本发明涉及一种测定方法，具体涉及一种猕猴桃多酚测定方法。
背景技术：
猕猴桃在我国广泛种植，猕猴桃中含有多种营养物质如维生素c、多酚等，长期食用猕猴对人的身体健康具有巨大帮助。
多酚拥有抗氧化效果，适当摄取可以预防疾病，增强身体抗御能力。但过量摄取会引起肝脏和肠道不适，严重的更会造成肝脏损伤。因此应该严格控制摄入量，人每次的安全口服剂量不超过0.25g。找到一种方法准确测出猕猴桃中的多酚含量,即可知道每次食用多少猕猴桃比较合适。现有技术中有较多的猕猴桃多酚含量测定方法，但测定时采用一步浸提，不能将猕猴桃汁中搜有多酚提取出来，测得的含量差别较大，不够准确。
技术实现要素：
针对上述现有现有技术，本发明要解决猕猴桃多酚含量测定不够准确的技术问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种猕猴桃多酚含量测定方法，具体步骤为：
(1)浸提：取一定量榨好的猕猴桃汁和体积分数为50％的醇溶液放于20ml容量瓶中，在61～64℃条件下浸提45min；
(2)测定吸光度数值：浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值；
(3)重复浸提：取离心后的上清液，重复步骤(1)、(2)5次；
(4)计算多酚当量：将5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程y＝2.8758x+0.4960中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量；所述标准曲线中y代表多酚质量浓度，x代表吸光度数值；
(5)计算多酚含量：多酚含量的计算公式为：w＝c×v/m；其中，w为多酚的含量，c为没食子酸当量，即依据标准曲线计算出的多酚含量，v为浸提液的体积，m为取液量；将5次测得的多酚含量相加即得总多酚含量。
本发明的有益效果是：用醇溶液进行浸提，对人员和环境友好，不会造成人员受伤和环境污染的问题。浸提温度和时间适中，多酚类物质不会分解或氧化，保证了多酚含量测定的准确度。浸提完成后，浸提液在离心机的作用下离心15min，浸提液中的多酚类物质和杂质充分分离后进入上层清液，测定结果更加准确。特征吸收波长提前由没食子酸标准溶液测出，在测定多酚含量时将上清液放入紫外分光光度计后，直接在715nm处测量吸光度即可，方便省时。测出吸光度数值后，带入预先拟合好的标准曲线方程，经过计算即可得出多酚的质量浓度，方便快捷。多次重复对上层清液中的多酚进行浸提，可以最大限度的将上层清液中的多酚提取干净，将每次浸提得到的多酚含量进行相加后，可以得到更为准确的猕猴桃多酚含量。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤(2)中特征吸收波长的确定方法为：取1ml没食子酸标准溶液、1ml福林酚试剂和14ml水放入20ml容量瓶内，均匀混合后在1～5min内加入3ml20wt％的碳酸钠溶液，混合均匀后定容；在25℃条件下放置1h，用紫外分光光度计在200～800nm之间进行全波长扫描，测定最大吸收时的波长；测出的特征吸收波长为715nm。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：提前确定出没食子酸的特征吸收波长，在测定猕猴桃多酚含量时可直接使用，节约大量时间。配置好溶液后放置在25～30℃条件下，猕猴桃成熟期内的室温正好处于该范围，即将配置好的溶液放置在室内即可，不用额外的升温或降温处理，操作简单，节约能源。在确定特征吸收波长时，在200～800nm范围内全波长扫描，扫描波长范围覆盖了紫外光和可见光范围，能够准确确定没食子酸的特征吸收波长。
进一步，步骤(3)中标准曲线拟合的具体步骤为：
(1)配制梯度浓度溶液：将100mg没食子酸放到20ml容量瓶中，用2ml乙醇溶解后定容至20ml；移取上述溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1ml和2ml到20ml容量瓶中，加水定容至20ml，得一系列梯度浓度溶液；各取上述梯度浓度溶液0.2ml、福林酚试剂1ml和14ml水放入20ml容量瓶中，均匀混合后在1～5min内加入3ml20wt％的碳酸钠溶液，混合均匀后定容；在25℃条件下放置1h；
(2)绘制标准曲线：各取上述配置好的梯度浓度溶液2ml于分光光度计的石英皿中，在715nm处，测这些梯度浓度溶液的吸光度；在坐标系中以吸光度为横坐标，质量浓度为纵坐标进行拟合，得标准曲线；所述标准曲线的方程为：y＝2.8758x+0.4960，标准曲线的回归系数为：r2＝0.9991。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：提前拟合好标准曲线，测定猕猴桃多酚含量时，得到上清液吸光度后，带入标准曲线即可得到相应的多酚质量浓度，省时省力。
进一步，步骤(1)中醇溶液为甲醇溶液。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：甲醇在实验室内比较常见，容易获取，而且对人员和环境友好，不会造成人员受伤和环境污染。另外，50％的甲醇溶液具有良好的浸提效果，多酚提取率可达30％以上。
进一步，步骤(1)中浸提温度为63℃。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：采用该温度，多酚不会分解和氧化，保证了后面多酚含量计算的准确度。而且在该温度西夏，多酚溶解度较大，便于多酚的浸提，多酚提取率在30％以上。
进一步，浸提时猕猴桃汁和醇溶液的体积为1:3。
