一种化学提取‑热能分析法检测那屈肝素钙中N‑NO的系统和方法与流程

本发明涉及化学成分定量检测领域，具体涉及一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的系统和方法。

背景技术：

低分子肝素时近年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，其抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用低于肝素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等优点，目前已广泛应用于临床。那屈肝素钙是低分子肝素的一种，由亚硝酸降解肝素得到，重均相对分子质量3600～5000，临床用于预防手术后血栓栓塞、预防深静脉血栓形成、肺栓塞、血液透析时体外循环的抗凝剂、末端血管病变等。近年许多研究表明，那屈肝素钙的临床适应症越来越广泛。

那屈肝素钙的生产过程中使用了亚硝酸，亚硝酸和肝素在一定的条件下生成亚硝胺化合物，含有n-no基团。大量的动物实验已确认，亚硝胺是强致癌物，并能通过胎盘和乳汁引发后代肿瘤。因此，检测那屈肝素钙中n-no的含量，即是对亚硝胺化合物的含量控制，对保证患者用药安全具有重要意义。检测原理：样品释放出no2·和no·，通过过滤&冷阱除去裂解副产物，在反应室中，no·与o3反应，得到电子激发态no2，经过光电倍增管检测，在红外区域发射光谱，最后通过积分仪显示信号。

目前那屈肝素钙中n-no基团主要是用热能分析仪进行检测。体系载气为氩气，传统装置中需要配置气泡捕捉器和冷阱中用到的试剂，装填至装置后进行试验，该试剂配置过程复杂，装置耗费空间较大，冷阱温度控制麻烦，加热反应体系时无法振荡混匀。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的系统和方法，解决了现有技术中存在的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的检测系统，包括tea分析仪，所述tea分析仪内设有化学发光检测器，tea分析仪上设有能够为tea分析仪提供氧气的氧气源入口、与化学发光检测器连通的n-no混合气体入口和真空泵接口；所述检测系统还包括一级冷凝装置、二级冷凝装置、蠕动泵、加热器、反应器、氧气源、真空泵和氮气源。

所述一级冷凝装置上设有冷凝介质流动腔和第一混合气体流动腔，所述冷凝介质流动腔上设有第一冷凝介质出口和第一冷凝介质入口，所述第一混合气体流动腔上设有第一混合气体入口和第一混合气体出口；

所述二级冷凝装置内设有冷凝介质存放腔和第二混合气体流动腔，所述冷凝介质存放腔上设有第二冷凝介质出口和第二冷凝介质入口，所述第二混合气体流动腔上设有相互连通的第二混合气体入口和第二混合气体出口，所述第二混合气体入口与一级冷凝装置上的第一混合气体出口连接以使反应器内的混合气体通过一级冷凝装置进入二级冷凝装置内，所述第二混合气体出口通过气路管与tea上的n-no混合气体入口连接；所述第二冷凝介质入口与所述第一冷凝介质出口连接；

所述蠕动泵，其与第一冷凝介质入口和第二冷凝介质出口连接以使二级冷凝装置中的冷凝介质进入一级冷凝装置中；

所述反应器上设有气体出口和能够加入样品并通入氮气的样品入口，所述气体出口与第一混合气体入口连接以使反应器中的混合气体进入一级冷凝装置中，所述样品入口通过氮气管与氮气源连接；

所述加热器上放置有反应器；

所述热能分析仪上的氧气源入口与氧气源连接，所述真空泵接口与真空泵连接。

进一步地，所述氮气管上设有氮气分压阀；所述tea分析仪内设有能够调节混合气体进入量的氮气调节阀、氧气进入量的氧气调节阀。

进一步地，所述一级冷凝装置为冷凝管；所述二级冷凝装置为冷凝器。

进一步地，所述氮气管贯穿所述样品入口上的盖子从而通往反应器；所述反应器中设置有搅拌装置。

一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的方法，按照上述的检测系统将检测中所用到的设备进行连接，该方法包括以下步骤：

