一种高效双光子纳米诊疗剂的制备及其应用的制作方法

本发明属于纳米生物医学成像技术领域，主要涉及到一种具有良好生物相容性的高效双光子荧光探针的制备及其在双光子敏化动力学治疗中的应用。

背景技术：

卟吩和金属卟吩是天然存在的叶绿素和血红素等多种卟啉类四吡咯化合物的结构骨架，是生命存在的赖以物质。卟吩类分子通常具有良好的生物相容性，同时在光电转换过程中扮演着重要角色。作为大环有机分子的家族成员，卟吩类分子可作为基本分子，通过π-π堆积，氢键及范德华力等的作用，实现超分子间自组装，并可获得多种形貌的纳米晶。从基本分子到组装后的纳米晶，材料的光电学性能随之变化，新的性能也层出不穷，进而拓宽了卟吩类分子的具体应用。锌5,10,15,20-四(4-吡啶基)-21h，23h，卟吩(zntpyp)作为良好的光激活分子基体，可用于组装构筑不同形貌及尺寸的微米/纳米金属-有机框架材料(zntpyp-mof)，用于各类光电反应的进行。事实上，无论光催化反应还是光动力学治疗过程，光生电子对于反应的进行至关重要。然而，目前少有研究将重点置于该类组装材料电子的有效生成和利用，zntpyp-mof丰富的光电性能尚未充分挖掘。

多光子吸收过程是指，在强激光作用下，材料同时吸收多个光子，用以激活电子。与传统的单光子过程相比，长波长的多光子激光具有较高的组织穿透深度，且双光子吸收的发生主要在脉冲激光器所产生的超强激光的焦点处，因此，双光子过程具有良好的空间选择性，对样品伤害较小，可获得较高分辨率的成像效果，实现对原位疾病的光学诊断与治疗。随着研究的发展，目前有机类染料(fitc，dapi，二碘曙红)及无机纳米材料(金纳米棒，碳量子点，zns)，在多光子吸收方面的潜力逐渐得以揭示。有机类双光子吸收染料通常具有较高的量子产率，但染料分子的输水性质，细胞毒性及在体内极端环境下的易荧光淬灭等限制了其在生物中的应用。无机非线性双光子吸收纳米材料，通常具有稳定的化学结构且易于表面修饰，比较适用于生物类研究。但无机材料的光学性质通常较为单一，这对实际研究而言，颇有限制。zntpyp-mof包覆共催化剂tio2，得到zntpyp-mof@tio2(zmt)，在保留了zntpyp-mof双光子吸收及高量子荧光产率的同时，高效结合了tio2无机材料易修饰及催化性能优良的优势，最终利用zntpyp-mof的双光子吸收特性，实现了对细胞的高分辨的双光子荧光成像及双光敏化tio2动力学治疗。

综上所述，制备合适的有机/无机复合体，构建一种能够充分发挥各机体优点且具有良好生物相容性的zmt是至关重要的，它对双光子驱动下的荧光成像及tio2敏化动力学治意义重大。

技术实现要素：

本发明的目的是合成一种生物相容性好的兼具高效的双光子荧光及双光敏化动力学治疗性能的有机/无机异质纳米晶。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种新颖高效的双光子荧光及双光敏化动力学治疗性能的有机/无机异质纳米晶，是以zntpyp-mof组装颗粒为基础，由其提供双光子吸收及染料激活性能。tio2的包裹能够保证整个颗粒的亲水性及生物安全性，此外，联合zntpyp-mof内核共同作用，将内核激发电子导入外层tio2导带，用以增强电子活性，协同致力于活性氧的产生。

所述纳米双光子生物晶体的制备方法，是首先采用酸碱中和方法，在表面活性剂胶束内组装制备zntpyp-mof纳米晶；然后，通过钛源水解反应，在zntpyp-mof表面均匀包裹一层水溶性好，催化性能高的非晶tio2；最后，再通过静电吸附的作用，在tio2外层包覆一层具有良好生物相容性的多聚赖氨酸(pll)，最终获得具有良好生物安全性的有机/无机异质纳米晶。

采用分子自组装方法制备金属-有机框架纳米材料的工艺，包括如下具体步骤：将zntpyp溶于2毫摩尔/升(mm)的盐酸溶液中，zntpyp分子质子化得到zntpyp-h4⁴⁺，将其加入naoh与ctab的混合溶液，zntpyp-h4⁴⁺遇碱去质子化，输水的zntpyp进入ctab胶束内，通过zn-n键合作用，自组得到zntpyp-mof纳米晶。乙醇清洗2～3次，去掉纳米晶表面活性剂。

