稻米锰含量简易快速测定法的制作方法

本发明涉及水稻糙米含锰量的简易快速测定技术和筛选方法，主要涉及领域为农学、育种、水稻。

背景技术：

水稻是世界第二大粮食作物，也是我国的主要粮食作物，其营养成分直接关系到消费者的身体健康，但目前生产上推广的许多水稻品种中一些人体所必需的重要矿质元素含量明显不足。锰是人体必需的微量元素之一，对促进骨骼的正常生长发育和维持脑功能等有着重要作用，适量的锰有益于人体健康。借助食品添加剂或药物等可以补充人体锰元素，但存在投资大、费用高、覆盖面小等问题，不能在整体上解决锰营养不良的问题。通过常规育种、诱变育种等生物强化手段，可以有效提高水稻稻米中能为人体吸收利用的锰营养元素含量。但培育富含锰营养成分的水稻新品种(系)过程中，需要测定大量种质资源、育种群体或诱变群体等单株的稻米锰含量，数量极大。因此，锰营养成分的测定方法和技术是筛选水稻富锰单株、提高稻米锰含量的最重要限制因子，重点及难点在于如何简易、快速、经济和有效地鉴定稻米锰元素的含量。目前稻米中矿物质含量的测定方法一般都需要昂贵的仪器、以及繁琐的样品前处理程序；不但测定费用高，而且不能快速、高效地测定出稻米的锰含量，因而不适合于水稻育种过程中的大批量单株筛选。由于在水稻育种的单株选择过程中，一般不需要很精确地确定水稻单株的稻米锰含量水平，只需获得群体单株间或与对照植株间稻米锰含量的相对差异就可达到富锰单株筛选之目的。因此，提出稻米锰含量的简易快速测定技术，用于水稻育种群体中的富锰单株快速鉴定，可以快速筛选出符合要求的富锰单株。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种稻米锰含量简易快速测定法，该方法可为富锰水稻育种提供简易、快速、经济和有效的单株筛选方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻米锰含量简易快速测定法，将待测水稻和标准品水稻分别进行如下的步骤1)～5)；

1)、取水稻糙米4粒，加入4％naoh溶液1.0ml、35％过氧化氢0.1ml，于65±5℃糊化3±0.1h；

然后加入10％hcl溶液1.0ml浸提，于50±5℃恒温水浴振荡器中下震荡20±2min，振荡频率为250±10r/min；

上述％均为质量％；

2)、在步骤1)所得的溶液中加入8m(8mol/l)naoh溶液0.4ml，混匀后静置1h，再加0.5ml的无水乙醇，振荡摇匀；

3)、在步骤2)所得的溶液中加入1m(1mol/l)edta溶液0.1ml，振荡摇匀；

4)、在步骤3)所得的溶液中加入甲醛肟溶液0.1ml，振荡摇匀，静置20±2min；

5)、在步骤4)所得的溶液中加入氨-盐酸羟胺溶液0.5ml，振荡摇匀，静置20min；

6)、将步骤5)所得待测水稻的糙米反应液(即，静置后所得的上层清液)和标准品水稻的糙米反应液进行颜色比较；

当待测水稻糙米反应液的颜色比标准品水稻糙米反应液的颜色深时，说明待测水稻糙米的含锰量高于标准品水稻；

反之，当待测水稻糙米反应液的颜色比标准品水稻糙米反应液的颜色浅时，则说明待测水稻糙米的含锰量低于标准品水稻。

作为本发明的稻米锰含量简易快速测定法的改进：

所述甲醛肟溶液的制备方法为：将10g盐酸羟胺溶于50ml水中，再加质量分数为35％的甲醛溶液5ml，用水稀释至100ml，于-20±2℃贮存至少30天，得甲醛肟溶液。

备注说明：因为甲醛与盐酸羟胺反应生成甲醛肟的速度缓慢，配置后不能直接使用，需经上述低温贮存后才能使用。

作为本发明的稻米锰含量简易快速测定法的进一步改进：氨-盐酸羟胺溶液的制备方法为：将4.7m氨溶液和6m盐酸羟胺溶液等体积混合摇匀。

作为本发明的稻米锰含量简易快速测定法的进一步改进：标准品水稻为嘉育293。

在本发明中，待测的水稻材料可为不同类型的水稻品种(系)、育种单株和标准对照品种(系)；糙米是稻谷脱去稻壳后，果皮、种皮、珠心层完好的稻米籽粒；水稻糙米选择大小基本一致的成熟糙米(稻谷经常规的脱壳处理)。在本发明中，颜色越深，说明待测水稻比标准品水稻的锰含量越高。

采用本发明的方法可以筛选出待测水稻材料中的富锰单株。本发明的方法总计时间仅约为5h，操作过程简单、快速。

本发明具有如下技术优势：

(1)本发明可对有色和白色糙米进行检测，可用于富锰水稻材料或单株的大规模快速定性筛选。多数水稻品种的糙米粒重差别可忽略不计，筛选时可以选择大小基本一致的成熟糙米进行快速鉴定。对于少数糙米体积明显大于或小于对照的水稻特殊材料，进行实验时可以增加或减去0.5～1粒糙米，使其糙米总量相近，必要时可以采用称重的方法加以校正。