采用上述进一步技术方案的有益效果是：猕猴桃汁和醇溶液的比例为1:3时，多酚提取率较高，在30％以上。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明提供了一种猕猴桃多酚含量测定方法，该测定方法包括浸提、测定吸光度数值、重复浸提、计算多酚当量、计算多酚含量等步骤。浸提过程是将一定量榨好的猕猴桃汁和体积分数为50％的醇溶液放于20ml容量瓶中，在61～64℃条件下浸提45min。醇溶液为甲醇或乙醇溶液。在体积分数为50％时，甲醇和乙醇的提取率分别为35％和28％，甲醇具有更高的提取率，因此本发明优先采用甲醇溶液进行浸提。在61～64℃的范围内，多酚不仅不会分解和氧化，还具有较大的溶解度，多酚在该温度范围内能够被快速、完全的提取出来，而且在63℃时多酚提取率最高。浸提时，为了实现最大提取率，猕猴桃汁与醇溶液的体积比设置为1:2～1:4，本发明中优先采用1:3的比例。浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值。特征吸收波长在测定猕猴桃多酚含量之前就已经被确定，特征吸收波长确定的具体方法是：取1ml没食子酸标准溶液、1ml福林酚试剂和14ml水放入20ml容量瓶内，均匀混合后在1～5min内加入3ml20wt％的碳酸钠溶液，混合均匀后定容；在25～30℃条件下放置1h，用分光光度计在200～800nm之间进行全波长扫描，测定最大吸收时的波长。测出的最大吸收波长即为没食子酸特征吸收波长，在扫描过程中发现在715nm处有最大吸收值，则，特征吸收波长为715nm。测出上清液的吸光度后，将上清液与50％的醇溶液混合，在61～64℃条件下浸提45min后，取浸提液10ml，在5000r/min条件下离线15min，取上层清液测其吸光度；重复上诉步骤4次，将浸提液中的多酚完全提取出来。将总共5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程y＝2.8758x+0.4960中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量；所述标准曲线中y代表多酚质量浓度，x代表吸光度数值。多酚含量的计算公式为：w＝c×v/m；其中，w为多酚的含量，c为没食子酸当量，即依据标准曲线计算出的多酚含量，v为浸提液的体积，m为取液量；将5次测得的多酚含量相加即得总多酚含量。标准曲线的拟合步骤为：(1)配制梯度浓度溶液：将100mg没食子酸放到20ml容量瓶中，用2ml乙醇溶解后定容至20ml；移取上述溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1ml和2ml到20ml容量瓶中，加水定容至20ml，得一系列梯度浓度溶液；各取上述梯度浓度溶液0.2ml、福林酚试剂1ml和14ml水放入20ml容量瓶中，均匀混合后在1～5min内加入3ml20wt％的碳酸钠溶液，混合均匀后定容；在25℃条件下放置1h；(2)绘制标准曲线：各取上述配置好的梯度浓度溶液2ml于分光光度计的石英皿中，在715nm处，测这些梯度浓度溶液的吸光度；在坐标系中以吸光度为横坐标，质量浓度为纵坐标进行拟合，得标准曲线；所述标准曲线的方程为：y＝2.8758x+0.4960，标准曲线的回归系数为：r2＝0.9991。
下面的实施例只是用于详细说明本发明，并不以任何方式限制发明的范围。
(1)实施例一：
将5ml猕猴桃果汁和15ml体积分数为50％的甲醇溶液放入20ml容量瓶中，在63℃条件下浸提45min。浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值。重复浸提和离心步骤4次，每次离心后取上层清液测其吸光度数值。将总共5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量，再通过公式w＝c×v/m计算出每次浸提后多酚含量，将5次含量相加即的猕猴桃多酚总含量。
(2)实施例二：
将5ml猕猴桃果汁和15ml体积分数为50％的乙醇溶液放入20ml容量瓶中，在63℃条件下浸提45min。浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值。重复浸提和离心步骤4次，每次离心后取上层清液测其吸光度数值。将总共5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量，再通过公式w＝c×v/m计算出每次浸提后多酚含量，将5次含量相加即的猕猴桃多酚总含量。
(3)实施例三：
将5ml猕猴桃果汁和20ml体积分数为50％的甲醇溶液放入20ml容量瓶中，在63℃条件下浸提45min。浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值。重复浸提和离心步骤4次，每次离心后取上层清液测其吸光度数值。将总共5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量，再通过公式w＝c×v/m计算出每次浸提后多酚含量，将5次含量相加即的猕猴桃多酚总含量。
(4)实施例四：
将5ml猕猴桃果汁和15ml体积分数为50％的甲醇溶液放入20ml容量瓶中，在61℃条件下浸提45min。浸提完成后，取10ml浸提液，在5000r/min的条件下离心15min；离心完成后，取上层清液，在特征吸收波长715nm处测其吸光度数值。重复浸提和离心步骤4次，每次离心后取上层清液测其吸光度数值。将总共5次测得的吸光度数值带入预先拟合出的标准曲线方程中，计算出没食子酸当量值，即多酚含量，再通过公式w＝c×v/m计算出每次浸提后多酚含量，将5次含量相加即的猕猴桃多酚总含量。
结果分析：
从表中可以看出，实施例一中提取率最大，提取出的多酚最多。因此猕猴桃多酚含量最佳测定条件为：猕猴桃汁与醇溶液的料液比为1:3、醇溶液为甲醇、浸提温度为63℃。而且从表中可以看出，实施例三与实施例一结果差别最小，实施例二与施例一结果差别最大，实施例二、三、四与实施例的区别分别为：醇溶液种类不同、料液比不用、浸提温度不同，因此可以判断醇溶液种类、料液比不用和浸提温度对浸提结果影响程度依次为：醇溶液种类＞浸提温度＞料液比。