一种同时测定穿心莲内酯多种有关物质的方法与流程

本发明涉及分析化学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种同时测定穿心莲内酯中多种有关物质的方法。

背景技术：

穿心莲内酯(andrographolide)系自爵床科穿心莲属植物穿心莲中提取得到的二萜内酯类化合物，具有清热解毒、凉血消肿等功能。现已上市的或处于开发阶段的制剂主要有穿心莲内酯片剂、胶囊、注射剂等。穿心莲內酯是以穿心莲叶为原料，采用不同的提取工艺制备得到的制剂原料药。由于其酯类结构，在水溶液中，特别是高温、强碱性环境中，易水解、开环、异构化和树脂化。穿心莲内酯原料药及其制剂中除主要成分穿心莲内酯外，一般同时存在新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯等二萜内酯类杂质。这些化合物有些是在提取过程中引入的，也有通过降解或内部转化而成。这些杂质可能会影响穿心莲内酯的药效，严重可能导致不良反应，这对于药品的安全性、有效性、质量可控性都是极为不利的。因此，准确测定穿心莲内酯原料及其制剂中有关物质的含量，是评价穿心莲内酯原料药及其制剂质量的重要指标。

目前，对于穿心莲内酯有关物质检测方法的研究较少。文献“穿心莲药材及其制剂中6个内酯类成分的含量分析(药物分析杂志，邓贵华，林朝展，祝晨蔯，2011(2):231-235.)”提供了一种检测穿心莲多种成分的方法，但该法洗脱梯度程序较多，且检测指标仅限于內酯类杂质的检测，且检测时间较长；专利“一种穿心莲内酯有关物质的测定方法”(cn102809625b)，采用了水-乙腈-甲醇三元体系，体系较为复杂，操作繁琐，且其检测的也只是新穿心莲內酯、去氧穿心莲內酯和脱水穿心莲內酯等內酯类分子结构，但是对于其他含量较低但可能影响产品质量安全的其他杂质，没有证据表明也可以同时检测。文献“一测多评法测定穿心莲中5个内酯类成分的含量(《中药材》，王欢，林朝展，吴润菁，祝晨蔯，第37卷第3期2014年3月，448-451)”提供了一测多评法同时测定穿心莲药材中5个內酯类成分的含量的方法，但是经发明人检验，该法在检测穿心莲內酯碱破坏样品时，不能将各有关物质进行有效分离进而进行含量检测。正如上文所述，穿心莲內酯中除了含有各內酯类的杂质外，还有其他如开环、异构化、树脂化的杂质，因此，目前技术仍缺少一种简便、灵敏、高效的穿心莲内酯有关物质的测定方法，能够快速准确且全面地测定及评价穿心莲内酯原料、以及相关制剂制备及稳定性试验期间的有关物质含量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种更为简便、灵敏高效的测定穿心莲内酯多种有关物质的方法，以能够快速、准确地、全面的同时测定穿心莲内酯原料药及其制剂中有关物质含量。

为实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种采用高效液相色谱法同时测定穿心莲內酯多种有关物质的方法，该法采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流动相a是水，流动相b是乙腈；进行梯度洗脱，梯度条件为：梯度1流动相的体积比为：a：b＝75～80％：25～20％，进样15～20min后流动相变化为梯度2，梯度2流动相的体积比为：a：b＝65～70％：35～30％，总运行时间为45～55min；检测波长220～230nm，柱温为30～35℃；洗脱流速为0.5～2.0ml/min。

在一些实施方案中，梯度1流动相优选的体积比为：a：b＝77：23。

在一些实施方案中，梯度2流动相优选的体积比为：a：b＝70：30。

在一些实施方案中，检测波长优选224nm。

在一些实施方案中，洗脱流速优选1.0ml/min。

在一些实施方案中，进样样品检测过程中，样品进样量为10～15μl。

在一些实施方案中，所述总运行时间45～55min后，再在梯度1条件下运行10～15min。

在一些实施方案中，所述色谱柱填料粒径为2～5μm；颗粒平均直径为4.6mm。

在一些实施方案中，所述色谱柱的填料粒径为3μm。

在一些实施方案中，在穿心莲内酯对照品及待测样品的配制过程中，选用良溶剂对穿心莲内酯进行溶解，所述良溶剂是对穿心莲内酯原料，制剂及对照品溶解性较好的且与体系相容的溶剂，是甲醇或乙腈，或二者混合物，优选为甲醇。

本发明提到的测定方法，其洗脱流速设定为一般技术人员公知的常识，常见的范围一般为0.5ml/min至2ml/min，本发明优选0.9～1.1ml/min，更优选1.0ml/min。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