s1：溶液配制：直接采用甲酰胺溶液稀释配制供试品溶液和标准品溶液；

s2：①打开真空泵将tea分析仪抽真空，真空度稳定在0.15torr以下以后，打开tea分析仪；②tea分析仪所显示的真空度在20min内均维持在0.13torr以下时，打开氮气调节阀和氮气管上的氮气分压阀，并将氮气分压调节至4～6psi；③转动氧气调节阀，使真空度达到0.50±0.01torr，然后转动氮气分压阀和氮气调节阀，使分压阀压力为5psi时，真空度达到1.67±0.01torr；④依次打开tea分析仪中的臭氧发生器和光度计；

s3：打开二级冷凝装置，使冷凝介质的温度维持在0-5℃，再打开蠕动泵，使一级冷凝装置和二级冷凝装置内的冷凝介质循环；

s4：从反应器的样品入口加入乙酸乙酯和氢溴酸，使密闭整个系统，调节进入反应器中的氮气流速为35±0.5ml/min，调节加热器温度，使之保持持续稳定沸腾的状态；

s5：将标准品溶液和供试品溶液分别注入反应器中，反应生成的no气体经两次冷却进入化学发光检测器中，记录色谱图；并将采集到的数据进行计算，得出结果。

进一步地，进入反应器中的氮气流速为35ml/min。

进一步地，在步骤s1中，溶液配制的具体方法为：供试品溶液：配制甲酰胺溶液，然后精密称定供试品，加甲酰胺溶液稀释制成供试品溶液；

配制标准品储备液：(1)配制标准品储备液：取标准品ndpa，加入无水乙醇溶解，制成ndpa浓度为10μg/ml的溶液，密封避光储存；(2)配制标准品浓配液：精密量取标准品储备液，用无水乙醇稀释，制成ndpa的浓配液；(3)标准曲线溶液：精密量取标准品浓配液适量，用甲酰胺溶液稀释，制成含ndpa浓度为逐渐增高的梯度浓度溶液。

进一步地，所述配制标准品储备液的浓度为10μg/ml；标准品浓配液的浓度为1000ng/ml；用甲酰胺溶液稀释所制成的ndpa梯度浓度溶液分别为：0ng/ml、60ng/ml、120ng/ml、180ng/ml的溶液，其中，0ng/ml为甲酰胺溶液中不加取标准品浓配液。

进一步地，甲酰胺溶液的配制浓度为：在1g的氨基磺酸中加入19ml甲酰胺和1ml水，振摇使成均匀溶液。

进一步地，步骤s4中，反应容器内加入磁力搅拌子进行搅拌，乙酸乙酯和氢溴酸的加入量分别为15ml和5ml；加热器温度的温度调节为60～70℃；标准品溶液和供试品溶液每次的进样量均为30～60ul。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的系统和方法，该系统设置巧妙，简单、明了，能够更精确的检测no，可完全适宜那屈肝素钙中no的检测。

本发明的方法比传统方法的检出结果稳定性更高、更精确、检出限更低、检出速度更快、更简单，且得到的色谱图峰型漂亮，图谱基线平稳，使得计算速度更快更方便，误差率极低，其计算结果与实际结果基本一致，具有极其重要的应用意义；具体地，本发明只需50ul的进样量，便可精确检测出ppb级浓度的亚硝胺类化合物，其检出限能达到0.06ppm以下。而且该方法的试剂配置过程非常简单，大大简化了程序，节省了时间、成本和人力；本发明具有极高的灵敏度和对含氮化合物的高选择性，是专一性极强的检测方法。

