本发明涉及生物技术领域，尤其涉及maldi-tof-ms在鉴定宋内志贺菌中的应用。
背景技术：
宋内志贺菌属于志贺菌属的d群，是引起胃肠道感染的主要病原菌之一，老人、儿童和免疫功能低下的患者中多发。发达国家流行的主要是宋内志贺菌，而发展中国家虽然长期以来流行的为福氏志贺菌。但近年来宋内志贺菌呈明显增加的趋势，并成为优势菌群。目前，大多数实验室鉴定宋内志贺菌的方法主要通过生化代谢反应和血清凝集来完成，一般都需要16-18小时。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization-timeofflightmassspectrometry，maldi-tof-ms)技术的是近年来发展起来的一种新型的软电离技术，主要通过分析细菌的核糖体蛋白对细菌进行区分鉴定，具有速度快、通量高、鉴定准、范围广的特点，在很多欧洲国家质谱仪已成功运用于临床微生物实验室的诊断，在食品安全和环境监测的应用也很广泛。
由于宋内志贺菌和大肠埃希菌种族关系相近，它在biotyper数据库中被认为是大肠埃希菌种系的一部分，其数据库中并没有宋内志贺菌的鉴定谱图，这无疑为使用maldi-tof-ms鉴定腹泻病原菌造成了困难。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种鉴定宋内志贺菌的成套设备。
本发明提供的成套设备，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂和可读载体；
所述可读载体记载如下：
若待测菌株经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测得到的蛋白峰符合如下条件：含有质量电荷比分别为5612.81±8.7、4871.12±45.9、4164.03±26和3247.05±6.9这四个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为宋内志贺菌；
若不符合所述条件，则待测菌株不为或候选不为宋内志贺菌。
上述的成套设备中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂包括标准品bts和基质α-氰基-4-对羟基肉桂酸。
上述的成套设备中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
上述成套设备在鉴定宋内志贺菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备在制备鉴定宋内志贺菌产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备在区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备在制备区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述成套设备中的所述可读载体在鉴定宋内志贺菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备中的所述可读载体在制备鉴定宋内志贺菌产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备中的所述可读载体在区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备中的所述可读载体在制备区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述成套设备中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂和可读载体在鉴定宋内志贺菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂和可读载体在制备鉴定宋内志贺菌产品中的应用；
或上述成套设备中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂和可读载体在区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述成套设备中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测仪器、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测试剂和可读载体在制备区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述其他细菌为大肠杆菌。
本发明另一个目的是提供一种鉴定待测菌是否为宋内志贺菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：提取待测菌的蛋白，再用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测所述待测菌的蛋白，得到待测菌的蛋白峰谱图；若待测菌的蛋白峰谱图符合如下条件：含有质量电荷比分别为5612.81±8.7、4871.12±45.9、4164.03±26和3247.05±6.9这四个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为宋内志贺菌；若不符合所述条件，则待测菌株不为或候选不为宋内志贺菌质量电荷比分别为。9、一种区分待测菌株为宋内志贺菌还是其他细菌的方法，包括如下步骤：提取待测菌的蛋白，再用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测所述待测菌的蛋白；若待测菌的蛋白峰谱图符合如下条件：含有质量电荷比分别为5612.81±8.7、4871.12±45.9、4164.03±26和3247.05±6.9这四个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为宋内志贺菌；若不符合所述条件，则待测菌株不为或候选不为其他细菌质量电荷比分别为。
上述方法中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方式如下：采用氮基光源、线性阳离子检测模式，延迟时间为130纳秒(ns)，脉冲高压1500v，激光强度为40％，激光频率60hz，每个样本设激光随机射击100个点，每次射击5次，m/z的采集范围为2000-20000da；
或，所述其他细菌为大肠杆菌。