具体而言：与4粒标准品水稻糙米的重量差在±5％的，判定成总量相近。

(2)待测水稻糙米反应物与对照水稻糙米反应物的颜色深度对比，通过简单的目测即能获得，颜色越深其锰含量越高。本发明主要用于富锰水稻的定性筛选，主要挑选染色色度“明显”深于对照的样品进行阐述，锰含量相近水稻样品染色后的色度相差不大。

(3)本发明采用4％naoh对水稻糙米于65℃糊化3h，只需糙米粒就可以定性地筛选出锰含量较高的水稻品种(系)或单株。

即，本发明可直接利用糙米粒(即，只需4粒稻谷去壳后即可直接实验)，无需磨粉，可简化程序、节约时间，快速确定稻米中的锰含量。

而目前有关测锰的常规技术如icp-ms等，需要机器对稻谷去壳后磨粉，且需要专门的仪器对米粉消解，仪器贵重且操作技术性强。

(4)本发明通过对比试验确定：0.4ml的8m氢氧化钠溶液，0.1ml的甲醛肟溶液，显色灵敏且稳定。

(5)成本优势明显，本发明测定一个样本的成本仅需0.2～0.3元。而常规技术如icp-ms等费用就很高，检测单位测一个样本约需60～120元。

综上所述，本发明提出的稻米锰含量简易快速测定技术无需磨粉，只需糙米就可以直接定性筛选出锰含量较高的水稻品种(系)或单株，一天内可以完成大量样品的筛选。与传统的米粉测定方法相比较，本发明可为育种工作者提供一个更为简易、快速、经济、有效的富锰水稻单株筛选方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为5种不同水稻品种染色比较图：26715、鸭血糯、台早94-10、嘉育293、罗可马246。

图2为氢氧化钠用量对吸光度的影响图。

图3为甲醛肟显色剂用量对吸光度的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中用到的水稻品种：

26715：早籼糯稻，嘉兴农科院选育。

鸭血糯：江苏常熟农家品种。

台早94-10(台早9410)：早籼稻，浙江省台州市农科院选育。

嘉育293：早籼稻，浙江省嘉兴市农科院选育。

罗可马246：云南籼稻农家品种。

实施例1：以26715、鸭血糯、台早94-10和罗可马246成熟水稻稻谷为待测材料，以嘉育293标准品种作为对照。将待测水稻和标准品水稻稻谷脱壳后，分别获得不同材料的糙米；取大小基本一致的待测水稻糙米和标准品水稻糙米分别进行如下操作的1)～5)：

1)、将4粒水稻成熟糙米装入5ml离心管中，加入质量分数4％naoh溶液1ml，35％的过氧化氢0.1ml，在65℃烘箱中糊化3h，从烘箱中取出后加入10％hcl溶液1ml浸提，于50℃恒温水浴振荡器中震荡20min，振荡频率为250r/min；

2)、在步骤1)所得的溶液中加入8mnaoh溶液0.4ml，混匀后静置1h，再加0.5ml的无水乙醇，振荡摇匀；

3)、在步骤2)所得的溶液中加入1medta溶液0.1ml，振荡摇匀；

4)、在步骤3)所得的溶液中加入甲醛肟溶液0.1ml，振荡摇匀，静置20min；

甲醛肟溶液的制备方法为：将10g盐酸羟胺溶于50ml水中，再加质量分数为35％的甲醛溶液5ml，用水稀释至100ml，于-20℃的冰箱内贮存至少30天，得甲醛肟溶液；

5)、在步骤4)所得的溶液中加入氨-盐酸羟胺溶液0.5ml，振荡摇匀，静置20min；

氨-盐酸羟胺溶液的制备方法为：将4.7m氨溶液和6m盐酸羟胺溶液等体积混合摇匀。

6)、将步骤5)所得待测水稻的糙米反应液与标准品水稻的糙米反应液进行颜色比较。

备注说明：静置后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较。

如图1所示，不同锰含量水稻品种(系)的糙米染色结果显示，26715、鸭血糯、台早94-10、嘉育293、罗可马246的颜色(红棕色)依次递减。在彩图中，26715显示的反应液颜色为深红棕色，鸭血糯为红棕色，台早94-10为中红棕色，嘉育293为浅红棕色，罗可马246为微红棕色。

参照hj-t344-2007《水质锰的测定》，对上述水稻品种(系)的锰含量进行测定。结果表明26715、鸭血糯、台早94-10、嘉育293和罗可马246的锰含量分别为45.11、39.97、29.05、23.64和19.49mg/kg。

因此，本发明的稻米锰含量简易快速测定技术可用于富锰水稻的育种实践和品种(系)筛选。

对比实验1：将实施例1步骤2)中的8mnaoh溶液共设置了5个梯度(0.30、0.35、0.40、0.45、0.50ml)，研究了naoh溶液不同用量对吸光度的影响。结果表明在0.40ml时其吸光度能够达到最大值，故本发明选用0.40mlnaoh(图2)。

对比实验2：显色剂的用量会影响吸光度的大小，如图3所示。当甲醛肟溶液用量在0.05～0.20ml时，吸光度稳定，且达到最大值，本发明选用0.10ml甲醛肟溶液。

另外，以上仅列举了本发明的若干个具体实施例之一。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。