一种红曲发酵液中桔霉素毒素的检测方法与流程

本发明属于检测领域，具体涉及一种检测红曲米中桔霉素毒素的方法。

背景技术：

桔霉素主要是由青霉属、曲霉属、红曲霉属所产生的一种次级代谢产物。桔霉素分布广泛，主要存在于小麦、玉米、燕麦等谷物产品，以及苹果、梨等水果的加工制品中。桔霉素具有良好的抑菌性，能抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灰色链霉菌等，在我国古代就被作为一种食品保藏剂涂抹在易腐烂的肉上。但由于桔霉素有很强的肾毒性而没有受到广泛应用，而且其污染问题越来越受到人们的关注，并被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。

红曲霉(monascuspurpureuswent.)属子囊菌曲霉科真菌，菌落初为白色，老熟后多形成红色。红曲霉被广泛用于酿酒、制醋、做豆腐乳的发酵生产中。发酵底物中带入的桔霉素毒素可直接转入发酵液中，导致对食用者的毒害。随着红曲应用领域的扩大、功能性红曲的不断开发和利用，如何快速、简便的提取红曲发酵液中桔霉素含量，已经成为我国红曲产品的研发以及出口检验检疫的主要内容。

国内外基于不同的检测方法对农产品、食品、饲料中所含的桔霉素毒素含量设立了不同的限制标准，随着hplc技术的不断完善，检测工作日趋简单，而样品的前处理成了技术关键和难点。目前对于桔霉素毒素分离纯化方法较为复杂，普遍都是通过浓缩、过柱、萃取实现桔霉素毒素分离，最后通过tlc或者hplc进行定性定量检测。

技术实现要素：

针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种检测红曲发酵液中桔霉素毒素的方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种红曲发酵液中桔霉素毒素的检测方法，包括步骤：

红曲发酵液与甲醇混匀，混合的体积比为1：(0.7-2)，经过振荡提取后，用高效液相色谱检测。

其中，所述甲醇为色谱级甲醇。即未稀释的色谱级甲醇。

优选地，所述甲醇为色谱级甲醇,红曲发酵液和甲醇的体积比为1：1。

进一步地，红曲发酵液与甲醇混匀后，室温下置于摇床上，转速100～300rpm下振荡下保温30～120min。

其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相为的乙腈/异丙醇/0.08mol/l磷酸溶液，乙腈/异丙醇/0.08mol/l磷酸的体积比为35：10：55。

其中，用荧光检测器进行检测，检测波长为331nm激发波长和500nm发射波长；流速为1.0ml/min；柱温40℃；进样量50μl。

其中，收集与桔霉素毒素标准品保留时间一致的峰的洗脱液，采用外标法进行定量测定，得到红腐乳样品中的桔霉素毒素含量，所述保留时间为前后0.05min。

其中，外标法的具体操作为，用桔霉素标准品溶于色谱级甲醇，配制成0.01～10μg/g系列浓度的标准曲线工作液。采用高效液相色谱法对不同浓度的标准曲线工作液进行高效液相色谱定量检测，并以桔霉素浓度作横坐标，以保留时间前后0.05min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，绘制标准曲线，用于外标法测定。

本发明的有益效果在于：

本发明利用桔霉素易溶于乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂的理化性质，提出一种更为简便的提取红曲发酵液中桔霉素毒素的方法，有利于推动红曲以及红曲发酵液业的发展。经试验证明，本发明的方法能够快速提取红曲发酵液中桔霉素毒素，且效率高、耗时少、成本低、回收率高(<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％；1000-100000ng/ml，回收率范围在90-110％)，符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)，另外，此方法也极大简便了红曲及其相关产品中桔霉素毒素的提取，具有极高的推广和应用价值。

附图说明

图1为桔霉素毒素含量检测标准曲线图谱。

图2为2000ng/ml桔霉素毒素标准品的hplc图谱。

图3为红曲发酵液样品a的hplc图谱及在红曲发酵液样品a中加入100μl不同浓度的桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。其中，图3a为红曲发酵液样品a的hplc图谱；图3b为在红曲发酵液样品a中加入100μl2000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3c为在红曲发酵液样品a中加入100μl1000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3d为在红曲发酵液样品a中加入100μl500ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的桔霉素标准品是sigma公司(美国)的产品。色谱级的甲醇、乙腈、异丙醇和磷酸是fisher公司(美国)的产品。

桔霉素标准曲线的制作方法如下：

用1ml色谱级甲醇溶1mg固体桔霉素标准品，配制成1000μg/ml桔霉素标准溶液，再用色谱级甲醇溶液分别配制成2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml标准曲线工作液。采用高效液相色谱法对不同浓度的标准曲线工作液进行hplc定量检测，并以桔霉素浓度作横坐标，以保留时间前后0.05min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。其中，高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(磷酸浓度0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。