所述zntpyp遇h⁺质子化，调整zntpyp与h⁺摩尔比，以充分将zntpyp质子化为zntpyp-h4⁴⁺，以得到完全溶解的zntpyp-h4⁴⁺前驱体。

所述zntpyp-h4⁴⁺加入ctab的naoh溶液，体系搅拌约5分钟，zntpyp-h4⁴⁺与oh^-已经充分中和，组装过程完成，需立马离心收集产物。

所述反应组装溶液的ph、ctab的浓度及组装时间可显著影响产物的形貌及尺寸，须严格控制。

所述组装后的产物zntpyp-mof利用乙醇反复清洗，去除表面活性剂，离心清洗后分散于乙醇中备用。

采用ctab辅助下的钛源水解工艺，在zntpyp-mof纳米颗粒外表面生长一层无定型tio2，包括如下步骤：zntpyp-mof溶解分散于0.2mmctab的naoh水溶液中；再将二异丙氧基双乙酰丙酮钛(tdaa)与甲醇按1:100体积稀释，少量逐批次加入zntpyp-mof溶液中，缓慢搅拌以使tdaa在zntpyp-mof表面缓慢水解生长tio2，乙醇清洗2～3次，去掉纳米晶表面活性剂。

所述ctab辅助生长合成的zntpyp-mof@tio2(缩写为zmt)颗粒具有良好的水溶性和分散性。

所述zmt颗粒中tio2的成功包覆，需在ctab浓度约为0.2mm，ph约为10的溶液中方可实现，过高浓度的ctab将阻碍tio2的表面生长，过低浓度的ctab则会导致zntpyp-mof内核的软聚集，从而影响最终产物的形貌。

所述组装后的产物zmt利用乙醇反复清洗，去除表面活性剂，离心清洗后分散于水中备用。

采用静电吸附方式，在zmt纳米颗粒外表面修饰一层生物相容性良好的pll。包括如下步骤：将zmt的水溶液加入pll的pbs溶液，缓慢搅拌20分钟，水洗收集pll修饰后的纳米颗粒。

所述pll溶液体系是由pll与nacl混溶于pbs缓冲液中而成，并且保持温度在4度。

所述zmt颗粒加入pll体系后，缓慢搅拌20分钟，水洗2～3次，获得pll均匀包覆，分散性良好的zmt@pll。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中有机卟吩分子组装内核zntpyp-mof可以提供吸收近红外双光子激光，用来发射荧光，其光毒性很小，主要是其激发电子与氧气作用产生的少量单线态氧。

(2)本发明表面包覆tio2后，zntpyp-mof双光子激发下产生的电子，可高效注入表面tio2，用以增强电子活性，从而还原周围氧气为超氧阴离子，细胞毒性急剧增强，二者协同可实现对深组织原位肿瘤的双光敏化动力学治疗。

(3)本发明广泛用于各种疾病尤其是癌症的荧光诊断及光动力治疗，这在临床应用中具有非常重要意义。

附图说明

图1为实施例1制得纳米颗粒的透射(tem)和扫描电镜(sem)照片；

图2为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒在pll修饰前后的水合动力学尺寸(dls)的对比图；

图3为实施例1制得的zntpyp单体分子，zntpyp-mof及zmt纳米颗粒的吸收光谱图。

图4为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒在500nm可见光照射下的活性氧检测结果图。

图5为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒通过“清道夫实验”检测活性氧成分的检测结果图。

图6为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒在808nm激光照射下的活性氧检测结果图。

图7为实施例1制得的zntpyp，zntpyp-mof，zmt单光子及双光子激光荧光光谱图。

图8为为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒在830nm双光子激发下的荧光图。

图9为为实施例1制得的zmt纳米颗粒在不同双光强度的平方值与发射荧光强度的线性关系图。

图10为实施例1制得的zmt纳米颗粒在细胞内不同层面上的双光子荧光。

图11为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒在细胞内，利用同步光刺激方法，监测细胞在830nm双光子照射下的活性氧变化图。

图12为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒及单纯的tio2对在不同离子浓度时，对细胞存活率的影响(mtt法)。