(1)采用水-乙腈二元体系，两段洗脱，更简便，更高效。

(2)本发明采用破坏程度较大的碱破坏穿心莲内酯作为供试品进行色谱条件的筛选，除穿心莲内酯外，可以同时检测9种有关物质，且各有关物质之间的分离度均可大于1.5，因此本发明的适用范围更广。

附图说明

图1为穿心莲内酯对照品经强碱破坏(破坏程度6％)后的hplc色谱图；

图2为穿心莲内酯对照品经强碱破坏(破坏程度47％)后的hplc色谱图；

图3为穿心莲内酯对照品经强酸破坏后的hplc色谱图；

图4为穿心莲内酯对照品经强碱破坏后，实施例4色谱条件下有关物质检测hplc色谱图；

图5为穿心莲内酯对照品经强碱破坏后，实施例5色谱条件下有关物质检测hplc色谱图；

图6为0.001mg/ml穿心莲内酯原料药甲醇溶液的hplc色谱图；

图7为1mg/ml穿心莲内酯原料药甲醇溶液的hplc色谱图。

图8为文献“一测多评法测定穿心莲中5个内酯类成分的含量”中色谱条件的尝试；

图9为文献“穿心莲药材及其制剂中6个内酯类成分的含量分析”中色谱条件的尝试。

具体实施方案

下述是结合具体实施例进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。

下述实施例中，所述穿心莲内酯原料药来自四川省玉鑫药业有限公司，纯度大于99.0％。穿心莲内酯对照品购于中国食品药品检定研究院，纯度98.7％。

下述实施例中，检测采用的仪器设备为：agilent1260infinity高效液相色谱仪(g1362a)(美国安捷伦公司)；dad检测器(美国安捷伦公司)。

实施例1穿心莲内酯对照品经强碱破坏(破坏程度6％)后，其有关物质的检测试验

(1)取穿心莲内酯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于65℃水浴放置15min后用0.01mol/l的hcl调节至中性以作为碱破坏待测溶液。

(2)采用hplc测定(1)步骤中的碱破坏溶液，色谱条件如下：色谱柱为thermoc18(150mm×4.6mm，3μm，热电公司)；检测波长为224nm；柱温为30℃，流速为1.0ml/min；进样量为10μl。以水(a)-乙腈(b)为流动相，进行梯度洗脱。梯度1流动相的体积比为：a：b＝77％：23％，进样20min后流动相变化为梯度2；梯度2流动相的体积比为：a：b＝70％：30％。总运行时间为50min，后运行15min。记录色谱图，见图1。

在图1中，保留时间为12.716min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰。结果显示，碱破坏样品的液相色谱中，降解产物间的分离度均大于1.5，穿心莲内酯降解程度约为6％。

表1穿心莲内酯对照品经强碱破坏(破坏程度6％)后hplc色谱图参数

实施例2穿心莲内酯对照品经强碱破坏(破坏程度47％)后，其有关物质的检测试验

取穿心莲内酯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于70℃水浴放置1h后用0.01mol/l的hcl调节至中性以作为碱破坏待测溶液。

除上述条件改变其他色谱条件及具体步骤同实施例1。结果见图2。

图2中，保留时间为12.714min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰。结果显示，碱破坏样品的液相色谱中，降解产物间的分离度均大于1.5，穿心莲内酯降解率约为47％。结果表明，增大破坏强度，各降解产物仍然能得到很好的分离。

表2穿心莲内酯原料药经强碱破坏(破坏程度47％)后hplc色谱图参数

实施例3穿心莲内酯对照品经强酸破坏后，其有关物质的检测试验

(1)取穿心莲内酯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/l稀盐酸0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于75℃水浴放置1h后用0.01mol/l的naoh调节至中性以作为酸破坏待测溶液。

除上述条件改变其他色谱条件及具体步骤同实施例1。结果见图3。

图3中，保留时间为12.771min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰。结果显示，酸破坏样品的液相色谱中，降解产物间的分离度均大于1.5，穿心莲内酯降解率约为5％。

表3穿心莲内酯原料药经强酸破坏后hplc色谱图参数

实施例4穿心莲内酯对照品经强碱破坏后，不同色谱条件下有关物质检测试验

由于强碱破坏试验中产生的杂质种类比酸破坏种类多，故以强碱破化穿心莲内酯原料药在不同的色谱条件下进行有关物质检测试验。

(1)取穿心莲内酯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于65℃水浴放置30min后用0.01mol/l的hcl调节至中性以作为碱破坏待测溶液。

