccagaggcaggatg300gactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgtcagccaaaacgac350acccccatctgtctatccactggcccctg379＜210＞1＜211＞348bp＜212＞dna＜213＞小鼠＜400＞2gacatcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctaggaga50aagagtcactatcacttgcaaggcgagtcaggacattagtagctatttag100gctggttacagcagaaaccagggaaatctcctaagaccctgatctatcgt150gcaaacacattggtagaaggggtcccatccagattcagtggcagtggatc200tggggaagattattctctcaccatcagcagcctggagtatgaagatatgg250gaatttattattgtctacagtatgatgagtttccgtacacgttcggaggg300gggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc348＜210＞1＜211＞126＜212＞prt＜213＞小鼠＜400＞3glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaproser15glnserleuserilethrcysthrvalserglyleuserleuthr30sertyrglyvalhistrpvalargglnalaproglylysglyleu45glutrpleuglyvaliletrpglyglyglyasnthrasntyrasn60seralaleumetserargleuserileserlysaspasnserarg75serglnvalpheleuargmetasnserleuglnileaspaspthr90alamettyrtyrcysalaargglyargmetasptyrtrpglygln105glythrservalthrvalserseralalysthrthrproproser120valtyrproleualapro126＜210＞1＜211＞116＜212＞prt＜213＞小鼠＜400＞4aspilelysmetthrglnserprosersermettyralaserleu15glygluargvalthrilethrcyslysalaserglnaspileser30sertyrleuglytrpleuglnglnlysproglylysserprolys45thrleuiletyrargalaasnthrleuvalgluglyvalproser60argpheserglyserglyserglygluasptyrserleuthrile75serserleuglutyrgluaspmetglyiletyrtyrcysleugln90tyraspglupheprotyrthrpheglyglyglythrlysleuglu105ilelysargalaaspalaalaprothrvalser116当前第1页12