图13为实施例1制得的zntpyp-mof和zmt纳米颗粒及单纯的tio2在相同离子浓度下，830nm双光子飞秒激光器照射后的细胞存活率(mtt法)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

图1a为pll包覆的zmt的具体制备流程图

一、zntpyp-mof疏水纳米颗粒的制备：

1.zntpyp-h4⁴⁺的准备：zntpyp溶于0.2mol/l的盐酸溶液中，得到0.01mol/l的zntpyp溶液。

2.ctab胶束溶液的准备：ctab溶于10mmol/l的naoh溶液中，得到2mmol/l的ctab溶液。

3.量取0.5ml的zntpyp溶液快速加入9.5mlctab溶液，缓慢搅拌5分钟，加入酒精，10000转/分钟，快速离心收集产物。

图1b-c为本实施例制备的zntpyp-mof纳米晶的sem图谱，图中：所述zntpyp-mof为六边形纳米盘。

图1d为本实施例制备zntpyp-mof纳米晶元素分布eds图，图中：碳和锌元素显著存在，钛和氧元素几乎检测不到。

图1h为本实施例制备zntpyp-mof纳米晶元素分布tem图，图中：所述zntpyp-mof尺寸约为300nm。

二、zntpyp-mof@tio2亲水纳米颗粒的制备：

1.tdaa甲醇溶液的准备：量取10μltdaa溶于500μl甲醇溶液中，避光保存于室温下。

2.ctab碱性溶液的准备：首先配置ph为11.0的naoh溶液，将ctab溶于该碱性溶液中，配成浓度为0.2mmol/l的ctab反应溶液。

3.5微摩尔的zntpyp-mof(以zntpyp计)溶于8mlctab碱性溶液，加入25μltdaa甲醇溶液，反应30分钟，再加入25μltdaa甲醇溶液，继续反应2小时，离心收集产物。

图1c-f为本实施例制备的zmt纳米颗粒的sem图谱，图中：所述的纳米颗粒分散良好，并且没有均相形核。

图1g为本实施例制备的zmt纳米颗粒的元素分布eds图，图中：碳、锌、钛及氧显著存在。

图1i-j为本实施例制备的zmt纳米颗粒的tem图，图中：所述的纳米颗粒外层均匀包覆tio2，且没有均相形核。

三、pll修饰纳米颗粒：

1.pll体系的制备：将nacl溶于ph＝7.4的pbs溶液中，再将pll溶于该pbs中，制备浓度为1mg/ml的pll溶液。

2.zntpyp-mof或zmt分别溶于200μl水或乙醇中，快速加入1ml的pll体系，缓慢搅拌20分钟，离心水洗，并将最终产物分散于水中。

图2a，b为本实施例制备的zntpyp-mof纳米颗粒在pll修饰前后的dls谱，图中：所述的zntpyp-mof纳米颗粒在pll修饰后分散良好，粒径尺寸趋于一致。

图2c，d为本实施例制备的zmt纳米颗粒在pll修饰前后的dls谱，图中：所述的zmt纳米颗粒在pll修饰后分散良好，粒径范围更集中。

四、溶液中活性氧的检测：

所制备的zntpyp-mof及zmt在可见光激发下，可以产生活性氧，且氧化钛的存在可显著增强zntpyp-mof的激活电子，还原氧气生成超氧阴离子，这为zmt在生物光动力治疗中的应用提供了条件。

图3为本实施例制备的zntpyp-mof及zmt和组装基体zntpyp分子的吸收光谱图，图中：组装后的纳米晶在可见光区的吸收显著增强。

图4为本实施例制备的zntpyp-mof，zmt及tio2在500nm可见光照射下产生活性氧的检测谱图。1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)为活性氧(超氧阴离子和单线态氧)捕获探针，通过监测dpbf410nm处吸收峰强度的降低，用以判定活性氧的产生，图中：相同光照条件下，zmt活性氧产率显著高于zntpyp-mof及tio2单独作用结果。

图5为本实施例活性氧具体成分的检测实验结果。对苯醌为超氧阴离子捕获剂，加入活性氧的dpbf检测溶液，便可有效排除超氧阴离子对dpbf吸收峰的影响，图中：相同光照条件下，对苯醌的加入，使得zmt组活性氧产率与zntpyp-mof及tio2单独作用时相比，无显著差别。验证出相同光照下，zntpyp-mof和zmt结合氧气作用产物分别为单线态氧和超氧阴离子，充分说明tio2作为共催化剂，可显著增强zntpyp-mof的光催化活性。