具体地，①采用氮气流并将氮气流量精密控制能够显著提高检测精度和稳定性，且使检测结果更清晰、检出限更低。②通过具体的一级冷凝装置和二级冷凝装置等具体的设置使得控制温度等等更精确，且显著提高了精确度并降低了检出限。③在溶液配制中，本发明去除了传统中关键步骤“用五氧化二磷真空干燥”，大大节约了周期、节省了时间和成本，且直接溶解于甲酰胺溶液中能够完全检测出其中no基团的含量。标准品储备液的配制及保存方式方便了多次试验，在储存期内无需单独配制，为实际试验节约了时间成本。标准品溶液的配制采用了标准曲线法，标准曲线法能更简便快速的进行样品定量，结果计算更为准确，比传统方法的结果误差范围明显缩小。此外，上述这些方法配合本发明中的反应体系等使得本发明的效果明显由于传统方法，并且更适宜于工业化应用。

附图说明

图1是本发明实施例所述的检测系统的结构示意图；

图2是本发明实施例所述的实施例3(即实验组)中标准品的色谱图；

图3是本发明实施例所述的实施例3(即实验组)中供试品的色谱图；

图4是本发明实施例所述的实施例4中对比组的标准品的色谱图；

图5是本发明实施例所述的实施例4中对比组的供试品的色谱图。

图6是本发明实施例所述的改变载气的色谱图；

图7是本发明实施例所述的增大氮气气流的色谱图；

图8是本发明实施例所述的减小氮气气流的色谱图；

图9是本发明实施例所述的变为只有一个冷凝装置的色谱图。

1、加热器，2、反应器，3、一级冷凝装置，4、二级冷凝装置，5、蠕动泵，6、tea分析仪，7、氧气源，8、真空泵，9、氮气源，10、氮气管，11、软管，12、气路管，21、气体出口，22、样品入口，31、冷凝介质流动腔，32、第一混合气体流动腔，41、冷凝介质存放腔，42、第二混合气体流动腔，61、n-no混合气体入口，62、真空泵接口，63、氧气源入口，91、氮气分压阀，311、第一冷凝介质出口，312、第一冷凝介质入口，321、第一混合气体出口，322、第一混合气体入口，411、第二冷凝介质入口，412、第二冷凝介质出口，421、第二混合气体入口，422、第二混合气体出口。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的检测系统，如图1所示，包括热能分析仪(tea分析仪)6，所述tea分析仪6内设有化学发光检测器，tea分析仪6上设有能够为tea分析仪6提供氧气的氧气源入口、63与化学发光检测器连通的n-no混合气体入口61和真空泵接口62，n-no混合气体入口61使标准品或供试品等中的n-no气体随着氮气从该口进入tea中进行色谱图记录；所述检测系统还包括一级冷凝装置3、二级冷凝装置4、蠕动泵5、加热器1、反应器2、氧气源7、真空泵8和氮气源9。

所述一级冷凝装置3上设有冷凝介质流动腔31和第一混合气体流动腔32，所述冷凝介质流动腔31环绕设置于第一混合气体流动腔32外围，则可对第一混合气体流动腔32内进行冷却；所述冷凝介质流动腔31上设有相互连通的第一冷凝介质出口311和第一冷凝介质入口312，所述第一混合气体流动腔32上设有相互连通的第一混合气体入口322和第一混合气体出口321。

所述二级冷凝装置4内设有冷凝介质存放腔41和第二混合气体流动腔42，所述冷凝介质存放腔41环绕设置于第二混合气体流动腔42外围，则可对第二混合气体流动腔42内进行冷却；所述冷凝介质存放腔41上设有相互连通的第二冷凝介质出口412和第二冷凝介质入口411，所述第二混合气体流动腔42上设有相互连通的第二混合气体入口421和第二混合气体出口422，所述第二混合气体入口421通过软管11与一级冷凝装置3上的第一混合气体出口321连接以使反应器2内的混合气体通过一级冷凝装置3进入二级冷凝装置4内的第二混合气体流动腔42中，最后再进入tea分析仪6内进行色谱分析等；所述第二混合气体出口422通过气路管12与tea分析仪6上的n-no混合气体入口61连接，则反应器2内混合有no的氮气进入化学发光检测器中。所述第二冷凝介质入口411与所述第一冷凝介质出口311连接，使得从一级冷凝装置3回来的冷凝介质从第二冷凝介质入口411循环回到二级冷凝装置4内的冷凝介质存放腔41中。