本发明成功建立了宋内志贺菌的质谱数据库，即发明了质谱仪鉴定宋内志贺菌的质谱鉴定新方法。本发明实验证明，本发明成功建立了宋内志贺菌质谱数据库，发现maldi-tof-ms检测宋内志贺菌特异峰4个，质量电荷比分别为5269.62±1108.53，4631.59±966.18，3999.02±834.95，3240.49±770.87，作为保守峰，可以作为宋内志贺菌鉴定的特异性生物标记来区分宋内志贺菌和大肠埃希菌等其他细菌。进一步，通过200株宋内志贺菌的验证，均能与大肠埃希菌区别开，具有100％的特异性和准确性。本发明实现了maldi-tof-ms对宋内志贺菌的准确鉴定，缩短了鉴定时间，可以使传统鉴定时间从16-18小时缩短为3-5分钟，也使传统的繁琐鉴定流程得以改善，为临床腹泻病原菌的快速诊断提供了有力的依据，实现早发现、早治疗，更好的服务于临床。
附图说明
图1为宋内志贺菌的蛋白质图谱。
具体实施方式
菌株：24株建库的宋内志贺菌包括标准菌株atcc29930和nctc12984及临床分离株22株，均用梅里埃的vitek-2全自动细菌鉴定仪、生化反应和血清凝集试验及16srrna确认，200例宋内志贺菌验证株为临床分离已经鉴定的宋内志贺菌株。
材料：分纯细菌用的m-h培养基购自天坛生物制品有限公司；宋内志贺菌诊断血清购自宁波天润生物制品有限公司；质谱鉴定用的甲酸、乙腈、三氟乙酸、无水乙醇、bts标准品、基质α-氰基-4-对羟基肉桂酸、msp96孔靶板购于德国bruker公司；聚合酶链反应(pcr)扩增试剂盒购自takara公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(maldi-tof-ms)购于德国bruker公司。vitek-2全自动微生物鉴定仪购于法国梅里埃公司。
实施例1、maldi-tof-ms鉴定宋内志贺菌的标准峰和方法
1、宋内志贺菌总蛋白的获得
1)菌株纯化
选取24株建库的宋内志贺菌，，在m-h培养基上分纯后待用。
2)固定灭活
在1.5ml的eppendorf管中加入300μl纯净水，用无菌牙签挑取5mg菌落样品加入eppendorf管中，仔细混匀后再加入900μl无水乙醇，再次混匀后高速(20000r/min)离心2min，弃去上清。
3)蛋白溶出
在弃去上清的eppendorf管中加入50μl70％的甲酸，仔细混匀，再加入50μl纯乙腈，仔细混匀，高速(20000r/min)离心2min，吸取上清，即得到总蛋白样本，用于点靶。
2、maldi-tof-ms鉴定
1)基质和bts标准品配制
在基质和bts标准品中分别加入200μl和100μl的标准溶液，超声震荡混匀，-20℃保存备用。
标准溶液由体积百分含量为50％的乙腈、体积百分含量为2.5％的三氟乙酸和体积百分含量为47.5％的超纯水组成的混合溶液。
2)点靶
先点1μl上述1的3)获得的上清(总蛋白样本)，放干后再点1μl基质。每个相同的菌液在靶位上排列4个点，bts标准品1μl放在96孔靶的任一位置，放干后再点1μl基质，干燥后上机。
3)仪器参数设定：采用氮基光源、线性阳离子检测模式，延迟时间为130纳秒(ns)，脉冲高压1500v，激光强度为40％，激光频率60hz，每个样本设激光随机射击100个点，每次射击5次，m/z的采集范围为2000-20000da。，保存参数
4)采集数据
放入已点好样品和校准品的靶板。打开flexcontrol，校准仪器，选择数据采集方法，按照已设定的仪器参数，用鼠标点击start按钮，采集标准品数据进行仪器校准。然后编辑自动采集方法(autoxecutemethod)，用鼠标点击start按钮，采集宋内志贺菌的样品数据，每个菌株采集20张谱图并保存。
重复试验获得同样的结果。
5)建立数据库分析结果
将上述2获得的采集好的24株宋内志贺菌的480张谱图数据打开后，点击createmsp，将谱图调入d：\date\shd的根目录下，完成数据库的建立。
宋内志贺菌和大肠埃希菌的主要蛋白峰信息如表1和图1所示，其中**标记的4个峰为宋内志贺菌的特征峰(图1箭头所指)。
表1宋内志贺菌和大肠埃希菌主要蛋白峰信息表
注：m/z：质量电荷比mass/chargesn：信噪比signal/noiseintens：峰强度area：峰面积**为特异峰标注。
经过比对，可以看出，宋内志贺菌区别于其他细菌的特征蛋白峰为质量电荷比分别为5269.62±1108.53，4631.59±966.18，3999.02±834.95，3240.49±770.87的四个峰。
因此可以用上述4个特征蛋白峰确定待测菌株是否为宋内志贺菌，具体如下：
若待测菌株经过maldi-tof-ms检测得到的蛋白峰中含有质量电荷比分别为5612.81±8.7，4871.12±45.9，4164.03±26，3247.05±6.9的全部四个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为宋内志贺菌；
若不含有全部4个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为其他细菌。
实施例2、maldi-tof-ms鉴定宋内志贺菌的准确度验证
1、总蛋白获得：
将200株已经鉴定的宋内志贺菌和100株大肠埃希菌分别按照上述实施例1的1的方法提取法获得总蛋白。
2、maldi-tof-ms鉴定
1)基质和bts标准品配制：与实施例1的2相同；
2)点靶：采用立即点靶上机。
3)仪器参数设定：与实施例1的3相同；
4)采集数据：与实施例1相同，每个菌株累计500个点，得到200株宋内志贺菌的蛋白峰图谱和200株大肠杆菌的蛋白峰图谱。
5)、分析结果
若待测菌株经过maldi-tof-ms检测得到的蛋白峰中含有质量电荷比分别为5612.81±8.7，4871.12±45.9，4164.03±26，3247.05±6.9的全部四个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为宋内志贺菌；
若不含有全部4个特征蛋白峰，则待测菌株为或候选为其他细菌。
200株宋内志贺菌全部蛋白峰图谱中含有质量电荷比分别为5612.81±8.7，4871.12±45.9，4164.03±26，3247.05±6.9的4种特征蛋白峰，本发明的方法判断为宋内志贺菌，因此本发明方法的鉴定准确率为100％。
100株大肠杆菌的蛋白峰图谱中不全部含有质量电荷比分别为5612.81±8.7，4871.12±45.9，4164.03±26，3247.05±6.9的4种特征蛋白峰，与宋内志贺菌有效区分，特异性100％。
结果表明，本发明的方法成功建立了宋内志贺菌的质谱库，可以用来准确鉴定宋内志贺菌。