图6为本实施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm近红外单光子激光照射下产生活性氧的检测谱图。1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)为活性氧(超氧阴离子和单线态氧)捕获探针，通过监测dpbf410nm处吸收峰强度的降低，用以判定活性氧的产生，图中：相同光照条件下，zmt活性氧产率与zntpyp-mof及tio2单独作用无显著区别。

五、双光子荧光成像的检测：

所制备的zntpyp-mof在830nm双光子飞秒激光照射下，可吸收多个光子，发射650nm左右强荧光，这为zntpyp组装体在生物双光子荧光成像方面应用提供了条件。

图7为本实施例zntpyp单体分子，zntpyp-mof在415nm紫外光及830nm双光子激光照射下产生的荧光谱图，图中：不同激发光照射下，zntpyp单体分子，zntpyp-mof的发射荧光基本一致，说明zntpyp-mof充分保留了zntpyp单体分子的荧光激发及发射性质。

图8为本实施例zntpyp单体分子，zntpyp-mof在830nm双光子激光照射下的发射荧光图，图中：相同双光子激发下，zntpyp单体分子及zntpyp-mof的发射荧光信号基本一致。

图9为本实施例zntpyp-mof在不同双光子激发下的发射荧光强度图，图中：双光子激光强度的平方与zntpyp-mof的发射荧光信号呈线性关系，证实zntpyp-mof的双光子荧光特性。

图10为本实施例zntpyp-mof@pll与人宫颈癌细胞(hela)共培养后，双光子激发下的不同细胞层面的材料发射荧光图，图中：改变z轴高度，收集不同焦平面上的材料荧光信息，证实zntpyp-mof被细胞吞噬到达细胞质内，而非附着于细胞表面。

六、细胞中活性氧的检测：

所制备的zntpyp-mof及zmt可显著吸收近红外双光子，发射荧光的同时，结合tio2可产生大量活性氧，用于杀死肿瘤细胞。

图11为本实施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm双光子飞秒激光器照射下细胞内产生的活性氧检测结果。利用活性氧试剂盒荧光染料的强度变化，监测830nm双光子刺激下，细胞内活性氧产率的变化，图中：同步光刺激实验中，zmt预处理后的细胞，活性氧产率显著高于zntpyp-mof及tio2单独培养下的结果。

通过活性氧检测探针，在细胞水平上，验证了zntpyp-mof与tio2联合作用下，活性氧的产生效率极大提高，细胞毒性极大增强，验证了zntpyp-mof可吸收830nm双光子，实现双光子激发下的zmt光敏化动力学疗法。

七、细胞存活率实验：

所制备的zntpyp-mof，zmt及tio2，不同浓度下与细胞共培养下，标准的mtt法检测各个处理条件下的细胞存活率。结合830nm双光子激光刺激，检测不同材料预处理后的细胞存活情况。

图12为本实施例zntpyp-mof，zmt及tio2与细胞共培养后的细胞毒性检测结果。图中：在合适的离子浓度下，zntpyp-mof，zmt及tio2与细胞共培养后均无显著细胞毒性。

图13为本实施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm双光子飞秒激光器照射后的细胞存活率。图中：相同光刺激实验中，zmt预处理后的细胞，zmt的细胞致死性显著高于zntpyp-mof及tio2单独作用下的结果。

综上所述，与现有的双光子荧光及敏化动力学诊治探针对比，本发明提供的金属卟吩超分子组装体在保证生物相容性的同时能够充分发挥内核zntpyp-mof与外壳tio2的各自优点。zntpyp-mof在近红外双光子激发下，可发射较强的荧光，且具有显著优势：(1)长波长的近红外光比短波长光受散射影响较小，易穿透标本；(2)激发光可以到达焦平面，焦平面外的荧光分子不被激发，图像分辨率高；(3)长波处的近红外光比短波长的光对细胞毒性小。zntpyp-mof@tio2中zntpyp-mof吸收双光子后可激活染料分子，激活态电子注入tio2，电子活性显著增强，还原电子为超氧阴离子，用于杀死癌细胞，这对于临床上的原位疾病甚至肿瘤的精确定位与光学治疗具有重要意义。

以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。