所述蠕动泵5，其与第一冷凝介质入口312和第二冷凝介质出口412连接，从而将二级冷凝装置4中的冷凝介质泵入一级冷凝装置3中。

所述反应器2上设有气体出口21和能够加入样品并通入氮气的样品入口22，所述气体出口21与第一混合气体入口连接，以使反应器2中的混合气体进入一级冷凝装置3的第一混合气体流动腔中；所述样品入口22通过氮气管与氮气源9连接，所述氮气管10上设有氮气分压阀91；氮气源9与反应器2的连接方式为：所述氮气管10贯穿所述样品入口上的盖子从而使氮气管10的出气口伸入反应器2中，则氮气流便能进入反应器2。

所述加热器1上放置有反应器2，该加热器1能够为反应器2加热并保持一定温度。

所述tea分析仪6上的氧气源入口63与氧气源7连接，所述真空泵接口62与真空泵8连接。所述tea分析仪6内还设有能够调节从n-no混合气体入口61所进入的混合气体进入量的氮气调节阀以及调控从氧气源7所进入的氧气量的氧气调节阀。

作为进一步优选的实施方式，所述一级冷凝装置3优选为冷凝管；所述二级冷凝装置4优选为冷凝器。

在本发明中，tea分析仪可购买获得，本发明所用的是ellutia公司所生产、售卖的tea分析仪；冷凝管和冷凝器只需要能够实现本发明的功能便可，该冷凝管和冷凝器也可以购买，如冷凝管(厂家：ellutia)，冷凝器(厂家：ellutia)。

实施例2

一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的方法，该方法包括以下步骤：

s1：按照实施例1中所述的检测系统的结构将检测中所用到的设备进行合理放置并连接；

s2：溶液配制：

(1)甲酰胺溶液配制：称取氨基磺酸1g，加入19ml甲酰胺和1ml水，振摇使成均匀溶液。

(2)供试品溶液配制：精密称定供试品那屈肝素钙，加甲酰胺溶液定量稀释制成每1ml中约含那屈肝素钙100mg的溶液。

(3)标准品储备液配制：取ndpa(n-亚硝基二丙胺)标准品100mg，加入78.62g无水乙醇溶解配制成初级液，再取初级液适量，用无水乙醇稀释，制成ndpa浓度为10μg/ml的溶液即为标准品储备液，密封避光5℃储存。

(4)标准品浓配液：精密量取标准品储备液适量，用无水乙醇稀释，制成ndpa浓度为1000ng/ml的溶液。

(5)标准曲线溶液：精密量取标准品浓配液适量，用甲酰胺溶液稀释，制成各含ndpa浓度为0ng/ml、60ng/ml、120ng/ml、180ng/ml的溶液，该标准曲线浓度单位ng/ml即为ppb，其中，0ng/ml为甲酰胺溶液中不加取标准品浓配液。

s2：①打开真空泵将tea分析仪6抽真空，真空度稳定在0.13torr以下以后，打开tea分析仪6；②tea分析仪6所显示的真空度在20min内均维持在0.13torr以下时，打开氮气调节阀和氮气管上的氮气分压阀，并将氮气分压调节至5psi，然后关闭氮气分压阀和氮气调节阀；分压阀压力不下降即可进行后续步骤；③转动氧气调节阀，使真空度达到0.50±0.01torr，然后转动氮气分压阀和氮气调节阀，使分压阀压力为5psi时，真空度达到1.67±0.01torr；④依次打开tea分析仪中的臭氧发生器和光度计；