绘制的标准曲线如图1所示。根据标准曲线得到的标准曲线方程为：y＝0.16658407x-2.3091981(y为峰面积，x为桔霉素毒素含量)，r2＝0.99978。

图2为2000ng/ml桔霉素毒素标准品的hplc图谱。

桔霉素毒素标准品溶液回收率的检测方法如下所示：

用移液器准确量取1.9ml色谱级甲醇后，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，转至2ml微量进样瓶中，进行hplc定量检测，以外标法定量进行数据处理。每种桔霉素毒素标准添加标准品重复3次，取平均值。

结果表明：1ml样品中理论添加桔霉素毒素含量分别为200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，实际检测平均值(即为下述实施例中的添加桔霉素毒素标准品的实际检测值)分别为181.47ng/ml，95.12ng/ml，55.48ng/ml，回收率分别为90.74％，95.12％，110.96％。实施例1：红曲发酵液中桔霉素毒素的提取及桔霉素毒素含量的检测

分别对红曲发酵液样品a进行原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品a，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲发酵液样品a重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约前后0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲发酵液样品a中的桔霉素毒素含量。图3之a为红曲发酵液样品a的hplc图谱。

2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品a，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲发酵液样品重复3次，取平均值。

检测结果如表1所示。其中，实际含量(ng/ml)为红曲发酵液样品中桔霉素毒素含量的实际平均检测值；理论含量(ng/ml)为红曲发酵液样品中分别加入0，2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品后的理论含量；回收率(％)为实际含量/理论含量*100％。

当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为16054.21ng/ml(即为原始红曲发酵液样品a中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为16083.09ng/ml，理论含量为16254.21ng/ml(200.00ng/ml+16054.21ng/ml)，回收率为98.95％(16083.09ng/ml/16254.21ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为15825.29ng/ml，理论含量为16154.21ng/ml(100.00ng/ml+16054.21ng/ml)，回收率为97.96％(15825.29ng/ml/16154.21ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为15679.31ng/ml，理论含量为16104.21ng/ml(50.00ng/ml+16054.21ng/ml)，回收率为97.36％(15679.31ng/ml/16104.21ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％；1000-100000ng/ml，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。图3之b为在红曲发酵液样品a中加入100μl2000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3之c为在红曲发酵液样品a中加入100μl1000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3之d为在红曲发酵液样品a中加入100μl500ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。

表1红曲发酵液样品a中桔霉素毒素含量检测

实施例2、红曲发酵液中桔霉素毒素的提取及桔霉素毒素含量的检测

分别对红曲发酵液样品b进行原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品b，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲发酵液样品b重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约前后0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲发酵液样品b中的桔霉素毒素含量。

2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品b，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算加标回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲发酵液样品重复3次，取平均值。

检测结果如表2所示。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为13275.91ng/ml(即为原始红曲发酵液样品b中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为13433.73ng/ml，理论含量为13475.91ng/ml(200.00ng/ml+13275.91ng/ml)，回收率为98.52％(13433.73ng/ml/13475.91ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为13352.66ng/ml，理论含量为13375.91ng/ml(100.00ng/ml+13275.91ng/ml)，回收率为99.25％(113352.66ng/ml/13375.91ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为13309.27ng/ml，理论含量为13325.91ng/ml(50.00ng/ml+13275.91ng/ml)，回收率为99.88％(13309.27ng/ml/13325.91ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％；1000-100000ng/ml，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。

表2红曲发酵液样品b中桔霉素毒素含量检测

实施例3、红曲发酵液中桔霉素毒素的提取及桔霉素毒素含量的检测

分别对红曲发酵液样品c进行原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、原始红曲发酵液中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品c，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲发酵液样品c重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约前后0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲发酵液样品c中的桔霉素毒素含量。

2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取

用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲发酵液样品c，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算加标回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲发酵液样品重复3次，取平均值。

检测结果如表3所示。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为21547.32ng/ml(即为原始红曲发酵液样品c中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为20603.47ng/ml，理论含量为21747.32ng/ml(200.00ng/ml+21547.32ng/ml)，回收率为94.74％(20603.47ng/ml/21747.32ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为20610.87ng/ml，理论含量为21647.32ng/ml(100.00ng/ml+21547.32ng/ml)，回收率为95.21％(20610.87ng/ml/21647.32ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为20896.65ng/ml，理论含量为21597.32ng/ml(50.00ng/ml+21547.32ng/ml)，回收率为96.75％(20896.65ng/ml/21597.32ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％；1000-100000ng/ml，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。

表3红曲发酵液样品c中桔霉素毒素含量检测

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。