(2)采用hplc测定(1)步骤中的供试品溶液，色谱条件如下：检测波长为230nm；柱温为35℃流速为1ml/min；进样量为15μl。以水(a)-乙腈(b)为流动相，进行梯度洗脱。梯度1流动相的体积比为：a：b＝80％：20％，进样20min后流动相变化为梯度2；梯度2流动相的体积比为：a：b＝65％：35％。总运行时间为45min，后运行10min。

图4中，保留时间为13.248min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰，降解产物间的分离度均大于1.5，穿心莲内酯降解率约为12％。

表4穿心莲内酯原料药经强碱破坏后，不同色谱条件下检测hplc色谱图参数

实施例5穿心莲内酯对照品经强碱破坏后，不同色谱条件下有关物质检测试验

由于强碱破坏试验中产生的杂质种类比对照品种类多，故以强碱破化穿心莲内酯原料药在不同的色谱条件下进行有关物质检测试验。

(1)取穿心莲内酯原料约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于65℃水浴放置30min后用0.01mol/l的hcl调节至中性以作为碱破坏待测溶液。

(2)采用hplc测定(1)步骤中的碱破坏溶液，色谱条件如下：检测波长为220nm；柱温为30℃流速为1.0ml·min^-1；进样量为15μl。以水(a)-乙腈(b)为流动相，进行梯度洗脱。梯度1流动相的体积比为：a：b＝75％：25％，进样20min后流动相变化为梯度2；梯度2流动相的体积比为：a：b＝70％：30％。总运行时间为55min，后运行10min。

图5中，保留时间为11.653min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰，降解产物间的分离度均大于1.5，穿心莲内酯降解率约为12％。

表5穿心莲内酯原料药经强碱破坏后，不同色谱条件下检测hplc色谱图参数

实施例6穿心莲内酯原料药其有关物质合格度检测

(1)称取穿心莲内酯原料药，加甲醇配制成穿心莲内酯含量为0.001mg/ml的对照溶液；称取穿心莲内酯原料，加甲醇配制成供试品溶液，所述供试品溶液中穿心莲内酯含量为对照溶液中穿心莲内酯含量的1000倍。

(2)采用hplc分别测定(1)步骤中的对照品溶液和供试品溶液，色谱条件及具体步骤同实施例1。结果见图6及图7。

图6中，保留时间为12.805min的色谱峰为穿心莲内酯色谱峰，其峰面积为26.51258。图7中，供试品溶液中单个杂质峰的面积均小于对照品溶液色谱图中穿心莲内酯峰面积。穿心莲内酯原料药杂质表观含量在0.1％以下，无需进行杂质结构确证。

对比例1

采用文献“一测多评法测定穿心莲中5个内酯类成分的含量”的色谱条件进行碱破坏有关物质检查。

(1)取穿心莲内酯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分装于西林瓶中2ml，压盖。置于65℃水浴放置40min后用0.01mol/l的hcl调节至中性以作为碱破坏待测溶液。

(2)采用hplc测定(1)步骤中的碱破坏溶液，色谱条件如下：色谱柱：thermoc18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为226nm；柱温为25℃流速为0.8ml/min；进样量为10μl。以水(a)-乙腈(b)为流动相，进行梯度洗脱。0～15min，a：b＝90％：10％；15～25min，a：b＝75％：25％；25～40min，a：b＝60％：40％；40～50min，a：b＝60％：40％；50～70min，a：b＝20％：80％。hplc色谱图见图8。

图8中，保留时间为23.640min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰，出峰时间较晚，且杂质峰明显分离不好。因此此文献方法不适用于穿心莲内酯有关物质检查。

对比例2

采用文献“穿心莲药材及其制剂中6个内酯类成分的含量分析”的色谱条件进行碱破坏有关物质检查。

(1)碱破坏待测溶液配制同对比例1。

(2)采用hplc测定(1)步骤中的供试品溶液，色谱条件如下：色谱柱：thermoc18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为226nm；柱温为25℃；流速为1.0ml·min^-1；进样量为10μl。以水(a)-乙腈(b)为流动相，进行梯度洗脱。0～10min，a：b＝70％：30％；10～20min，a：b＝60％：40％；20～25min，a：b＝60％：40％；25～40min，a：b＝50％：50％；40～70min，a：b＝35％：65％。hplc色谱图见图9。

图9中，保留时间为8.600min色谱峰为穿心莲内酯色谱峰，杂质峰23.986min、24.873min、25.260min色谱峰分离度均小于1.5。因此此文献方法不适用于穿心莲内酯有关物质检查。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。