s3：打开二级冷凝装置，使冷凝介质的温度维持在0-5℃，再打开蠕动泵，使一级冷凝装置和二级冷凝装置内的冷凝介质循环；

s4：旋开样品入口的盖子，向反应容器内加入磁力搅拌子，从反应器的样品入口加入15ml乙酸乙酯和5ml氢溴酸，旋紧样品入口盖子，密闭整个系统，然后用气体流量计测定进入反应器中的氮气流速，并使氮气流苏35±0.5ml/min，氮气流量的控制可以直接影响到实验精密度，本方法优选进入反应器中的氮气流速35ml/min，调节加热器温度为60～70℃，并将搅拌子转速调至适中，使反应器内的溶液保持持续稳定沸腾的状态；

s5：将每个浓度的标准品溶液分别注入反应器中，每个浓度梯度的标准品平行进样3针，每次每针的进样量50ul，标准品溶液进样完毕以后，将供试品溶液也注入反应器中，供试品溶液平行进样2次，每次50ul。

标准品溶液和供试品溶液均与反应器中的溶液反应并生成no气体，该no气体随着氮气流经一级冷凝装置和二级冷凝装置这两次冷却后进入化学发光检测器中进行检测，记录色谱图；并将采集到的数据进行计算，得出结果。

实施例3

一种化学提取-热能分析法检测那屈肝素钙中n-no的方法，该方法包括以下步骤：

s1：按照实施例1中所述的检测系统的结构将检测中所用到的设备进行合理放置并连接；

s2：溶液配制：

(1)甲酰胺溶液配制：称取氨基磺酸1g，加入19ml甲酰胺和1ml水，振摇使成均匀溶液。

(2)供试品溶液配制：精密称定供试品那屈肝素钙，加甲酰胺溶液定量稀释制成每1ml中约含那屈肝素钙100mg的溶液。预先制定的供试品溶液中n-no基团的实际含量为0.065ppm；

(3)标准品储备液配制：取ndpa(n-亚硝基二丙胺)标准品100mg，加入78.62g无水乙醇溶解配制成初级液，再取初级液适量，用无水乙醇稀释，制成ndpa浓度为10μg/ml的溶液即为标准品储备液，密封避光5℃储存。

(4)标准品浓配液：精密量取标准品储备液适量，用无水乙醇稀释，制成ndpa浓度为1000ng/ml的溶液。

(5)标准曲线溶液：精密量取标准品浓配液适量，用甲酰胺溶液稀释，制成各含ndpa浓度为0ng/ml、60ng/ml、120ng/ml、180ng/ml的溶液，该标准曲线浓度单位ng/ml即为ppb，其中，0ng/ml为甲酰胺溶液中不加取标准品浓配液。

s2：①打开真空泵将tea分析仪6抽真空，真空度稳定在0.13torr以下以后，打开tea分析仪6；②tea分析仪6所显示的真空度在20min内均维持在0.13torr以下时，打开氮气调节阀和氮气管上的氮气分压阀，并将氮气分压调节至5psi，然后关闭氮气分压阀和氮气调节阀；分压阀压力不下降即可进行后续步骤；③转动氧气调节阀，使真空度达到0.50torr，然后转动氮气分压阀和氮气调节阀，使分压阀压力为5psi时，真空度达到1.67；④依次打开tea分析仪中的臭氧发生器和光度计；

s3：打开二级冷凝装置，使冷凝介质的温度维持在2-3℃，再打开蠕动泵，使一级冷凝装置和二级冷凝装置内的冷凝介质循环；

s4：旋开样品入口的盖子，向反应容器内加入磁力搅拌子，从反应器的样品入口加入15ml乙酸乙酯和5ml氢溴酸，旋紧样品入口盖子，密闭整个系统，然后用气体流量计测定进入反应器中的氮气流速，并使氮气流苏35ml/min，调节加热器温度为65℃，并将搅拌子转速调至适中，使反应器内的溶液保持持续稳定沸腾的状态；

s5：将每个浓度的标准品溶液分别注入反应器中，每个浓度梯度的标准品平行进样3针，每次每针的进样量50ul，标准品溶液进样完毕以后，将供试品溶液也注入反应器中，供试品溶液平行进样2次，每次50ul。

s6：结果：所得到的标准品色谱图如附图2所示，样品色谱图如附图3所示。

由图2所示，标准品的峰面积和平均值如下表1所示。由于标准品浓度分别为0ng、60ng、120ng、180ng，每个浓度分别平行进样三针，存在三个峰面积，而平均值是取三次平均值进行计算。

