一种ASE‑HPLC法测定山楂中金丝桃苷含量的方法与流程
本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定山楂中金丝桃苷含量的方法。
背景技术：
山楂叶为蔷薇科植物山里红(crataeguspinnatifidabge.varmajorn.e.br.)，具有活血化瘀，理气通脉，用于气滞血瘀，胸闷憋气，心悸见忘，眩晕耳鸣。
研究结果表明山楂中金丝桃苷是已经被证实治疗心血管疾病，并有解痉镇痛，保护胃黏膜、肝组织及调节血脂，增强免疫力，抗抑郁及对心脑缺血的保护作用。
2015年版药典记载的提取及测定山楂中金丝桃苷的方法为：本品细粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约4小时)，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。在15000r/min下离心3min，取上清液，进入lc测定。
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用三氯甲烷除杂后，采用甲醇索提至无色，杂质较少。而三氯甲烷毒性较大；另外，按照药典方法进行，耗时至少需4小时。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明旨在提供一种毒性小、耗时短的ase-hplc法测定山楂中金丝桃苷含量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定山楂中金丝桃苷含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ase法萃取山楂粉末，所述的ase萃取法包括先用正己烷萃取，再用乙醇萃取，并收集乙醇萃取液；
步骤2：采用hplc法检测山楂中的金丝桃苷含量。
其中，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤s1：将山楂样品粉碎，取1g与1g石英砂混合；
步骤s2：在放有滤膜的ase萃取池中添加1g硅藻土，加入步骤s1所得的混合物，加石英砂至与池口下2mm处；
步骤s3：先用正己烷除杂，再用乙醇萃取，得提取液；
步骤s4：用乙醇将提取液定容至50ml，离心，取上清液，得乙醇萃取液。
其中，步骤s3所述的除杂步骤的参数为：压力为1500psi，温度为80℃，时间为5min，次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。
其中，步骤s3所述的萃取步骤的参数为：压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为1次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。
其中，步骤s4所述的离心步骤的参数为离心速度为15000r/min、离心时间为3min。
其中，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisc18；柱温为40℃，流速为0.5ml/min；流动相为乙腈-0.2％磷酸；检测波长为363nm。
其中，所述的色谱柱的规格为3*100mm，3μm。
其中，所述的流动相的乙腈-0.2％磷酸的体积比为24:76。
本发明与传统方法相比，具有下述优点：
1.本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用三氯甲烷除杂后，采用甲醇索提至无色，杂质较少。而三氯甲烷毒性较大，故采用极性相对较接近的正己烷作为除杂溶剂，甲醇、作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示正己烷除杂，甲醇提取后金丝桃苷含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂；
2.在除杂过程中，药典方法加入三氯甲烷索提取液无色，时间相对较长，且三氯甲烷毒性较大，我们采用了多次萃取除杂的方式，发现80℃，提取5min，2次即可达到除去大部分杂质，再多的提取时间和次数已经无明显影响，而相对高的温度对提取效果影响不大，故最终确定最佳除杂工艺组合为提取温度80℃，提取时间5min，提取次数2次；提取过程中采用110℃，提取5min，提取1次即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响；最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数1次。
附图说明
图1为金丝桃苷对照品的色谱图；
图2为药典方法提取山楂叶中金丝桃苷的色谱图；
图3为ase法萃取山楂叶中金丝桃苷的色谱图；
图4为金丝桃苷对照品以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
实施例1
1、仪器设备及试剂
1.1仪器：
电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪。
1.2试剂：试剂与溶液(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)
水：符合gb/t6682规定的一级水；
正己烷(c6h14)：分析纯；
乙醇(c2h6o)：分析纯；
乙腈(c2h3n)：色谱纯(液相色谱用)；
磷酸(h3p04)：分析纯；
石英砂：粒径约2mm。
2、方法
2.1对照品溶液的制备
取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含34.20ug的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
2.2.12015年版药典方法
本品细粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约4小时)，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。在15000r/min下离心3min，取上清液，进入lc测定。
2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法
样品经粉碎机粉碎，过三号筛，约1.0g，精密称定，与1g石英砂混合均匀，待用，在预先放好过滤膜的
2.3ase萃取条件
所述的除杂步骤的参数为：压力为1500psi，温度为80℃，时间为5min，次数为2次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。
所述的萃取步骤的参数为：压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为1次，冲洗体积为100％，吹扫时间为100s。
2.4色谱条件与系统适用性试验
所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisc18，3*100mm，3μm；柱温为40℃，流速为0.5ml/min；流动相为乙腈-0.2％磷酸；检测波长为363nm。
其中，所述的流动相的乙腈-0.2％磷酸的体积比为24:76以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于3000。
2.5测定法
照高效液相色谱法(通则0512)测定；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图1为金丝桃苷对照品的色谱图；图2为药典方法提取山楂叶中金丝桃苷的色谱图；图3为ase法萃取山楂叶中金丝桃苷的色谱图，其中，金丝桃苷的保留时间为13.647min。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算，含金丝桃苷(c21h20o12)不得少于0.050％。
2.7、计算(外标法)
式中cr——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；
ax——供试品的峰面积；
ar——对照品峰面积。
注意：
使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；
萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；
萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；
开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；
使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3结果
3.1线性关系
取金丝桃苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷34.20ug的溶液，然后分别精密吸取该溶液0.5μl、1μl、2μl、5μl、8μl进入lc测定，并依照上述方法测定，结果详见表1。
以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝2,092.56039x-0.08287,r2＝0.99997。金丝桃苷在0.0171～0.2736μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图4--金丝桃苷对照品以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归图。
表1线性试验结果
3.2重现性试验
取相同批号的样品1.0g，共4份，精密称定，按ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中金丝桃苷的含量见表2，rsd为3.9％，试验表明ase提取方法重复性良好。
表2重现性试验结果
3.3样品采用药典方法与ase方法测定含量的结果(1批)
表3可以看出采用ase仪器1、ase仪器2和药典方法提取后的结果以及ase仪器之间的重复性均良好。
表3样品采用药典方法与ase方法测定含量的结果对比
4讨论：
4.1ase提取溶剂的选择：
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用三氯甲烷除杂后，采用甲醇索提至无色，杂质较少。而三氯甲烷毒性较大，故采用极性相对较接近的正己烷作为除杂溶剂，甲醇、作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示正己烷除杂，甲醇提取后金丝桃苷含量与2015年版《中国药典》含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。
4.2ase提取条件的优化
在除杂过程中，药典方法加入三氯甲烷索提取液无色，时间相对较长，且三氯甲烷毒性较大，我们采用了多次萃取除杂的方式，发现80℃，提取5min，2次即可达到除去大部分杂质，再多的提取时间和次数已经无明显影响，而相对高的温度对提取效果影响不大，故最终确定最佳除杂工艺组合为提取温度80℃，提取时间5min，提取次数2次。提取过程中采用110℃。提取5min，提取1次即可达到与药典含量接近，更多的提取时间、温度、次数对结果已经无明显影响。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数1次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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