表1标准品的峰面积

n-no含量计算公式为：标准品峰面积和浓度计算得出线性回归方程:cr＝kar+b；将样品峰面积代入以上线性回归方程中计算得出样品溶液中ndpa浓度cs(ng/ml)；再根据公式cs*44*v/m/130得出供试品中n-no基团含量(ppm)，其中m为样品称样量，mg；v为样品溶液体积，ml。

由表1的结果可得出线性回归方程，即为：c＝0.0016a-92.8196；r＝0.99。

由图3所示的样品色谱峰可知，其峰面积为:峰1：61956；峰2：79814，平均值为70885，按公式计算，得到供试品(即样品)中n-no基团含量为0.07ppm。

实施例4

实验组：实施例3中记载的方法以及所得到的结果；由实施例3可知，供试品中n-no基团的实际含量为0.065ppm，而实验组(即实施例3)方法计算得到的含量为0.07ppm，与实际含量相差极小，结果基本接近实际结果。

对比组：按传统方法配制标准品溶液和供试品溶液，标准品浓度为单一浓度，配制浓度等与实验组相同，供试品溶液中n-no基团的含量同样为0.065ppm；测试方法也采用传统方法。所得的标准品溶液的色谱图如图4所示，样品的色谱图如图5所示。计算所得标准品的峰面积为：28256，样品的峰面积为10040，采用实施例3中的公式计算得到的样品中n-no基团含量为0.1ppm。由于实际含量为0.065ppm，而该对比组得到的含量为0.1ppm，相差0.35ppm，该方法本身的不稳定性等导致其与实际含量相差大，结果与实际结果一致性非常差。

由图2～3可知，本发明方法所得到的色谱图，无论是标准品还是样品，其峰形标准，每个峰均无裂变的多个小峰，图谱基线平稳，峰面积容易确定，计算非常容易且准确度高，工作人员只需要几分钟便可轻松得出最终结果，且不同的工作人员所计算的结果基本一致，误差率极小。

由图4～5可知，传统方法试验得出的图谱基线不平稳，峰型难看，每个峰的顶部裂变出多个小峰，且难以判断该峰的起始和结束段，为工作人员造成了计算的困难，有时难以分辨峰的数量，且有时候一个样品需要计算大半天，且准确度不高，误差率较高，不同的工作人员所计算的结果相差较大，对于最终结果的呈现存在较大的误差。

上述的基线不平稳就是基线噪音比较大，基线噪音会干扰检测结果，如果样品浓度低的话，便会和噪音分不出来，而且基线对峰面积的计算具有极大的干扰作用。因此，平稳的基线对于精确的结果以及低的检测限影响很大。

因此，本发明的最终结果远远优于传统方法。

此外，还需要说明的是，对于实施例3中的方法，若将载气变为氩气、增加或减小氮气的气流、将两级冷凝变为只有其中任意一种冷凝装置等等，均对最终结果影响较大，色谱图的效果也有明显变化，如附图6～9所示，图6采用氩气为载体，图7和图8分别为增大气流和减小气流，图9为改为只含有一个冷凝装置，由这些图可知，这些因素对于谱图影响均比较大，改变任何一个因素可能都会使谱图基线不平稳、峰进行裂变等等，为后期的计算以及结果的精确性造成了很多的影响。而本发明将这些改进均集合于本发明中，这些改进在彼此的影响下，使得结果非常惊喜，谱图极其漂亮，计算非常方便，误差率极低。本发明人从本行业研究者基本不会注意或考量的地方入手，通过多个地方的改进，最终得到了极佳的效果，基线平稳，峰面积计算方便、精确、结果精度高。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。